一种青霉素酰化酶的产生菌的培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及催化剂制造技术领域，具体涉及一种青霉素酰化酶的产生菌的培养方法。
【背景技术】
[0002]固定化青霉素酰化酶是工业上非常重要的生物催化剂，它能水解工业盐生产6-APA，也能水解扩环酸生产7-ADCAA-APA和7-ADCA是生产β—内酰胺类半合体的两个重要中间体。固定化青霉素酰化酶也可以催化逆转反应，用于催化合成其他半合体。
[0003]颗粒型固定化青霉素酰化酶，应用固化PCA生产6-ΑΡΑ，7—ADCA具有操作简便，产品收率高、成本低，三废污染少等优点。
[0004]而制备颗粒型固定化PCA，首先要培养高活性的青霉素酰化酶的产生菌。
【发明内容】
[0005]本发明的目的，是为了解决上述问题，提供一种青霉素酰化酶的产生菌的培养方法。
[0006]本发明解决上述问题的技术方案如下:
一种青霉素酰化酶的产生菌的培养方法，包括如下步骤:
①培养基制备:制备固体种子培养基、液体种子培养基或发酵种子培养基中的一种，在119-123°C下灭菌28-32分钟，备用；
②菌种活化:将细菌种子保存液或细菌种子保存块加入到培养基中，36.8-37.2°C下进行培养，待用；
③制备菌种培养平板:将自来水和培养皿在119-123°C下灭菌28-32分钟，备用；制备如步骤①中所述的固体种子培养基，在未凝固前，将I体积分数的固体培养基倒入灭菌后的培养皿中，摇匀，冷却凝固后备用；制备如步骤①中所述的固体种子培养基，并分成若干份在灭菌的试管中形成斜面；
④稀释种子液:制备如步骤②中活化后的所述的液体种子培养基，分别稀释1000倍、10000倍、100000倍及 1000000倍备用；
⑤种子液涂制并挑取:将步骤④中配置好的四种浓度的液体种子取0.0066-0.0067体积分数分别滴加到不同的菌种培养平板中，使其涂布均匀，倒扣放置在培养箱中，并在
36.8-37.2°C下培养46-50小时，挑取生长的菌落，将其置于步骤③中形成固体种子培养基形成斜面的试管中；
⑥菌种培养:将步骤⑤中的试管进行编号或直接放入培养箱中，在36.8-37.2°C下培养卜2天；
⑦摇瓶初筛选:将步骤⑥中的试管进行编号，初步培养后，将5%体积分数的固体种子培养基连带菌落接入摇瓶中进行发酵培养，所述摇瓶内设置有步骤①中所述的发酵种子培养基，培养过程中将摇床的转速调节至230-270转/分钟，在36.8-37.2°C下培养70-74小时，检测各瓶细菌所产生的青霉素酰化酶的活力；
⑧摇瓶复筛选:挑选经步骤⑦检测后青霉素酰化酶的活力排名在总数25%之前的固体种子培养基，并将与之对应的步骤⑥中所述试管筛选出来;重复步骤⑦的初步培养和发酵培养，再挑选经重复步骤⑦的初步培养和发酵培养检测后青霉素酰化酶的活力排名在总数50%之前的固体种子培养基，并将与之对应的步骤⑥中所述试管筛选出来，作为生产种子，将所述生产种子转接培养，形成母种。
[0007]作为上述技术方案的优选，步骤①中所述固体种子培养基由I质量份蛋白胨、0.6-0.65质量份酵母膏、0.9-1.1质量份氯化钠、1.9-2.1质量份琼脂以及95.2-95.5质量份的水混合制成。
[0008]作为上述技术方案的优选，步骤①中所述液体种子培养基由I质量份蛋白胨、0.6-0.65质量份酵母膏、0.9-1.1质量份氯化钠、93.2-93.5质量份的水混合制成。
[0009]作为上述技术方案的优选，步骤①中所述发酵种子培养基由1.5质量份蛋白胨、
2.9-3.1质量份淀粉、2.4-2.6质量份酵母膏、0.08-0.12质量份柠檬酸钠、0.28-0.32质量份磷酸氢二钾以及92.3-92.9质量份的水混合制成，混合时，先把淀粉用一半的水加热溶解，其他成分与另一半水溶解，再将两份溶液混合。
[0010]作为上述技术方案的优选，步骤②中所述的菌种活化方法为将步骤①中所述的固体种子培养基装入试管或茄子瓶，摆成斜面，所述斜面的长度为所述试管的1/3-1/2，或，所述茄子瓶中的固体种子培养基顶端距离所述茄子瓶瓶颈的底端的距离大于2cm;将储存的菌种放置于所述试管或所述茄子瓶内，并涂布均匀，36.8-37.2 °C下培养3-4天即可。
[0011]作为上述技术方案的优选，步骤②中所述的菌种活化方法为将所述液体种子培养基取5体积份置于试管中，将0.000003-0.000005体积份菌种保存液置于其中，36.8-37.2°C下震动培养23.5-24.5小时即可。
