-IFNa-linker-IFN γ 〇
[0060] 5 ·重组原核表达质粒pET32a-IFNa-l inker-IFN γ的构建。
[0061 ] 用BamH I和Hind III限制性内切酶分别双酶切融合基因 IFNa-linker-IFNy和 pET32a空载体，胶回收获得酶切后的基因片段和载体片段，应用T4连接酶进行连接反应，其 中，T4DNA连接酶lyL，10xT4DNA Ligase buffer lyL，酶切后的目的片段与载体以mol比为 3:1的比例加入，反应总体积为10yL。16 °C连接4h后转化至DH5a感受态细菌，培养后，挑取菌 落于氨苄青霉素抗性的LB培养基中进行培养，应用菌液PCR方法筛选出阳性克隆，获得重组 原核表达质粒。用同样的方法分别构建出pET32a_IFNa和 PET32a_IFNy重组表达质粒。 [0062]实施例2表达产物的鉴定、纯化
[0063]将重组原核表达质粒转化BL21感受态细菌，挑取阳性菌落扩大培养后，用IPTG诱 导蛋白的表达，分别用SDS-PAGE和western blot方法鉴定蛋白表达情况，western blot的 检测结果如图2所示，SDS-PAGE的检测结果如图3所示。收集各表达菌的菌体沉淀，加入PBS 震荡混匀，超声裂解后，分离上清液和沉淀，用含有8mol/L尿素的磷酸盐溶液溶解沉淀，将 溶解液与Ni柱填料结合lh后过柱，收集滤液，重复过柱2次，用含有30mmol/L咪唑的磷酸盐 溶液洗涤柱子，至洗脱液蛋白浓度为〇时停止，后用含有250mmol/L咪唑的磷酸盐溶液洗脱 蛋白，将洗脱液放入透析袋中复性，依次用含有6，4，2，0m 〇l/L尿素浓度梯度的PBS溶液进行 透析，并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况。
[0064]实施例3表达产物抗病毒活性检测
[0065]体外抗病毒活性检测：在DEF上，按照动物干扰素体外抗病毒活性检测方法，分别 检测融合蛋白rDuIFNa-linker-rDuIFNy 抗VSV、AIV和DPV活性，以rDuIFN-α和rDuIFN- γ 为 对照组，结果显示:融合蛋白的抗VSV、AIV和DPV活性分别为2.61 X 107U/mg、1.12 X 107U/mg 和9.07 X 106U/mg，明显高于单个鸭干扰素的抗病毒活性;体内抗病毒活性检测:在北京鸭 上，分别检测融合蛋白^)111?_-1丨111^^〇111?~丫抗六1￥和0?￥活性，并以1〇111?^〇和 rDuIFN-γ为对照组。该实验分两次进行，实验1:筛选出禽流感(H5N1)抗体阴性的1日龄北 京鸭，随机分为5组，每组10只，分别用rDuIFNa-linker-rDuIFNy蛋白、rDuIFN-a蛋白、 rDuIFN- γ蛋白和PBS进行肌肉注射，注射剂量为40ug/次/只，2日龄时进行首次注射，间隔 4h后进行第二次注射，后每天注射一次，至6日龄时停止注射。于第二次干扰素注射后2h攻 禽流感病毒。实验过程中，每日观察鸭采食量，精神状态等，记录死亡率，于攻毒后1、3、5、7、 9天采集喉和泄殖腔拭子，检测其排毒量;实验2:筛选出鸭瘟抗体阴性的1日龄北京鸭，随机 分为5组，每组10只，分别用rDuIFNa-linker-rDuIFN γ蛋白、rDuIFN-a蛋白、rDuIFN- γ蛋白 和PBS进行肌肉注射，方法同实验1，于第二次干扰素注射后2h攻鸭瘟病毒，后每日观察鸭精 神状态、采食量和奠便等，并记录其死亡率。实验1结果表明：融合蛋白rDuIFNa-l inker-rDuIFN γ对流感感染鸭的保护率可达到100 %，而单个rDuIFN-a和rDuIFN-γ的保护率分别 为90%和70%，只攻毒组存活率为40%，且融合干扰素治疗组病鸭排毒量低于单个干扰素 治疗组;实验2中，融合蛋白对鸭瘟感染鸭的保护率为90 %，单个rDuIFNa和rDuIFN γ的保护 率均为70%，攻毒组存活率为30%。综合以上结果可知，与单个rDuIFN-a和rDuIFN-γ相比， 融合蛋白rDuIFNa-linker-rDuIFNy具有更高的抗病毒活性，对病毒感染鸭可提供更好的 保护效果。
