小鼠抗人gfap单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及以原核表达的GFAP蛋白免疫小鼠获得的分泌GFAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株5C8，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]GFAP(glial fibrillary acidic protein，胶质纤维酸性蛋白)是构成胶质细胞的重要骨架成分，属于中间纤维丝蛋白家族的重要成员，是星形胶质细胞胞浆中8?1nm的中间丝，常常出现在细胞核周和胞浆中。GFAP基因位于17q21，其基因转录产物为308kb的GFAP-mRNA，蛋白产物为相对分子质量50kDa的中间丝结构蛋白AFAP蛋白主要组成氨基酸为谷氨酸、丙氨酸和亮氨酸，其氨基末端序列与其它中间丝蛋白非常不同，其特异的氨基末端序列为:丙氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸，因此具有生物化学特征。
[0003]GFAP是星形胶质细胞特异性表达的胞浆细胞骨架蛋白。大量研究证实，GFAP在维持星形胶质细胞形态的正常与稳定，促进星形胶质细胞突起生长与延长等方面起着重要作用。GFAP构成的中间丝在维持星形胶质细胞形态和功能上都有作用，参与细胞内细胞骨架重组、细胞粘附、维持脑内髓鞘形成和神经元的结构以及作为细胞信号转导通路;其含量或结构的改变会引起星形胶质细胞的形态和功能的变化，是星形胶质细胞肥大、增生的生理基础。GFAP也是检测中枢神经系统损伤后星形胶质细胞变化的敏感指标。几乎所有类型脑损伤后反应性星形胶质细胞中的GFAP都有增加，发生代谢性、变性性疾病时，GFAP的表达也发会生变化。
[0004]GFAP最早是从多长期患多发性硬化病人的白质硬化斑块中分离获得，作为星形胶质细胞特异性表达的胞浆细胞骨架蛋白，GFAP是最广泛应用于识别正常与病理情况下星形胶质细胞来源组织的标志物。GFAP作为胶质纤维的特异标记物，可用于颅内肿瘤中胶质起源肿瘤的确定；原发与转移性颅内肿瘤鉴别诊断有困难时，GFAP阳性也具有重要的参考意义。有研究通过对毛发型星形细胞瘤和神经节神经胶质瘤的免疫组化分析证实，GFAP与该类型肿瘤的预后有显著相关性。可以认为GFAP是胶质瘤区别于其他恶性肿瘤的重要特异性标志，对于科研和临床都十分重要。
目前，国内外已经获得了多种GFAP的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的GFAP的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测GFAP表达的小鼠抗人GFAP单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0006]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
(O根据GFAP的基因序列(匪_001131019.2)的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增GFAP基因，构建重组表达载体PET28a- GFAP，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。
[0007](2)采用经典的细胞融合技术制备GFAP单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA法测定纯化抗体的滴度。
[0008](3)通过免疫组织化学分析GFAP单克隆抗体染色人大脑胶质细胞瘤石蜡切片。
[0009](4)根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体GFAP重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到PGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体GFAP的重链和轻链可变区序列。
[0010]本发明提供的以原核表达的GFAP蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌GFAP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为5C8，分类命名为小鼠抗人GFAP杂交瘤细胞系，该细胞株5C8已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC N0.6915。
[0011]本发明还提供了所述杂交瘤细胞株5C8，CGMCCN0.6915产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO: 10。
[0012]本发明的优点和有益效果:
本发明应用重组人的GFAP蛋白为免疫抗原，免疫BalbA^Ht，采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗GFAP的杂交瘤细胞株，命名为5C8，亚型鉴定为IgGl，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对GFAP单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上;ELISA滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上。人大脑胶质细胞瘤石蜡切片经抗GFAP抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到胞浆内呈均匀着色的棕黄色颗粒，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的GFAP单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的GFAP蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测GFAP表达。
【附图说明】
[0013]图1SDS-PAGE分析纯化后的GFAP单克隆抗体。
[0014]图2 ELISA法测定GFAP单克隆抗体滴度。
[0015]图3是免疫组织化学检测分析GFAP单克隆抗体染色人大脑胶质细胞瘤石蜡切片。
【具体实施方式】
[0016]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。
[0017]实施例1:杂交瘤细胞株5C8及其产生的单克隆抗体的获得
1、抗原制备
(I)获得目的基因
在该实施例中，根据GFAP的基因序列(ΝΜ_001131019.2 )的编码框，设计I对特异引物: 引物1:5，-GGATCCATGG AGAGGAGACGCATCACCT-3’ (SEQ ID NO:1)
引物2:5 ’ -AATCTCGAGCTAACCGCGAGCCGGCG-3 ’ ；( SEQ ID NO: 2) Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增GFAP基因。
[0018](2)构建重组表达载体
将步骤(I)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒 PET28a-GFAP。
[0019](3)获得含重组表达质粒的表达菌种
将步骤(2)获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
[0020](4)诱导表达和蛋白纯化
将步骤(2)提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至1ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，37°C，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mM IPTG诱导表达，16°C诱导过夜，收集菌液超声，取上清用N1-NTA琼脂糖亲和层析法纯化GFAP蛋白
2、单抗的制备和纯化。
[0021](I)、免疫动物
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。
[0022]首次免疫。纯化的重组蛋白GFAP(用适量生理盐水稀释)+完全弗氏佐剂，10yg/只，颈背部皮下多点注射；
二次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白GFAP(用适量生理盐水稀释)+不完全弗氏佐剂，10yg/只，颈背部皮下多点注射；
三次免疫(间隔两周)。纯化的重组蛋白GFAP(用适量生理盐水稀释)，不完全弗氏佐剂，10yg/只，颈背部皮下多点注射；
三次免疫后7?10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合； 加强免疫(融合前3天)，用纯化的重组蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾脏融合。
[0023]⑵、细胞融合
采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP