细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种细胞外基质网络蛋白的多肽抗体及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 细胞是生命的单位。我们身体里的每个细胞都生活在细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)中。细胞外基质就象土壤，合适的土壤是保证作物生长(组织器官功能）的必要 条件。细胞外基质合成与降解的平衡破坏，最终导致此处细胞外基质过度聚集。细胞外基质 合成与降解是受多种因素相互影响、综合调控的复杂过程。深入研究细胞外基质合成与降 解综合调控机理对临床干预基质过度聚集、预防纤维化、研发临床治疗药物具有重要意义。
[0003] 基质素2(Matrilin-2)作为信息转换器(Adaptor)分子是连接细胞外胶原纤维网 络、非胶原微丝蛋白网络、蛋白多糖及细胞膜表面受体的重要成分，在细胞内外信息传递和 交换等多种生理功能上扮演着十分重要的角色。细胞外非胶原基质网络结构的稳态取决于 该蛋白（基质素2)的合成与降解的动态平衡，同时也直接影响细胞外基质与细胞、细胞与细 胞、以及基质与基质间的通信关系。
[0004] 我们课题组新近的研究表明，基质素2独特功能域有一个57碱基、19个氨基酸的剪 接，因此在生理状态下存在两种不同长度的基质素2,而且在不同小鼠组织中二者的比例存 在差异。我们进一步的研究首次证实，这两种不同长度的基质素2具有生理学的异质性。没 有19个氨基酸剪接的长基质素2主要形成自身四聚体、三聚体，同时还很容易形成多聚体， 而且相对比较不稳定，容易被酶切断;然而，有19个氨基酸剪接的短基质素2主要形成自身 四聚体、三聚体，没有发现形成自身多聚体，而且相对比较稳定，不容易被酶切断。基质素2 在细胞外可自身形成多聚体或与其它基质素结合形成杂合多聚体。每个多聚体蛋白的亚基 都能与细胞外基质中的胶原蛋白、蛋白多糖或其它非胶原蛋白分子形成胶原依赖性和胶原 非依赖性细胞外基质网络。在生理状态下独特功能域存在没有剪接、有剪接两种形式的 mRNA和蛋白质，这也许说明两种不同的基质素2协同作用对维持基质素2自身结构稳定性和 其与其它细胞外基质蛋白之间的稳态具有重要意义。
[0005] 我们课题组以及部分科研人员的研究工作证实，基质素2在多种组织中均有表达 (参见图1、图2)。由于基质素2广泛分布在各器官和组织中（参见图3)，在研究各种组织（如 心、肝、肾、肺、脑、皮肤、阴茎等器官）的生理功能时，基质素2的研究可能具有应用前景。另 外，由于各种疾病的预后都与纤维组织增生、包裹有关，因此深入研究基质素2对阐明非胶 原网络蛋白基质素2结构的稳定与多种疾病导致纤维组织增生、纤维化过程也将具有指导 作用(参见图4)。我们的研究认为，如果能生产一个同时识别两种不同长度基质素2的抗体， 则该抗体将可以应用到基质素在各种组织分布方面的研究工作，这将是认识基质素2在不 同组织中生理功能以及在疾病发生发展过程中（特别是细胞外基质紊乱、纤维组织增生、疾 病纤维包裹、纤维化)病理意义的关键突破点，也将具有肯定的应用前景。另外，深入研究基 质素2的剪切及其在细胞外基质网络中的作用也许可能为治疗延缓糖尿病、肾小球硬化、肝 硬化等等所致基质过度聚集具有一定的启发作用，也将具有可观的社会效益和经济效益。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是，克服以上【背景技术】中提到的特异性不够，不能明 确证实是否能够检测具有明显异质性的两种不同长度的基质素2等不足和缺陷，提供一种 能够同时识别两种不同长度的基质素2的细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体，还相应 提供该细胞外非胶原基质网络蛋白的多肽抗体的制备方法和应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种细胞外非胶原基质网络蛋白 的多肽抗体，所述多肽抗体是以氨基酸序列作为抗原选择部分，采用抗体制备标准方法合 成、分离纯化得到的IgG抗体，该氨基酸序列如下（以上表示氨基酸序列时，均是以氨基酸三 字母缩写的单字母符号表示）：
[0008] ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRSTQKLFHSTKSSGNPLEEo
[0009] 三字母表示的氨基酸及其单字母缩写如下所示。
