多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于食品配料和食品加工技术领域，特别涉及一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]多酚化合物是植物体内一类最重要的次生代谢产物，具有较强的抗氧化作用，以及明显的抑菌、抗癌、抗衰老和抑制胆固醇升高等功效。在食品加工及人体消化过程中，多酚能与多种化合物发生相互作用，其中蛋白质/多肽是最主要的有机化合物。
[0003]蛋白质/多肽与多酚相互作用会引起蛋白质/多肽结构的改变，进而导致其功能性质如溶解性、持水能力、黏度、凝胶作用、弹性、塑性和乳化性等的相应变化。多酚与蛋白质/多肽共价反应后，反应产物在很大程度上保持了多酚的化学性质，同时赋予蛋白质/多肽分子许多新的性能，明显拓宽了植物多酚和蛋白质/多肽的应用领域。
[0004]碳水化合物具有良好的增稠性和持水性，可通过美拉德反应引入蛋白质/多肽从而改善蛋白质/多肽的功能特性。一般来说，蛋白质/多肽因能在油水或气液界面上形成吸附层降低界面张力而多在胶体体系中作为乳化剂使用，碳水化合物则由于其良好的增稠性和持水性而常用做稳定剂。在食品体系中两种生物大分子共存时，显示出比各自单独使用时更好的性能。
[0005]美拉德反应可以使碳水化合物分子以共价键连接到蛋白质/多肽分子上，主要是将蛋白质/多肽分子的ε_氨基连接到碳水化合物分子的还原端。这种生物大分子复合物对于环境条件具有较高的适应性，而且蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物在胶体体系中具有乳化和稳定的双重作用。另外，生物大分子在共价结合条件下蛋白质/多肽分子构型趋于稳定，蛋白质/多肽变性程度以及聚集程度将会减轻。
[0006]在蛋白质/多肽和碳水化合物的美拉德反应过程中，将蛋白质/多肽-碳水化合物溶液混合后进行冷冻干燥，既保证了反应底物混合的均匀性，又增大了接触面积;温和的反应条件能保证美拉德反应进行到适当程度，从而确保蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物具有优越的乳化及热稳定等功能特性。
[0007]目前尚未见将多酚、蛋白质/多肽、碳水化合物制备三者共价复合物的报道。因此，发明一种既具有良好的抗氧化性和生物活性，又具有较高热稳定性和乳化性的多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物类生物大分子尤为重要。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供了一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法及其应用。
[0009]为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下:
[0010]—种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法，所述方法为:以多酚、蛋白质/多肽为原料，利用碱法诱导反应，制备多酚-蛋白质/多肽共价复合物;然后再以碳水化合物和制备的多酚-蛋白质/多肽共价复合物为原料，利用美拉德反应，制备多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物。
[0011]所述的一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法的具体步骤为:
[0012](I)将多酚化合物与蛋白质/多肽分别溶解于磷酸盐缓冲液中，形成多酚溶液与蛋白质/多肽溶液;在室温或50-60 V的水浴加热条件下，将多酚溶液与蛋白质/多肽溶液等体积混合，形成混合溶液，并调节混合溶液的PH值为8.0-10.0;然后向反应容器中缓慢通入氧气，反应24-48h，反应过程不断搅拌;采用超声透析法，除去未反应的游离多酚，最后将透析袋中剩余的混合溶液冷冻干燥，得到多酚-蛋白质/多肽共价复合物固体样品；
[0013](2)将碳水化合物和制备的多酚-蛋白质/多肽共价复合物溶于磷酸盐缓冲液中，形成混合溶液，冷冻干燥;将干燥后的样品磨细，过筛后，进行美拉德反应，反应结束后采用超声透析法除去未反应的碳水化合物，得到多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物。
[0014]所述的多酚为:茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、没食子酸、单宁、槲皮素、阿魏酸或姜黄素。
[0015]所述的蛋白质/多肽为:乳蛋白、血清蛋白、卵蛋白、鱼糜蛋白、明胶、胶原蛋白、大豆蛋白、花生蛋白、乳清蛋白肽、大豆肽、玉米肽、小麦肽、胶原肽或谷胱甘肽;所述的乳蛋白为α-乳白蛋白、β_乳球蛋白、乳铁蛋白或酪蛋白。
[0016]所述的碳水化合物为葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、聚葡萄糖、燕麦β-葡聚糖、菊粉或麦芽糊精。
[0017]所述多酚化合物的用量为0.5g/L-50g/L，蛋白质/多肽的用量为10g/L-200g/L，碳水化合物的用量为10g/L-200g/L。
[0018]所述美拉德反应的条件为:反应在固相中进行，反应的相对湿度为79%，温度为50-100 °C，pH值为4-11，反应时间为18h-24h。
[0019]所述超声透析法的方式为:将透析袋固定于装有去离子水的透析容器内，在20-106KHz的超声频率下，透析24-72h，每隔3-6h换一次去离子水。
[0020]所述的一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法制备的多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物。
