干细胞因子抑制剂的制作方法
【专利说明】干细胞因子抑制剂
[00011 本申请是分案申请，原申请的申请日为2012年1月10日，申请号为201280012594.7 (PCT/US2012/020782)，发明名称为"干细胞因子抑制剂"。
[0002] 本申请要求于2011年1月10日提交的美国专利申请序列号61/431,246的优先权， 该申请为了所有目的通过引用整体并入本文。
[0003] 关于联邦资助的研究或研发的声明
[0004] 本发明是在由美国国家卫生研究院颁发的HL059178拨款下借助政府资助进行的。 政府对本发明具有一定的权利。 发明领域
[0005] 本文提供的是涉及干细胞因子抑制剂的方法、组合物和用途。例如，本文提供的是 靶向干细胞因子的抗体和用于治疗纤维化和组织重塑疾病的方法。
[0006] 背景
[0007] 牵涉组织重塑和纤维化的疾病是全世界死亡的主要原因。在西方世界中差不多 45%的所有正常死亡可归因于某些类型的慢性纤维增生性疾病并且相关的卫生保健费用 为数十亿美元。组织重塑是现有组织的再生或修复，其可以变化组织的特性(例如，血管重 塑)或参与建立组织的动态平衡（例如骨重塑）。纤维化是作为修整或反应过程在器官或组 织中形成或产生过量纤维结缔组织，而不是形成纤维组织作为器官或组织的正常组分。纤 维化影响几乎所有组织和器官系统，并且纤维化组织可影响癌症转移并且加速移植受者中 的慢性移植物排斥。其中纤维化是发病率和死亡率的主要原因的疾病包括间质性肺疾病、 肝硬化、肾病、心脏病和系统性硬化症等。
[0008] 干细胞因子(SCF)及其受体c-Kit已牵涉纤维化和组织重塑疾病(El-Koraie等人， Kidney Int. 60:167(2001) ;Powell等人，Am. J.Physiol .289 :G2(2005) ;EI Kossi等人， Am. J.Kidney Dis.41:785(2003) ;Powell等人，Am. J.Physiol .277 :C 183( 1999)) x-Kit是 III型受体酪氨酸激酶，其存在于许多细胞类型（Orr-Urtreger等人，Development 109:911 (1990))。其也在分化的早期阶段表达(Andre等人，0ncogene4:1047(1989))且某些肿瘤表 现出升高的c-kit的表达。SCF是c-Kit受体激酶特异性的配体。结合导致c-Kit的二聚化及 其激酶活性的活化。首先从鼠成纤维细胞的上清液分离出SCF。此时，SCF被称为肥大细胞生 长因子(MGF)(Williams等人，Cell 63:167(1990))或造血生长因子1(以1(^配体）（!1皿即等 人，Cell 63:225(1990))。随后从大鼠肝细胞分离出同源物，称为干细胞因子(SCF)(Zsebo 等人，Cell 63 :195(1990))。相应的人蛋白质被不同地命名为不同的SCF、MGF、青灰因子 (SF)(Cell 63:203(1990))。
[0009] 先前的研究已表明c-Kit受体酪氨酸激酶的抑制剂能显著抑制异常组织纤维化 (参见，例如Aono，Am. J.Respir.Crit ·Care Med. 171:1279(2005) ;Vuorinen等人，Exp·Lung Res · 33: 357 (2007 );Vittal 等人，J. Pharmacol · Exp · Ther · 321:35(2007); Distler等人， Arthritis Rheum 56:311(2007))。然而，这种抑制剂具有若干个缺点。它需要通过口服施 用来全身给药，它具有一些与其应用相关的毒性，并且该化合物必须在细胞内递送以发挥 效力。因此，需要替代疗法。
[0010] 发明概述
[0011] 本文提供的是涉及干细胞因子抑制剂的方法、组合物和用途。例如，本文提供的是 靶向干细胞因子的抗体和用于治疗纤维化和组织重塑性疾病以及用于研究和诊断性用途 的方法。
[0012]在一些实施方案中，本文的组合物、方法和用途提供涉及抑制干细胞因子(SCF)的 疗法。一些实施方案提供靶向SCF的分离的抗体。在一些实施方案中，抑制SCF会影响C-Kit 的活性。本发明提供的组合物、方法和用途可用于治疗与组织重塑相关的纤维化疾病和病 症。不像某些其它疗法由于干扰一般胞内信号传导途径而产生不希望的副作用，本文提供 的实施方案通过调节SCF的活性而消除或减少此类副作用。因此，使毒性降至最小。而且，靶 向胞外配体不需要将组合物递送到细胞中以与胞内目标相互作用。在一些实施方案中，将 组合物递送到气道中，从而提供了相比于需要口服施用的先前技术的优势，且因此导致全 身性生物利用度。
