压浓缩、冷冻干燥得浒苔寡糖的固体粉末；
(6 )将步骤(5 )中浒苔寡糖，按干粉重量mg与蒸馏水mL体积比为1:1O溶解，溶液采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在40°(:及转速为80 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/5;浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未唾液酸化浒苔寡糖精制品；
(7)步骤(6)得到的浒苔寡糖精制品按质量与体积比1:1.0溶解于蒸馏水中，将唾液酸转移酶加入到反应体系中进行生物反应，唾液酸转移酶用量mg与反应体系按质量与体积mL比1: 4，，反应体系中浒苔寡糖与胞苷一磷酸-a-N-乙酰神经氨酸质量浓度比1: 1.5,MgCl2质量终浓度为20 11^，？!18.0，置于40°(:温度，10rmp摇床条件下反应36h;
(8)将步骤(7)反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，8000rpm离心30 min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到唾液酸化浒苔功能性寡糖粗品；
(9)将步骤(8)所得粗品溶解后过B1-GelP_2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3，5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分；
(10)将步骤(9)中收集的浒苔寡糖组分溶液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到唾液酸化浒苔寡糖。
[0015]实施例3
(1)将浒苔干燥后超微粉碎过90目筛得干粉末，向浒苔干粉末中加入70%乙醇回流提取1.5h，干粉重量与乙醇体积比为1:25，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干，粉碎得到干燥脱脂的浒苔粉末；
(2)向步骤(I)制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量与蒸馏水体积比为1:23，65°C萃取温度下500 W微波辅助提取3 min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行3次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，抽滤，滤液减压浓缩至原体积的5%，真空冷冻干燥后粉碎；
(3)向步骤(2)所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量与蒸馏水体积比为1:15，进行搅拌复溶，用三氯乙酸法除蛋白8次；
(4)将步骤(3)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步经过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量与洗脱液按重量体积比I: 40去除色素，将活性炭与洗脱液于摇床中80 r/min振荡2h，8000rpm离心30 min，收集上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液旋蒸浓缩至原体积的5%，按体积比1:3加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入6°C条件下静置24 h，7000rpm离心25 min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔寡糖的固体粉末；
(6)将步骤(5)中浒苔寡糖，按干粉重量mg与蒸馏水mL体积比为1:7溶解，溶液采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在38°(:及转速为70 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/5;浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未唾液酸化浒苔寡糖精制品；
(7)步骤(6)得到的浒苔寡糖精制品按质量与体积比1:0.7溶解于蒸馏水中，将唾液酸转移酶加入到反应体系中进行生物反应，唾液酸转移酶用量mg与反应体系按质量与体积mL比1: 5，反应体系中浒苔寡糖与胞苷一磷酸-a-N-乙酰神经氨酸质量浓度比1: 1.2，MgCl2质量终浓度为17 mM，pH7.5，置于40 °C温度，90rmp摇床条件下反应30h;
(8)将步骤(7)反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，7000rpm离心25 min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到唾液酸化浒苔功能性寡糖粗品； (9)将步骤(8)所得粗品溶解后过B1-GelP_2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3，5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分；
(10)将步骤(9)中收集的浒苔寡糖组分溶液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到唾液酸化浒苔寡糖。
[0016]实验例一:唾液酸化寡糖对益生菌嗜酸乳杆菌增殖试验
将嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus接种至商品化MRS培养基中(MRS培养基配方:蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，梓檬酸氢二钱2 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 I mL/L，乙酸钠5 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，硫酸镁0.6 g/L，硫酸锰0.25 g/L，pH 6.4土
0.2)，同时唾液酸化寡糖替换葡萄糖作为受试样品组，置于厌氧培养箱37°C培养84 h，每隔12h测定培养液0D600值以监测乳酸杆菌增殖情况。由图1可见，唾液酸化寡糖能显著提高肠道益生菌乳酸杆菌数量。
[0017]实验例二:唾液酸化寡糖对益生菌双歧杆菌增殖试验
将婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis接种至商品化BBL培养基中(BBL培养基配方:蛋白胨15g/L，酵母膏粉2g/L，葡萄糖20g/L，可溶性淀粉0.5g/L，氯化钠5g/L，半胱氨酸0.5g/L，吐温-80 lmL/L，肝粉0.3g/L，琼脂15g/L，pH6.8±0.2)，同时唾液酸化寡糖替换葡萄糖作为受试样品组，置于厌氧培养箱37°C培养84 h，每隔12 h测定培养液0D600值以监测双歧杆菌增殖情况。由图2可见，唾液酸化寡糖能显著提高肠道益生菌双歧杆菌数量。
[0018]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种促进肠道益生菌增殖的唾液酸化浒苔寡糖制备方法，其特征在于:所述方法包括如下步骤: (1)将浒苔干燥后超微粉碎过80-1OO目筛得干粉末，向浒苔干粉末中加入60-80%乙醇回流提取1-2 h，干粉重量g与乙醇体积mL比为1:20-30，回流结束后回收去除乙醇循环使用，烘干，粉碎得到干燥脱脂的浒苔粉末； (2)向步骤(I)制得的脱脂浒苔粉末中加入蒸馏水，其中浒苔质量g与蒸馏水mL体积比为1:20-25，60-70°C萃取温度下450-600 W微波辅助提取2_3 min，提取结束后，进行过滤，将滤渣重复上述步骤进行2-3次提取，将获得的滤液混合后进行浓缩，抽滤，滤液减压浓缩至原体积的3-8%，真空冷冻干燥后粉碎； (3)向步骤(2)所得粉末中加入蒸馏水，其中粉末质量g与蒸馏水mL体积比为1:10-20，进行搅拌复溶，用Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法中一种或几种除蛋白5-8次； (4)将步骤(3)所得到的溶液，通过HPD-826大孔吸附树脂填充柱，洗脱液进一步经过非极性吸附剂活性炭，活性炭使用量g与洗脱液mL按重量体积比1:30-50去除色素，将活性炭与洗脱液于摇床中60-80 r/min振荡l-2h，6000-8000rpm离心20-30 min，收集上清液； (5)将步骤(4)得到的提上清液旋蒸浓缩至原体积的3-8%，按体积比1:3-4加入质量浓度为95%的乙醇，搅拌后放入4-10°C条件下静置24 h，6000-8000rpm离心20-30 min，取上清液减压浓缩、冷冻干燥得浒苔寡糖的固体粉末； (6 )将步骤(5 )中浒苔寡糖，按干粉重量mg与蒸馏水mL体积比为1: 5-10溶解，溶液采用截留分子量2000D透析袋处理，收集透析液，在37-40°C及转速为60-80 r/min条件下旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10-1/5;浓缩液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到未唾液酸化消1笞寡糖精制品； (7)步骤(6)得到的浒苔寡糖精制品按质量mg与体积mL比1:0.5-1.0溶解于蒸馏水中，将唾液酸转移酶加入到反应体系中进行生物反应，唾液酸转移酶用量mg与反应体系按质量与体积mL比1: 3-5，反应体系中浒苔寡糖与胞苷一磷酸-a-N-乙酰神经氨酸质量浓度比1:1.0-1.5 ,MgCl2质量终浓度为 15-20 mM，pH6.5-8.0，置于35-40°C温度，80_100rmp摇床条件下反应24-36h; (8)将步骤(7)反应体系按体积比1:1添加95%乙醇，终止反应并沉淀蛋白，6000_8000rpm离心20-30 min去除沉淀，收集上清浓缩，真空冷冻干燥后得到唾液酸化浒苔功能性寡糖粗品； (9)将步骤(8)所得粗品溶解后过B1-GelP_2聚丙烯酰胺凝胶，蒸馏水洗脱，经3，5-二硝基水杨酸法测定收集寡糖组分； (10)将步骤(9)中收集的浒苔寡糖组分溶液采用截留分子量500D透析袋处理，将截留液冷冻干燥，制备得到唾液酸化浒苔寡糖。2.如权利要求1所述的制备方法制的的唾液酸化浒苔寡糖。3.如权利要求2所述的唾液酸化浒苔寡糖在制备改善肠道菌群的药品或保健品上的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种促进肠道益生菌增殖的唾液酸化浒苔寡糖制备方法。浒苔干燥后超微粉碎，利用乙醇回流提取工艺，得到干燥脱脂的浒苔粉末，经微波辅助提取、脱蛋白及去除多糖和色素后获得浒苔寡糖，再将唾液酸转移酶加入到含有浒苔寡糖的反应体系中，进行糖基化反应，制备得到所述的唾液酸化浒苔寡糖，该寡糖能显著提高肠道益生菌数量，可用于制备改善肠道菌群的药品或保健品。
【IPC分类】A23L33/125, C12P19/26, A61K31/7032, A01P1/00
【公开号】CN105603023
【申请号】CN201610110628
【发明人】赵超, 吴一晶, 刘斌, 李秋哲, 杨成凤, 陈玉青
【申请人】福建农林大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年2月29日