[0010] 甘氨酸Glycine Gly G
[0011] 丙氨酸 AlanineAlaA
[0012] 缬氨酸Valine Val V
[0013] 亮氨酸Leucine Leu L
[0014] 异亮氨酸Isoleucine lie I
[0015] 腫氨酸Proline Pro P
[0016] 苯丙氛酸Phenylalanine Phe F
[0017] 酪氨酸Tyrosine TyrY
[0018] 色氨酸Tryptophan Trp W
[0019] 丝氨酸Serine Ser S
[0020] 苏氨酸Threonine Thr T
[0021] 半I光氨酸Cystine Cys C
[0022] 蛋氨酸Methionine Met M
[0023] 天冬酰胺AsparagineAsn N
[0024] 谷氨酰胺Glutarnine Gin Q
[0025] 天冬氨酸AsparticacidAsp D
[0026] 谷氨酸Glutamicacid Glu E
[0027] 赖氨酸Lysine Lys K
[0028] 精氨酸ArginineArg R
[0029] 组氨酸Histidine His H
[0030] 上述的多肽抗体，优选的，所述氨基酸序列的确定源自基质素2的独特功能域。
[0031] 上述的多肽抗体，优选的，所述独特功能域的氨基酸序列如下：
[0032] SRSTQKLFHSTKSSGNPLEE 〇
[0033] 作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的细胞外非胶原基质网络蛋白的 多肽抗体的合成方法，包括以下步骤：
[0034] 以细胞外非胶原基质网络蛋白基质素2(Matrilin 2)的独特功能域C-末端部分的 氨基酸序列为基础进行多肽合成;再以合成的多肽的C-末端部分的氨基酸序列作为抗原选 择部分，采用抗体制备标准方法合成、分离纯化IgG抗体，制备所得多克隆抗体。
[0035] 上述的合成方法中，优选的：所述合成的具有独特功能域多肽的氨基酸序列如下 所示：
[0036] ALEDSGGRQDSAAWDLPQQAHQPTEPEPVTIKIKDLLSCSNFAVQHRFLFEEDNLSRSTQKLFHSTKSSGNPLEEo
[0037] 上述的合成方法中，优选的:所述C-末端部分的氨基酸序列如下所示：
[0038] SRSTQKLFHSTKSSGNPLEE 〇
[0039] 作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的多肽抗体在特异性检测两种不 同长度的基质素2中的应用。
[0040] 上述的应用中，优选的，所述多肽抗体用于制作可特异性检测两种不同长度的基 质素2的试剂盒。
[0041] 上述的应用中，优选的，所述多肽抗体用于作为骨关节炎发病机制研究实验的指 示剂。
[0042] 上述本发明设计生产的针对基质素2独特功能域的多肽抗体建立在我们多方位研 究的基础上，经过多种实验方法验证证实，这是目前能够同时识别两种不同长度的基质素2 的多肽抗体。
[0043] 我们的抗体与目前可供商业基质素2抗体（如Santa Cruz的3066959(册5)、30 27926(V20)、SC-293397(2B8)、GeneTex GTX59785)相比具有明显的优势。本发明的多肽抗 体首先是经过了特别的合成和筛选制备，其能够特异性地检测两种不同长度的基质素2,是 目前唯一通过克隆重组检测分析的基质素2抗体。本发明提出的多肽抗体与抗原的抗原决 定簇位于特异的独特功能域，该功能域结构特殊，和目前已知蛋白质没有交叉反应，与基质 素家族的其它成员（如基质素1、基质素3和基质素4)均没有交叉反应;特异性结合强度非常 尚。
[0044]我们的实验结果显示，本发明提出的多肽抗体可以应用于ELISA、免疫组织化学、 免疫荧光组织化学、免疫细胞组织化学和蛋白印痕等，这为该抗体应用于临床迈出了更坚 实的一步。
【附图说明】
[0045] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 这些附图获得其他的附图。
[0046] 图1为基质素2在多种小鼠组织中均有表达的照片。其中，A为心肌;B为结肠;C为阴 茎海绵体;D为食道;E为肺组织;F为肾脏;G为气管软骨;Η为胃与食道交界处胃上皮；I为蜒 腺导管上皮。
[0047]图2为基质素2在骨关节豚鼠关节软骨组织中高表达，其中，A-C为豚鼠关节软骨。
[0048]图3为基质素2的剪切在各小鼠组织中存在的电泳图谱。
[0049] 图4为基质素2在多种