[0013] 在一些实施方案中，本文提供的是包括提供干细胞因子抑制剂和向受试者施用治 疗有效量的抑制剂的方法。在一些实施方案中，抑制剂是分离的抗体或其抗原结合片段(例 如、Fabjal/ {(at/ )2和Fv片段等）。在一些实施方案中，抑制剂是小干扰RNA。在更具体的 实施方案中，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。一些实施方案提供了特异性结合干细胞因 子的抗体或其抗原结合片段。一些实施方案提供了特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID No: 1或SEQ ID No:8的肽的抗体或其抗原结合片段。
[0014] 在本文提供的方法的一些实施方案中，受试者患有疾病。因此，一些实施方案提供 了施用抑制剂可预防疾病的至少一种体征或症状或减轻其严重度。在一些实施方案中，受 试者具有干细胞因子的异常活性或受试者具有异常的胶原蛋白生成。在一些实施方案中， 受试者患有疾病，所述疾病包括但不限于纤维化或重塑疾病。在另外的实施方案中，疾病是 肺部疾病。一些实施方案提供了受试者患有肺部疾病，所述肺部疾病包括但不限于特发性 肺纤维化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合征、囊性纤维化、支气管周围纤维化、过敏性 肺炎或哮喘。此外，一些实施方案提供了受试者患有疾病，所述疾病包括但不限于硬皮症 (sclerodoma)、炎症、肝硬化、肾纤维化、实质纤维化、心内膜心肌纤维化、纵膈纤维化、结节 性表皮下纤维变性、纤维组织细胞瘤、纤维胸、肝纤维化、纤维肌痛、齿龈纤维化或辐射诱导 的纤维化。
[0015] 尽管不限于施用方式，但是在方法的一些实施方案中，将抗体递送到受试者的气 道中，例如通过鼻内施用。
[0016] 在一些实施方案中，施用抑制剂会降低受体的活性。一些实施方案提供了施用抑 制剂会降低干细胞因子与受体的相互作用。在更具体的实施方案中，受体是受体酪氨酸激 酶，而在另一更具体的实施方案中，受体是c-Kit。重要的是，本方法不限于靶向受体的位置 或干细胞因子的来源。例如，在一些实施方案中，受体在造血祖细胞、黑素细胞、生殖细胞、 嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞或肥大细胞中发现。另外，在一些实施 方案中，干细胞因子源于骨髓细胞、肝细胞、上皮细胞、平滑肌细胞或成纤维细胞。在一些实 施方案中，向受试者施用抑制剂会导致直接抑制成纤维细胞活化。
[0017] -些实施方案提供了包含特异性结合干细胞因子的分离的抗体或其抗原结合片 段(例如蛋白或其肽片段(例如表位））的组合物。例如，一些实施方案提供了特异性结合包 含氨基酸序列SEQ ID No: 1的肽的分离的抗体或其抗原结合片段的组合物。另外的实施方 案提供了结合SCF同工型b前体(例如，以GenBank登录号NP_000890可用的序列（SEQ ID NO: 4)的蛋白或肽片段）、或其变体或修饰形式、或SCF同工型a前体(例如，以GenBank登录号NP_ 003985可用的序列（SEQ ID NO:6)的蛋白或肽片段）、或其变体或修饰形式的抗体或抗原结 合片段。一些实施方案提供了结合蛋白或肽、或其变体或修饰形式的抗体或抗原结合片段， 所述蛋白或肽为SCF的NCBI Reference Gene Sequence(例如，登录号NG_012098(SEQ ID NO: 7))的翻译产物或变体或其片段。一些实施方案提供了结合包含SCF成熟形式的前11个 氨基酸(例如，EGICRNRVTNN(SEQ ID N0:8))的肽的抗体或抗原结合片段。
[0018] -些实施方案提供了抗体或抗原结合片段，其结合编码SCF的核酸或其变体或修 饰形式的翻译产物(例如，蛋白或肽）、或其变体或修饰形式。例如，实施方案提供了抗体或 抗原结合片段，其结合具有如下序列的核酸的翻译产物(例如，蛋白或肽）、或其变体或修饰 形式，所述序列包含由GenBank登录号NM_000899(SEQ ID N0:3)、NM_003994(SEQ ID N0:5) 和NG_012098 (SEQ ID NO: 7)、或其片段或变体(例如，可操作地连接到调控元件(例如，启动 子、增强子、聚合酶结合位点等）的突变体、cDNA、表达优化的变体等)定义的序列。在一些实 施方案中，抗体或抗原结合片段结合蛋白或肽、或其变体或修饰形式，所述蛋白或肽为编码 肽序列EGICRNRVTNN(SEQIDN0 :8)的核苷酸序列的翻译产物。肽和蛋白（及其片段和变体） 以及编码肽和蛋白（及其片段和变体）的核酸(及其片段和变体)在一些实施方案中用于产 生抗体。还期望的是，用于生产本文提供的抗体的载体、质粒、表达构建体、细胞、细胞系、杂 交瘤和有机体。
