一种促进肠道益生菌增殖的唾液酸化浒苔寡糖制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于保健品技术领域，具体涉及一种促进肠道益生菌增殖的唾液酸化浒苔寡糖及其制备方法。
【背景技术】
[0002]人类肠道中存在巨量不同类型的细菌，肠道内菌群的稳定对于保持人类机体健康是必不可少的。益生菌是通过改善肠道微生物平衡从而对宿主施加有益影响的作用，包括抑制病原菌的生长，繁殖改善肠道菌群结构，增强机体免疫功能，以及降低胆固醇和改善血脂等。大多数益生菌来自双歧杆菌属和乳杆菌属，益生菌数量的减少可引起整个肠道菌群失调和肠道微生态失衡，从而导致许多代谢性疾病的发生。
[0003]唾液酸化寡糖能促进益生菌在肠道上皮定殖、增殖，具有显著抑制病原菌黏附、维持婴儿肠道菌群平衡、参加机体免疫等功能。唾液酸化寡糖的合成以核苷糖为糖基供体，乳糖或乙酰乳糖为受体，在唾液酸转移酶的催化条件下完成。唾液酸糖基转移酶以胞苷一磷酸-a-N-乙酰神经氨酸为底物将唾液酸残基转移至新的糖基受体上形成唾液酸糖苷化合物。浒苔是重要的经济海藻，在降低胆固醇、降血糖、提高人体免疫力以及抗衰老等方面都有潜在的应用价值。目前，在唾液酸化浒苔寡糖与促进肠道益生菌的研究方面未见到相关专利和报道，本发明制备的唾液酸化浒苔寡糖对肠道益生菌增殖有明显促进作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种促进肠道益生菌增殖的唾液酸化浒苔寡糖制备方法。工艺路线简单，是一种制备功能性寡糖的有效方法，极大提升了绿藻浒苔资源的经济附加值。经验证，该唾液酸化浒苔寡糖对肠道益生菌嗜酸乳杆菌和双歧杆菌增殖有明显增殖作用。本发明糖基化浒苔寡糖可应用于益生菌制剂药物或保健品的制备，所要解决的技术问题是提供一种效果好且利用度高的改善肠道菌群的寡糖。
[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
(1)将浒苔干燥后超微粉碎过80-100目筛得干粉末，向浒苔干粉末中加入60-80%乙醇回流提取1-2 h，干粉重量与乙醇体积比(g/mL)为1:20-30，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干，粉碎得到干燥脱脂的浒苔粉末；
(2)向步骤(I)制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比(g/mL)为l:20-25，60-70°C萃取温度下450-600 W微波辅助提取2_3 min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，抽滤，滤液减压浓缩至原体积的3-8%，真空冷冻干燥后粉碎；
(3)向步骤(2)所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为(g/mL)l:10-20，进行揽摔复溶，用Sevag法、二氣二氯乙烧法、二氯乙酸法中一种或几种除蛋白5_8次；
(4)将步骤(3)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步经过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比(g/mL)l:30-50去除色素，将活性炭与洗脱液于摇床中60-80 r/min振荡l-2h，6000-8000rpm离心20-30 min，收集上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液旋蒸浓缩至原体积的3-8%，按体积比1:3-4加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入4-10°C条件下静置24 h，6000-8000rpm离心20-30 min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔寡糖的固体粉末；
(6)将步骤(5)中浒苔寡糖，按干粉重量mg与蒸馏水mL体积比为1:5-10溶解，溶液采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在37-40°C及转速为60-80 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10-1/5;浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未唾液酸化消1笞寡糖精制品；
(7)步骤(6)得到的浒苔寡糖精制品按质量与体积比(mg/mL)1:0.5-1.0溶解于蒸馏水中，将商品化唾液酸转移酶加入到反应体系中进行生物反应，唾液酸转移酶用量mg与反应体系按质量与体积mL比1:3-5，反应体系中浒苔寡糖与胞苷一磷酸-a-N-乙酰神经氨酸浓度比(mM) 1:1.0-1.5 ,MgCl2终浓度为 15-20 mM，pH6.5-8.0，置于35-40°C温度，80_100rmp摇床条件下反应24-36h。
[0006](8)将步骤(7)反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，6000_8000rpm离心20-30 min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到唾液酸化浒苔功能性寡糖粗品。
[0007](9)将步骤(8)所得粗品溶解后过B1-Gel P_2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3，5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分。
[0008](10)将步骤(9)中收集的浒苔寡糖组分溶液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到唾液酸化浒苔寡糖。
[0009]所述的唾液酸化浒苔寡糖在制备改善肠道菌群的药品或保健品上的应用。