[0066]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种串联鸭α、γ干扰素基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 权利要求1所述的串联鸭α、γ干扰素基因的制备方法，其特征在于:具体包括以下步 骤： (1) 引物的设计与合成 根据Genbank中提供的鸭IFN-α和IFN-γ序列，分别设计2对引物IFNa-Fl、IFNa-Rl和 IFN γ-FI、IFN γ-R1，用于扩增去除信号肽后的鸭IFN-a基因和IFN-γ基因，并分别在IFN-a 上游和IFN-γ下游加入BamH I和Hind III两个酶切位点；同时，设计用于S0E-PCR的引物 IFNa-R2和IFN γ -F2,其中，IFNa-R2中含有部分linker序列，IFN γ -F2中含有与IFNa-R2互 补的linker序列；引物序列如下:去除信号肽后IFNa的扩增引物： IFNa-Fl的序列如SEQIDN0:4所示； IFNa-Rl的序列如SEQIDN0:5所示； IFNa-R2的序列如SEQ ID N0:6所示； 去除信号肽后IFNy的扩增引物： IFNγ-Fl的序列如SEQIDN0:7所示； IFNγ-F2的序列如SEQIDN0:8所示； IFNγ-Rl的序列如SEQIDN0:9所示； (2) 鸭α、γ干扰素基因的扩增 从鸭外周血淋巴细胞中抽提RNA，经反转录后，得到扩增鸭α、γ干扰素基因的cDNA模 板；以此cDNA为模板，分别用上述引物IFNa-Fl、IFNa-Rl和IFNy -F1、IFN γ -R1，扩增出所需 鸭a、γ干扰素目的基因； (3) S0E-PCR扩增串联鸭a、γ干扰素基因 该过程主要包含3个PCR反应，第一个PCR:以IFNa-Fl和IFNa-R2为引物扩增出含有部分 1 inker序列的IFN-a，以IFN γ -F2和IFN γ -R1为引物扩增出含有部分1 inker序列的IFN- γ， 并分别进行胶回收;第二个PCR:以第一个PCR扩增出的基因为模板，不加引物，进行10-15个 PCR反应;第三个PCR反应，以第二个PCR反应扩增出的基因为模板，用引物IFNa-Fl和IFN γ-R1扩增出融合基因串联鸭α、γ干扰素基因。3. -种表达串联鸭α、γ干扰素基因的原核表达质粒PET32a-IFNa-linker-IFNy，其特 征在于:通过BamH I和Hind III酶切位点将权利要求1所述的串联鸭α、γ干扰素基因连接 到原核表达质粒pET32a( + )上。4. 权利要求3所述的原核表达质粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的制备方法，其特征在 于:具体步骤如下： 1) 鸭串联鸭a、γ干扰素基因克隆至PMD-19T载体： 将权利要求1所述的鸭串联鸭α、γ干扰素基因连接入pMD-19T载体，16°C连接过夜后进 行转化;挑取菌落接种于氨苄青霉素抗性的LB培养基中继续培养，用菌液PCR的方法筛选出 阳性克隆，测序正确后扩大培养，获取该基因的阳性质粒口10-191'-正_-1丨111?^-正1^; 2) 重组原核表达质粒pET32a-IFNa-linker-IFNy的构建： 用BamH I和Hind III限制性内切酶分别对pMD-19T-IFNa-linker-IFNy和pET32a空载 体进行双酶切，胶回收获得酶切后的基因片段和载体片段，应用T4连接酶，将目的片段连接 至丨JpET32a( + )载体上，构建出重组原核表达质粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ;将上述构建好 的质粒转化DH5a感受态细菌，培养后，挑取菌落接种于氨苄青霉素抗性的LB培养基中进行 培养，应用菌液PCR方法筛选出阳性克隆，获得重组原核表达质粒pET32a-IFNa-linker-IFN ?。5.权利要求1所述的串联鸭α、γ干扰素基因的应用，其特征在于:权利要求1所述的串 联鸭α、γ干扰素基因表达的融合蛋白在制备鸭的抗病毒药物方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种串联鸭α、γ干扰素基因及其制备方法和应用，属于生物技术领域的基因融合表达。本发明所述的串联鸭α、γ干扰素基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。本发明还提供了串联鸭α、γ干扰素基因的制备方法，以及表达串联鸭α、γ干扰素基因的原核表达质粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ及其制备方法，以及串联鸭α、γ干扰素基因表达的融合蛋白在制备鸭的抗病毒药物方面的应用。本发明成功构建了重组鸭α、γ干扰素原核表达质粒pET32a-IFNα-linker-IFNγ，实现了鸭IFN-α和IFN-γ基因在大肠杆菌原核表达系统上的串联表达，还可以保证两个干扰素基因以1:1的比例进行表达。
【IPC分类】C12N15/70, C12N15/62, C12N15/10
【公开号】CN105647945
【申请号】
【发明人】任涛, 高佩, 黎玉莲
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月9日