[0012]作为上述技术方案的优选，步骤②中所述的菌种活化方法为将所述发酵种子培养基置于茄子瓶内，将储存的菌种放置于所述茄子瓶内，并涂布均匀，36.8-37.2 °C下培养24-48小时;将步骤①中所述液体种子培养基倒入到所述茄子瓶内，用刮刀刮下繁殖的菌种，将液相物质倒入到接种瓶中即可。
[0013]作为上述技术方案的优选，步骤⑦中所述的初步培养为用接种针取存储的菌种置于内含有步骤①中所述的液体种子培养基的三角瓶中，36.8-37.2°C下培养14.5-15.5小时。
[0014]作为上述技术方案的优选，步骤⑦中所述的初步培养为将存储的菌种置于含有卡那霉素的斜面试管中，所述斜面试管中包含有步骤①中所述的固体种子培养基，36.8-37.2°C下培养1-2天。
[0015]作为上述技术方案的优选，步骤⑧中所述生产种子转接培养方法为小规模培养方法:在三角瓶中装入步骤①所述的发酵种子培养基50体积份，将2.4-2.6体积份的生产种子置于其中，在36.8-37.2 °C、摇床转速为250转/分钟条件下，震动培养70-74小时;或，步骤⑧中所述生产种子转接培养方法为中规模培养方法:涉及培养罐容积200-400L，内置150-350L物料，培养罐加热至119-123°C保持28-32分钟，再冷却至88-92°C，加入200质量份步骤①中所述的液体种子培养基、175-185质量份水，0.037-0.04质量份消泡剂，开启搅拌，再加入1-1.5质量份酵母膏、1.8-2.2质量份蛋白胨、1.8-2.2质量份氯化钠、0.01-0.03质量份泡敌，加热至119-123°C保持28-32分钟，再冷却至36-38°C，放入生产种子，同时加入含有2克卡那霉素的卡那霉素溶液，搅拌均匀，保持温度，并控制培养罐内表压为0.05pa，培养14.5-15.5小时;或，步骤⑧中所述生产种子转接培养方法为大规模培养方法:涉及2-2.5吨重的物料及与其相配适的培养罐，培养罐加热至119_123°C保持28-32分钟，再冷却至88-92°C，加入2000质量份步骤①中所述的发酵种子培养基、1750-1850质量份水，0.37-0.42质量份消泡剂，开启搅拌，再加入45-55质量份酵母膏、27-33质量份蛋白胨、5.5-6.5质量份磷酸氢二钾、1.8-2.2质量份柠檬酸钠、55-65质量份淀粉、0.18-0.22质量份泡敌，加热至119-123°C保持28-32分钟，再冷却至36-38 V，放入生产种子，搅拌均匀，保持温度，并控制培养罐内表压为0.05pa，培养70-74小时。
[0016]菌种保藏方法:
甘油保藏法:1ml塑料离心管中，装浓度为50%的甘油溶液5ml，121°C，30分钟灭菌，冷却至室温。用无菌吸管吸取培养15小时的成熟液体种子5ml(或从斜面用接种环挑取斜面培养2-3天的斜面新鲜细胞)，放入上述灭菌并冷却后的甘油管中。混和均匀，置-80°C冰箱冷冻保存。有效保存期I年左右。
[0017]液体石蜡保藏法:
⑴无菌液蜡的制备:将液蜡装入三角瓶。塞上棉塞。121°C，30分钟灭菌后，放入培养箱，370C静置培养I天后，再灭菌一次，培养I天。重复3次，第3次灭菌后，放入干燥箱，60°C保温，尽量使灭菌时进入液蜡中的水分挥发后使用。
[0018]⑵液蜡保存菌种:菌种接种至斜面固体培养基上;放置在培养箱中，37°C静置培养3-4天后，用无菌吸管吸取无菌液蜡，放入斜面菌种试管中，使液蜡高于斜面顶端Icm左右。然后，用固体蜡密封试管口，垂直放置于室温保存。有效保存期5-6年。
[0019]青霉素酰化酶液体酶活力的测定方法:
在一定条件下，青霉素酰化酶能水解青霉素G，生成等摩尔量的苯乙酸，用氢氧化钠标准溶液，准确滴定生成的苯乙酸量，依据苯乙酸的生成量计算酶的活力。
[0020]0.05Mol氢氧化钠标准溶液，按常规方法配制，标定。
[0021 ] 2%青霉素G钾盐溶液的配制，称取青霉素G钾盐2.00克，溶解于80ml 0.0lmoI/L，pH8.0的磷酸缓冲液中，再用磷酸缓冲液定容到10ml，然后用0.lmol/L的氢氧化钠溶液调节至PH8.0，注意:此溶液必须随配随用。
[0022]I操作:吸取2%的青霉素G钾盐溶液20ml，置28°C水浴锅中预热15分钟。准确吸取适量体积的液体酶，加入上述预热好的青霉素溶液中，在充分搅拌条件下，计时反应10分钟，并用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，控制反应pH8.0，每隔2分钟记录消