白蛋白(HSA)和0.03%的氢化可的松溶液的生理盐水溶液中，浓缩液与生理盐水的体积比为I: 2，制得DC细胞蛋白滴眼液。
[0051]作为优选的，在培养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO15培养基、IL-4 和 GM-CSF。
[0052]其中，在培养10天后，抽取IX 16的细胞进行DC细胞的流式检测。
[0053]实施例3。
[0054]本实施例提供一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤:
[0055]I)采集患者自身外周血50mL，离心后收集血浆；
[0056]2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离心管中，500g离心20min，血细胞与生理盐水的体积比为2:1 ；
[0057]3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入25mL的RPMI 1640培养基重悬细胞，500g离心20min ；
[0058]4)分别采用抗⑶14抗体和抗⑶86的抗体磁珠分选出单核细胞和DC细胞；
[0059]5)向分选出的单核细胞和DC细胞中加入X-VIVO 15培养基进行培养，细胞密度为10\105/1^;同时向培养基中加入10001]/11^的11^-4和10001]/11^的61-03卩，每日观察0(:细胞的形态；
[0060]6)分别在培养的第6天和第8天向培养基中添加500U/mL的TNF-α以促进DC细胞的成熟；
[0061 ] 7)培养10天后收集DC细胞和培养上清，将DC细胞进行裂解；
[0062]8)将裂解后的DC细胞内容物和培养上清中的蛋白浓缩90倍，将浓缩液稀释在含有5%的人血白蛋白(HSA)和0.05%的氢化可的松溶液的生理盐水溶液中，浓缩液与生理盐水的体积比为I: 2，制得DC细胞蛋白滴眼液。
[0063]作为优选的，在培养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO15培养基、IL-4 和 GM-CSF。
[0064]其中，在培养10天后，抽取IX 16的细胞进行DC细胞的流式检测。
[0065]实施例4、DC细胞蛋白滴眼液治疗细菌性结膜炎的临床效果观察实验
[0066]1、基本资料:
[0067]2015年3月?2015年4月在中山大学眼科医院诊断为细菌性结膜炎的患者30例50目艮，其中男10例18眼，女20例32眼，年龄25-45岁。
[0068]2、症状体征:
[0069 ]刺痛、痒感、分泌物、流泪、眼睛红肿、睑结膜充血。
[0070]3、根据上述症状体征，按照不同程度分为4级:
[0071 ]无、轻度、中度和重度，并依次定位为O分、I分、2分和3分。
[0072]4、实验方法:
[0073]随机分为实验组、对照组各15例。实验组使用DC细胞蛋白滴眼液，对照组使用
0.5%病毒唑滴眼液(上海集成制药厂)，均6次/天，I滴/次，连续治疗10天。分别在用药后7天、14天进行复查，复查项目包括刺痛、痒感、分泌物、流泪、眼睛红肿、睑结膜充血等项目，所有患者复查时均询问用药时是否有刺激感、异物感和眼痒等不适症状。
[0074]5、疗效评价标准:
[0075]按照痊愈、显效、有效和无效四级评定。以治疗前后总分值的下降来判断单个患者的疗效，症状体征积分的下降值=治疗前积分-治疗后积分。
[0076](I)痊愈:第1、第2次复查时症状体征全消失(总分为O);
[0077](2)显效:积分减少2 85%且< 100% ;
[0078](3)有效:积分减少2 5O%且<85% ;
[0079](4)无效:积分减少<50%，或症状体征加重。
[0080]总有效率=(痊愈病例数+显效病例数)/可供评价疗效病例数。
[0081 ] 6、实验结果:
[0082]实验组治愈18眼，显效2眼，有效5眼，总有效率为80.0%(20/25)，对照组治愈17目艮，显效I眼，有效4眼，无效3眼，总有效率为72.0% (18/25)，两组有统计学意义。
[0083]7、结论:
[0084]相对于使用0.5%病毒唑滴眼液治疗细菌性结膜炎，本发明的DC细胞蛋白滴眼液治疗细菌性结膜炎具有更高的有效率，不仅预防及治疗细菌性结膜炎的效果显著、不易复发，能够大大减轻患者的痛苦，而且能够替代现有技术中普遍使用的抗生素滴眼液，减少了普遍滥用抗生素的问题。
[0085]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1.一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液，由DC细胞分泌的蛋白的浓缩液和生理盐水组成。2.如权利要求1所述的治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液，所述生理盐水中含有I?5 %的人血白蛋白和0.0l?0.05 %的氢化可的松溶液。3.如权利要求1所述的治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液，所述DC细胞分泌的蛋白的浓缩液与生理盐水的体积比为1: 2。4.一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，包括以下步骤: 1)采集患者自身外周血50mL，离心后收集血浆； 2)将下层血细胞用生理盐水进行稀释，再将稀释液加入已有Ficoll分离液的sepmate离心管中，300?500g离心10-20min，血细胞与生理盐水的体积比为1:2?2:1 ； 3)将步骤2)中离心后的上层液体从离心管中倒出，再加入15?25mL的RPMI1640培养基重悬细胞，300?500g离心10-20min ； 4)分别采用抗CD14抗体和抗CD86的抗体磁珠分选出单核细胞和DC细胞； 5)向分选出的单核细胞和DC细胞中加入X-VIVO15培养基进行培养，细胞密度为5?10父105/1111^同时向培养基中加入100-10001]/11^的11^-4和100-10001]/11^的61-05?，每日观察DC细胞的形态； 6)分别在培养的第6天和第8天向培养基中添加50-500U/mL的TNF-α以促进DC细胞的成熟； 7)培养10天后收集DC细胞和培养上清，将DC细胞进行裂解； 8)将裂解后的DC细胞内容物和培养上清中的蛋白浓缩70?90倍，将浓缩液稀释在含有I?5 %的人血白蛋白(HSA)和0.01?0.05%的氢化可的松溶液的生理盐水溶液中，浓缩液与生理盐水的体积比为I: 2，制得DC细胞蛋白滴眼液。5.如权利要求4所述的治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，在培养过程中每隔两日计数细胞一次，并补加一定量的X-VIVO 15培养基、IL-4和GM-CSF。6.如权利要求4所述的治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液的制备方法，在培养10天后，抽取I X 16的细胞进行DC细胞的流式检测。7.—种DC细胞蛋白滴眼液用于治疗细菌性结膜炎的用途。
【专利摘要】本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种治疗细菌性结膜炎的DC细胞蛋白滴眼液及其制备方法和应用，该滴眼液含有DC细胞分泌的蛋白浓缩物，不仅预防及治疗细菌性结膜炎的效果显著、不易复发，能够大大减轻患者的痛苦，而且能够替代现有技术中普遍使用的抗生素滴眼液，减少了普遍滥用抗生素的问题，制备方法首先对DC细胞进行扩增培养，然后再收集DC细胞分泌的蛋白，将蛋白进行浓缩后与生理盐水复配制得DC细胞蛋白滴眼液，制备方法简单、成本低，本发明的滴眼液在治疗细菌性结膜炎的应用中具有显著的效果，且不易复发。
【IPC分类】A61P31/04, A61K9/10, A61P27/02, A61K9/08, A61K38/17, A61K35/15, A61P31/02
【公开号】CN105640989
【申请号】
【发明人】王一飞, 陈海佳, 葛啸虎, 罗二梅
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月15日