一种绵羊角蛋白抗体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及文物考古技术领域，尤其涉及羊毛制品文物检测领域。
【背景技术】
[0002]绵羊毛是一种天然动物毛纤维。具有角质组织，呈现光泽，坚韧并有弹性。因其产量高、种类多，可生产多种毛织品，是主要的毛纺工业原料。
[0003]中国历史悠久，从中国早期的墓葬中出土有大量的羊毛制品，这些古代羊毛制品蕴藏着大量的考古信息。通常对羊毛制品的鉴定主要是对羊毛角蛋白的鉴定。羊毛角蛋白是一种硬化，不易溶解的蛋白质，其中既有含羧基等在内的酸性基，也有含胺基，亚胺基等在内的碱性基，所以在酸、碱、盐、氧化剂、还原剂、卤素等中羊毛都具有一定的不稳定性。这对羊毛制品的鉴别造成了一定困难。
[0004]目前，蛋白质检测技术如基于抗原-抗体结合的酶联免疫技术是一种广泛用于文物检测的先进技术，而前期的羊毛羊角蛋白抗体制备是一大难题。
【发明内容】
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种绵羊角蛋白抗体的制备方法。本发明方法制备的绵羊角蛋白抗体对绵羊角蛋白的反应灵敏度高，所需使用的抗原量极少。
[0006]本发明的具体技术方案为:一种绵羊角蛋白抗体的制备方法，步骤如下:
A)配制5_7wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为3.5-5 ;接着按1: (40-60)的浴比将绵羊毛添加到溶液中，在30-35°C下水浴震荡0.5-1.5h;然后取出羊毛并水洗至中性;将羊毛加入到其50-90倍质量的混合溶液A中，在95-105°C下反应3.5-4.5h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液透析、冷冻干燥后制得绵羊角蛋白粉。
[0007]本发明方法提取制得的绵羊角蛋白粉，纯度高，复配成抗原液后效果好。
[0008]B)用生理盐水将上述制得的绵羊角蛋白粉配制成0.75-1.25mg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂按体积比1: (0.8-1.1)混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫;在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫;在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫；当兔子血样中的抗体效价达到1:20000时，收集兔子血液。
[0009]本发明使用的Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂无毒无害，不含蛋白质成分，不破坏抗原天然构型，而且免疫方式简单，无需乳化抗原，只需要简单混合即可免疫，同时免疫周期短，抗原用量少。
[0010]C)从上述收集的血液中分离得到抗血清。
[0011]D)将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌后抽真空20-25min，得到无气泡的蛋白A填料液;将蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱;对蛋白柱进行清洗;对上述制得的抗血清进行稀释，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次;对蛋白柱再次清洗，用甘氨酸溶液对抗体进行洗脱，洗脱后清洗蛋白柱，制得抗体。
[0012]本发明采用绵羊角蛋白制备而得的抗体具有较强的特异性，该抗体能够与绵羊角蛋白具有明显的免疫反应，灵敏度高，能够对古代绵羊毛制品中已经断裂的绵羊角蛋白分子做出检测。
[0013]作为优选，骤A)中的所述混合溶液A由亚硫酸氢钠、尿素、十二烷基苯磺酸钠和水组成;其中亚硫酸氢钠的浓度为5 wt %，尿素的浓度为6M，十二烧基苯磺酸钠的浓度为I wt%。
[0014]本发明的混合溶液A中，亚硫酸氢钠能够迅速打开羊毛硫蛋白中的二硫键，使羊毛鳞片层受损，从而利于溶剂进入皮质层。尿素的能够加快溶解羊毛的速度。而十二烷基苯磺酸钠能够降低溶液表面张力，促使溶液渗透进入羊毛内部，增加羊毛的溶解率。同时亚硫酸氢钠以及十二烷基苯磺酸钠的钠离子具有强烈水化能力，对羊毛产生溶胀作用，使得皮质层中的物质溶出。本发明采用阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠，成本低，临界胶束浓度低，用量少。
[0015]作为优选，步骤A)中的所述混合溶液A由亚硫酸氢钠、尿素、皂素、十二烷基苯磺酸钠和水组成;其中亚硫酸氢钠的浓度为5 wt %，尿素的浓度为6M，皂素的浓度为0.5wt%，十二烷基苯磺酸钠的浓度为0.8 wt %。
[0016]上述混合溶液A中的皂素为天然非离子表面活性剂，与十二烷基苯磺酸钠复配使用后，对羊毛的渗透能力更强，对角蛋白的提取率有提高作用。
[0017]作为优选，步骤A)中所述粗角蛋白液溶液的透析方法如下:将粗角蛋白液溶液装入截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋浸泡于50-100倍质量的去离子水中透析4-5天，每隔7-9h更换去离子水，最后得到纯净角蛋白溶液。
[0018]作为优选，在对兔子进行初次免疫、加强免疫以及再加强免疫过程中，每个注射点的注射量为I OOyL。
[0019]作为优选，在步骤C)中，从血液中分离得到抗血清的方法为:将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于36-38°C的温箱内放置25-35min，再置于4°C的冰箱中I l-13h，使血块充分收缩并得到完全析出的粗抗血清；收集粗抗血清，在4 °C环境中，在3000g条件下离心14-16min，取上清液，放置于-80°C储存备用。
[0020]作为优选，步骤D)的具体过程为:
将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液按1.5g/(6-7)mL的配比混合，搅拌后抽真空20-25min，得到无气泡的蛋白A填料液;然后将6-7体积份的蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20体积份的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60mL/h;用磷酸盐缓冲溶液将15体积份的抗血清稀释至20体积份，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；用30体积份的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱再次清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.2mol/L、pH为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱;洗脱后用磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，制得抗体，将抗体装于离心管中并于4°C保存待用。
[0021]作为优选，步骤D )中所用的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mo I /L，pH为7.4。
[0022]与现有技术对比，本发明的有益效果是:本发明方法制备的绵羊角蛋白抗体对绵羊角蛋白的反应灵敏度高，所需使用的抗原量极少。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0024]实施例1
一种绵羊角蛋白抗体的制备方法，步骤如下:
A)配制6wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为4。接着按1:50的浴比将绵羊毛添加到溶液中，在32°C下水浴震荡lh。然后取出羊毛并用蒸馏水水洗过滤直至水洗液pH值为7。将羊毛加入到其70倍质量的混合溶液A中，所述混合溶液A中亚硫酸氢钠的浓度为5 wt %，尿素的浓度为6M，十二烧基苯磺酸钠的浓度为I wt%。在100°C下反应4h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液装入截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋浸泡于50-100倍质量的去离子水中透析4.5天，每隔Sh更换去离子水，得到纯净角蛋白溶液，冷冻干燥后制得绵羊角蛋白粉。
[0025 ] B )用生理盐水将上述制得的绵羊角蛋白粉配制成lmg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与Quick Antibody-Rabbit 5W佐剂按体积比1:0.95混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫;在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫;在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫。在对兔子进行初次免疫、加强免疫以及再加强免疫过程中，每个注射点的注射量为100yL。当兔子血样中的抗体效价达到1:20000时，收集兔子血液。
[0026]C)将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于37°C的温箱内放