[0010]本发明的优点在于:本发明以制备的浒苔寡糖为原料，利用唾液酸转移酶生物反应制备出具有促进肠道益生菌增殖的唾液酸化浒苔寡糖，尚未见到唾液酸化浒苔寡糖促进肠道益生菌增殖的报道。本发明有效合理的综合利用浒苔资源，提高其商品价值与经济附加值，对提升海洋资源效益具有重要的现实意义。
【附图说明】
[0011 ] 图1唾液酸化寡糖对嗜酸乳杆菌LactobaciIIus acidophilus增殖影响。
[0012]图2唾液酸化寡糖对婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis增殖影响。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
(1)将浒苔干燥后超微粉碎过80目筛得干粉末，向浒苔干粉末中加入60%乙醇回流提取lh，干粉重量与乙醇体积比为1:20，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干，粉碎得到干燥脱脂的浒苔粉末；
(2)向步骤(I)制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比为1:20，60 °C萃取温度下450W微波辅助提取2 min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，抽滤，滤液减压浓缩至原体积的3%，真空冷冻干燥后粉碎； (3)向步骤(2)所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为1:10，进行搅拌复溶，用Sevag法除蛋白5次；
(4)将步骤(3)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步经过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比1:30去除色素，将活性炭与洗脱液于摇床中60 r/min振荡I h，6000rpm离心20 min，收集上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液旋蒸浓缩至原体积的3%，按体积比1:3加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入4°C条件下静置24 h，6000rpm离心20min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔寡糖的固体粉末；
(6)将步骤(5)中浒苔寡糖，按干粉重量mg与蒸馏水mL体积比为1:5溶解，溶液采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在37 °C及转速为60 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10;浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未唾液酸化浒苔寡糖精制品；
(7)步骤(6)得到的浒苔寡糖精制品按质量与体积比1:0.5溶解于蒸馏水中，将唾液酸转移酶加入到反应体系中进行生物反应，唾液酸转移酶用量mg与反应体系按质量与体积mL比1:3，，反应体系中浒苔寡糖与胞苷一磷酸-a-N-乙酰神经氨酸质量浓度比1: 1.0，MgCl2终浓度为15mM，pH6.5-8.0，置于35 °C温度，80rmp摇床条件下反应24h ；
(8)将步骤(7)反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，6000rpm离心20 min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到唾液酸化浒苔功能性寡糖粗品；
(9)将步骤(8)所得粗品溶解后过B1-GelP_2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3，5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分；
(10)将步骤(9)中收集的浒苔寡糖组分溶液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到唾液酸化浒苔寡糖。
[0014]实施例2
(1)将浒苔干燥后超微粉碎过100目筛得干粉末，向浒苔干粉末中加入80%乙醇回流提取2 h，干粉重量与乙醇体积比为1: 30，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干，粉碎得到干燥脱脂的浒苔粉末；
(2)向步骤(I)制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比为1:25，70°C萃取温度下600 W微波辅助提取3 min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行3次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，抽滤，滤液减压浓缩至原体积的8%，真空冷冻干燥后粉碎；
(3 )向步骤(2)所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为1: 20，进行搅拌复溶，用三氟三氯乙烷法除蛋白7次；
(4)将步骤(3)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步经过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比1:50去除色素，将活性炭与洗脱液于摇床中70 r/min振荡1.5h，7000rpm离心25 min，收集上清液；
(5)将步骤(4)得到的提上清液旋蒸浓缩至原体积的8%，按体积比1:4加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入10°C条件下静置24 h，8000rpm离心30 min，取上清液减