[0021]所述的多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物在制备β_胡萝卜素乳状液中的应用。
[0022]所述应用采取的方式为:将多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物溶解于水中，形成浓度为5g/L-50g/L的水相;将β-胡萝卜素溶解于植物油中，形成浓度为0.5g/L-10g/L的油相;然后将水相与油相按(20:1)-(10:1)的体积比混合后，在8000-1200(^/1^11的条件下剪切乳化6-10min，再进行高压均质，得到β-胡萝卜素乳状液。
[0023]所述的高压均质方式为:在温度为45-75°C的条件下，采用二级加压，均质1-5次；其中，一级均质压力为30-60Mpa，二级均质压力为3_6Mpa。
[0024]本发明的有益效果为:所述制备方法使用天然来源的多酚化合物、蛋白质/多肽和碳水化合物，不使用任何有机试剂，通过两个步骤即可获得性能良好的多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物，制备方法简单、高效、安全，易于生产。所得产品具有较高的抗氧化性和乳化性，利用多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物稳定的β-胡萝卜素乳状液具有良好的理化稳定性。
【附图说明】
[0025]图1为制备多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的流程示意图。
[0026]图2为乳铁蛋白、绿原酸-乳铁蛋白共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物累积分子量分布图。
[0027]图3为乳铁蛋白、绿原酸、绿原酸-乳铁蛋白共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖非共价复合物和绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖非共价复合物的铁还原力图；其中CA:绿原酸;LF:乳铁蛋白；CA-LF con:绿原酸-乳铁蛋白共价复合物;CA-LF-Glu con:绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖共价复合物;CA-LF-Glu mix:绿原酸-乳铁蛋白_葡萄糖非共价复合物;CA-LF-PD con:绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物;CA-LF-PD mix:绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖非共价复合物。
[0028]图4为分别采用乳铁蛋白、绿原酸、绿原酸-乳铁蛋白共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物、绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖非共价复合物和绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖非共价复合物制备的胡萝卜素乳状液的粒径分布图；其中CA:绿原酸;LF:乳铁蛋白；CA-LF con:绿原酸-乳铁蛋白共价复合物;CA-LF-Glu con:绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖共价复合物;CA-LF-Glu mix:绿原酸-乳铁蛋白-葡萄糖非共价复合物;CA-LF-PD con:绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖共价复合物;CA-LF-PD mix:绿原酸-乳铁蛋白-聚葡萄糖非共价复合物。
【具体实施方式】
[0029]本发明公开了一种多酚-蛋白质/多肽-碳水化合物共价复合物的制备方法及其应用，所述制备方法的流程图如图1所示。下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但不应理解为对本发明的限制。所述原料如无特殊说明，均为能从商业途径获得的产品。所述测试方法均为常规方法。
[0030]实施例1:表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)-a-乳白蛋白-葡萄糖共价复合物的制备
[0031 ]将EGCG(4g/L)与α-乳白蛋白(16g/L)溶解于ρΗ8.0的磷酸盐缓冲液中，形成EGCG溶液与α-乳白蛋白溶液;在50 0C的水浴条件下，将EGCG溶液与α-乳白蛋白溶液等体积混合，形成混合溶液，并调节混合溶液的PH值为8.0;然后向反应容器中缓慢通入氧气(I毫升/分钟)，反应24-48h，反应过程不断搅拌，使EGCG氧化成醌类化合物并与α-乳白蛋白的侧链氨基酸基团反应生成EGCG-α-乳白蛋白共价复合物;将反应后的混合溶液置于透析袋(截留分子量3500kDa)中，然后将透析袋固定于装有去离子水的透析容器内，在50KHz的超声频率下，透析24h，每隔3h换一次去离子水，以确保未反应的游离EGCG完全透析出去，最后将透析袋中的剩余的混合物冷冻干燥，得到EGCG-α-乳白蛋白共价复合物固体样品；
[0032]将葡萄糖和制备的EGCG-α-乳白蛋白共价复合物按1: 2的质量比溶于pH 7.0磷酸盐缓冲液中，形成混合溶液，冷冻干燥；将干燥后的样品磨细，过200目筛，在相对湿度为79%，温度为60°C，pH值为7的条件下，固相反应24h;反应结束后将共价复合物置于透析袋(截留分子量3500kD