一种治疗细菌性结膜炎的dc细胞蛋白滴眼液及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]细菌性结膜炎是一种由细菌感染引起的临床常见的眼科疾病之一，俗称“红眼”或“火眼”。其临床常见症状为结膜充血、结膜囊脓性、粘液性或黏脓性分泌物，也是定性和病变程度的诊断依据。常见的致病细菌有科一韦杆菌、肺炎双球菌、流行性感冒杆菌、金黄色葡萄球菌等，一般多在春夏暖和季节流行，但由肺炎双球菌引起者多见于冬季。
[0003]该病具有一定的自限性，病程通常在两周之内。虽然该病的诊断和治疗不难，但是，若治疗不及时或方法不当，容易转为慢性结膜炎，对患者的损伤较大。临床上通常使用抗生素滴眼液进行治疗，虽然可以收到显著的效果，但复发率相对较高，而且临床上有普遍滥用抗生素的问题，从而导致耐药菌株不断增多，故开发一种敏感有效的药物来治疗细菌性结膜炎是当务之急。
[0004]DC细胞是一种重要的淋巴细胞，在机体抗病毒自然免疫中发挥着重要作用，故将DC细胞应用于细菌性结膜炎的治疗无疑具有重大意义。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液，含有DC细胞分泌的蛋白浓缩物，不仅预防及治疗细菌性结膜炎的效果显著、不易复发，能够大大减轻患者的痛苦，而且能够替代现有技术中普遍使用的抗生素滴眼液，减少了普遍滥用抗生素的问题。
[0006]本发明的另一目的是提供一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法。
[0007]本发明的再一目的是提供一种DC细胞蛋白滴眼液用于治疗细菌性结膜炎的用途。
[0008]本发明通过以下技术方案实现该目的:
[0009]一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液，由DC细胞分泌的蛋白的浓缩液和生理盐水组成。
[0010]进一步的，所述生理盐水中含有I?5%的人血白蛋白和0.01?0.05%的氢化可的松溶液。
[0011 ]作为优选的，所述DC细胞分泌的蛋白的浓缩液与生理盐水的体积比为1: 2。
[0012]一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤:
[0013]I)采集患者自身外周血50mL，离心后收集血浆；
[0014]2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离心管中，300?500g离心10_20min，血细胞与生理盐水的体积比为1:2?2:1 ；
[0015]3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入15?25mL的RPMI 1640培养基重悬细胞，300?500g离心10-20min ；
[0016]4)分别采用抗CD 14抗体和抗CD86的抗体磁珠分选出单核细胞和DC细胞；
[0017]5)向分选出的单核细胞和DC细胞中加入X-VIVO 15培养基进行培养，细胞密度为5?10\105/1^;同时向培养基中加入100-10001]/11^的11^-4和100-10001]/11^的61-05?，每日观察DC细胞的形态；
[0018]6)分别在培养的第6天和第8天向培养基中添加50_500U/mL的TNF-α以促进DC细胞的成熟；
[0019]7)培养10天后收集DC细胞和培养上清，将DC细胞进行裂解；
[0020]8)将裂解后的DC细胞内容物和培养上清中的蛋白浓缩70?90倍，将浓缩液稀释在含有I?5%的人血白蛋白(HSA)和0.01?0.05%的氢化可的松溶液的生理盐水溶液中，浓缩液与生理盐水的体积比为I: 2，制得DC细胞蛋白滴眼液。
[0021]作为优选的，在培养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO15培养基、IL-4 和 GM-CSF。
[0022 ]其中，在培养1天后，抽取I X 16的细胞进行DC细胞的流式检测。
[0023]一种DC细胞蛋白滴眼液用于治疗细菌性结膜炎的用途。
[0024]相对于现有技术，本发明的有益效果为:本发明的治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液，含有DC细胞分泌的蛋白浓缩物，不仅预防及治疗细菌性结膜炎的效果显著、不易复发，能够大大减轻患者的痛苦，而且能够替代现有技术中普遍使用的抗生素滴眼液，减少了普遍滥用抗生素的问题，制备方法首先对DC细胞进行扩增培养，然后再收集DC细胞分泌的蛋白，将蛋白进行浓缩后与生理盐水复配制得DC细胞蛋白滴眼液，制备方法简单、成本低，本发明的滴眼液在治疗细菌性结膜炎的应用中具有显著的效果，且不易复发。
【附图说明】
[0025]图1为实施例1中培养第2天的DC细胞形态图。
[0026]图2为实施例1中培养第7天的DC细胞形态图。
[0027]图3为实施例1中的DC细胞流式检测结果图。
【具体实施方式】
[0028]以下结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。
[0029]实施例1。
[0030]本实施例提供一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤:
[0031]I)采集患者自身外周血50mL，离心后收集血浆；
[0032]2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离心管中，300g离心1min，血细胞与生理盐水的体积比为1:2;
[0033]3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入15mL的RPMI 1640培养基重悬细胞，300g离心1min;
[0034]4)分别采用抗⑶14抗体和抗⑶86的抗体磁珠分选出单核细胞和DC细胞；
[0035]5)向分选出的单核细胞和DC细胞中加入X-VIVO 15培养基进行培养，细胞密度为5X 10VmL;同时向培养基中加入100U/mL的IL-4和100U/mL的GM-CSF，每日观察DC细胞的形态，其中培养第2天和第7天的DC细胞形态分别如图1、图2所示；
[0036]6)分别在培养的第6天和第8天向培养基中添加50U/mL的TNF-α以促进DC细胞的成熟；
[0037]7)培养10天后收集DC细胞和培养上清，将DC细胞进行裂解；
[0038]8)将裂解后的DC细胞内容物和培养上清中的蛋白浓缩70倍，将浓缩液稀释在含有I %的人血白蛋白(HSA)和0.01%的氢化可的松溶液的生理盐水溶液中，浓缩液与生理盐水的体积比为I: 2，制得DC细胞蛋白滴眼液。
[0039]作为优选的，在培养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO15培养基、IL-4 和 GM-CSF。
[0040]其中，在培养10天后，抽取IX 16的细胞进行DC细胞的流式检测，流式检测结果如图3所示。
[0041 ] 实施例2。
[0042]本实施例提供一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤:
[0043]I)采集患者自身外周血50mL，离心后收集血浆；
[0044]2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离心管中，400g离心15min，血细胞与生理盐水的体积比为1:1 ；
[0045]3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入20mL的RPMI 1640培养基重悬细胞，400g离心15min;
[0046]4)分别采用抗⑶14抗体和抗⑶86的抗体磁珠分选出单核细胞和DC细胞；
[0047]5)向分选出的单核细胞和DC细胞中加入X-VIVO 15培养基进行培养，细胞密度为8X 10VmL;同时向培养基中加入500U/mL的IL-4和500U/mL的GM-CSF，每日观察DC细胞的形态；
[0048]6)分别在培养的第6天和第8天向培养基中添加300U/mL的TNF-α以促进DC细胞的成熟；
[0049]7)培养10天后收集DC细胞和培养上清，将DC细胞进行裂解；
[0050]8)将裂解后的DC细胞内容物和培养上清中的蛋白浓缩80倍，将浓缩液稀释在含有3%的人血