[0019] -些实施方案提供单克隆抗体而一些实施方案提供人源化抗体。在一些实施方案 中，组合物用于药物或用于制备药物。在一些实施方案中，所述药物用于治疗疾病。组合物 作为药物的用途不限于可得以治疗的疾病。例如，在一些实施方案中，疾病为特发性肺纤维 化、慢性阻塞性肺病、急性呼吸窘迫综合症，囊性纤维化、支气管周围纤维化、过敏性肺炎、 哮喘、硬皮病、炎症、肝硬化、肾纤维化、实质纤维化、心内膜心肌纤维化、纵膈纤维化、结节 性表皮下纤维变性、纤维组织细胞瘤、纤维胸、肝纤维化、纤维肌痛、齿龈纤维化或辐射诱导 的纤维化。在一些实施方案中，组合物用于研究体外或模型系统(例如体内）的疾病。
[0020] 本文实施方案提供了制备靶向干细胞因子的抗体(例如，单克隆抗体）的方法，其 包括以下步骤:提供包含SCF的免疫原性部分(例如，由SEQ ID NO: 1或8提供)或由其组成的 肽，用肽对宿主进行免疫，从宿主分离免疫细胞，使用免疫细胞制备杂交瘤，以及分离抗体 或其抗原结合片段。一些实施方案提供了制备靶向干细胞因子的抗体(例如，单克隆抗体） 的方法，其中抗体或其抗原结合片段特异性结合干细胞因子(例如，蛋白或其肽片段(例如， 表位））。例如，一些实施方案提供了制备特异性结合包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1的肽的分 离的抗体或其抗原结合片段的方法。另外的实施方案提供了制备抗体或抗原结合片段的方 法，所述抗体或抗原结合片段结合SCF同工型b前体(例如，以GenBank登录号NP_000890可用 的序列（SEQ ID N0:4)的蛋白或肽片段）、或其变体或修饰形式、或SCF同工型a前体(例如， 以GenBank登录号NP_003985可用的序列（SEQ ID N0:6)的蛋白或肽片段）、或其变体或修饰 形式。一些实施方案提供了制备结合蛋白或肽、或其变体或修饰形式的抗体或抗原结合片 段的方法，所述蛋白或肽为SCF的NCBI Reference Gene Sequence(例如，登录号NG_012098 (SEQ ID N0:7))或变体或其片段的翻译产物。一些实施方案提供了制备抗体或抗原结合片 段的方法，所述抗体或抗原结合片段结合包含SCF成熟形式的前11个氨基酸（例如， EGICRNRVTNN(SEQIDN0:8)W^ic。
[0021] -些实施方案提供了制备抗体或抗原结合片段的方法，抗体或抗原结合片段结合 编码SCF的核酸或其变体或修饰形式的翻译产物(例如，蛋白或肽）、或其变体或修饰形式。 例如，实施方案提供了制备抗体或抗原结合片段的方法，所述抗体或抗原结合具有如下序 列的核酸的翻译产物(例如，蛋白或肽）、或其变体或修饰形式，所述序列包含由GenBank登 录号NM_000899(SEQIDN0 :3)、NM_003994(SEQIDN0:5)和NG_012098(SEQIDN0:7)、或 其片段或变体(例如，可操作地连接到调控元件(例如，启动子、增强子、聚合酶结合位点等） 的突变体、cDNA、表达优化的变体等)定义的序列。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段 结合蛋白或肽、或其变体或修饰形式，所述蛋白或肽为编码肽序列EGICRNRVTNN(SEQ ID N0:8)的核苷酸序列的翻译产物。肽和蛋白（及其片段和变体）以及编码肽、蛋白及其片段和 变体的核酸(及其片段和变体)在一些实施方案中用于制备由提供的技术所提供的抗体的 方法。还期望的是，生产可用于生产本文提供的抗体的载体、质粒、表达构建体、细胞、细胞 系、杂交瘤和有机体的方法。
[0022] -些实施方案提供包括以下步骤的方法:提供干细胞因子抑制剂，以及将所述抑 制剂施用至细胞或组织。
[0023] 此外，一些实施方案提供了试剂盒，其包括包含特异性结合干细胞因子的分离的 抗体或其抗原结合片段的组合物，用于将所述组合物施用至受试者的装置，和/或使用说 明。
[0024] 基于本文所包含的教导，其他实施方案对相关领域的技术人员而言将是显而易见 的。
[0025] 附图简述
[0026]结合下列附图，本技术的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解。
[0027] 图1示出的一系列图表表明用抗体抑制SCF降低组织重塑介体的表达。图1A示出的 图表表明抗SCF抗体降低用博来霉素处理的肺中羟脯氨酸的量；图1B示出的图表表明抗SCF 抗体降低了 IL_25mRNA的量;图1C示出的图表表明抗SCF抗体降低IL-13mRNA的量;图1D示出 的图表表明抗SCF抗体降低存在于血浆中的可溶性SCF