一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤生物治疗技术领域，尤其涉及一种基于Fey Rma的嵌合基因及其 用途，还涉及基于Fc γ RIHa的基因工程化免疫细胞及其用途。
【背景技术】
[0002] 单克隆抗体已经逐渐成为癌症治疗中的支柱。单克隆抗体发挥治疗作用的机制主 要是通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)杀死祀细胞。在单克隆抗体临床应用中，经常观察到不理想的治疗效 果。原因是患者经过放化疗之后单抗药物ADCC作用的效应细胞耗竭，使得单抗药物不能充 分发挥作用。
[0003] 嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR)CD19的T细胞（CART-19细胞）已 经在CD19表达的B细胞恶性肿瘤的治疗中取得了显著成功(Kochenderfer et al. ,2010; Porter et al. ,2011)。常规的CAR分子的设计采用鼠源单抗的scFv结合0)3ζ与共刺激分子 (⑶28、4-1ΒΒ等)组成。针对不同组织的肿瘤相关抗原(ΤΑΑ)需要设计相应特异性的scFv，所 构建的CAR分子只局限于针对于该种肿瘤，不具备通用性，限制了 CAR技术的临床应用。
[0004] 常规嵌合抗原受体(CAR)分子的设计主要包括⑶8α前导区、由Linker序列连接VH 和VL形成的单链可变区（scFv)、CD8a铰合区、CD8a跨膜区和胞内信号转导区。其中CD8a铰合 区为scFv与抗原的结合提供灵活的空间，解决scFv与抗原结合空间位阻的问题。
[0005] FcyRina(CD16a)是唯一表达于NK细胞上可与IgG结合介导ADCC作用的Fc受体。Fc yRIIIa是一种跨膜糖蛋白，含有信号肽序列、细胞外结构域、跨膜区和细胞内结构域。其中 细胞外结构域与IgG的Fc段结合介导ADCC作用。阳性表达FcyRHIa的效应细胞是发挥单克 隆抗体ADCC作用的关键因素。临床上迫切需要补充阳性表达Fc γ RIHa的效应细胞以提高单 克隆抗体药物的临床疗效。
[0006] 因此，如何研发一种基于Fey RIHa的嵌合基因以及基因工程化免疫细胞以解决现 有单克隆抗体和嵌合抗原受体两种技术所存在的问题已成为目前研究的重点。
【发明内容】
[0007] 本发明基于Fc γ RIHa与抗体Fc段结合产生ADCC作用的原理，在优化CAR分子结构 的基础上，设计了作用位点为Fey RIHa的CAR分子，其不仅可与多种不同的单克隆抗体药物 联合使用，用于多种肿瘤的治疗，同时又能够发挥CAR分子对肿瘤细胞的高效杀伤功能。
[0008] 本发明人为实现上述目的进行了反复深入的研究，结果发现，通过将嵌合基因中 的Fc γ RIHa细胞外结构域直接与⑶8α跨膜区连接，不需要⑶8α铰合区，该种Fc γ Rma-CAR 分子设计更有利于激活效应细胞，能显著提高Fc γ RHIa-CAR分子对多种肿瘤细胞的杀伤能 力，可实现上述目的。
[0009] 即，本发明采用了如下技术方案：
[0010] 第一方面，本发明提供了一种基于Fey RIHa的嵌合基因，所述嵌合基因包括依次 串联的Fc γ Rma信号肽、Fc γ Rma细胞外区域、CD8a跨膜区域和胞内信号传导结构域，所述 Fc γ Rma细胞外区域直接与⑶8a跨膜区域连接。
[0011] 本发明不同于常规CAR分子的设计。本发明所述嵌合基因中，FcyRHIa细胞外区域 直接与CD8a跨膜区域连接，其删除了常规CAR分子中的CD8a铰合区。该种设计不仅未出现由 Linker序列连接VH和VL形成的单链可变区（scFv)与抗原结合的空间位阻问题，而且，发明 人惊喜地发现，与未删除CD8a铰合区的结构相比，该种Fc γ RHIa-CAR分子设计更有利于激 活效应细胞，更能显著提高Fc γ Rma-CAR分子对肿瘤细胞的杀伤能力。
[0012] 本发明提供的基于Fey Rma的CAR分子既可以通过单克隆抗体药物靶向性介导效 应细胞对肿瘤细胞进行识别，提高单克隆抗体药物的临床疗效，又可以发挥CAR分子的肿瘤 细胞杀伤功能;采用该设计的CAR分子与单克隆抗体药物联合可通用于多种肿瘤的细胞治 疗。
[0013] 根据本发明，所述Fey Rma信号肽具有如SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列，其编码 基因序列如SEQ ID N0:3所示。
[0014] 本发明中采用Fey Rma信号肽作为信号肽，相比采用常规的⑶8α前导序列，其具 有的优势主要体现在:Fey Rma信号肽为Fey Rma基因原有结构的一部分，相对于⑶8α前 导序列，更有利于指引Fey Mia细胞外区域蛋白穿膜，并在后期剪切。本发明通过构建含有 CD8a前导序列的Fc γ RIIIa-CAR(定义为CD8aleader-Fc γ RHIa-CAR)，与本发明设计的Fc γ R Dla信号肽Fc γ RHIa-CAR(定义为Fc γ Rllla signal peptide-Fc γ RHIa-CAR)针对肿瘤细胞 杀伤能力试验相比较，本发明Fey Rma信号肽的选择明显优于常规CAR分子设计的CD8a前 导序列。
[0015]根据本发明，所述Fey Rma细胞外区域具有如SEQ ID N0:9所示的氨基酸序列，其 编码基因序列如SEQ ID N0:4所示。
[0016] 根据本发明，所述⑶8α跨膜区域具有如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，其编码 基因序列如SEQ ID N0:5所示。
[0017] 根据本发明，所述嵌合基因还含有Kozak序列；所述Kozak序列如SEQ ID NO: 2所 不。
[0018] 本发明中在信号肽区域之前采用加入Kozak序列，其具有的优势主要体现在:加入 Kozak序列可用于增强本发明设计的CAR分子在真核细胞(如人T细胞和NK细胞）中的翻译效 率。
[0019] 本发明中所述Kozak序列与Fc γ Rma信号肽和细胞外区域依次拼接，组成与单克 隆抗体Fc段结合的功能区域序列。
[0020] 根据本发明，所述胞内信号传导结构域由共刺激分子和细胞活化信号拼接而成。
[0021] 根据本发明，所述共刺激分子为CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、ro-l、IC0S、 LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3或CD83中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28 或4-1BB中的任意一种或两种的组合，进一步优选为4-1BB。
[0022]本发明中采用4-1BB作为优选的共刺激分子，其具有的优势主要体现在:4-1ΒΒ作 为共刺激分子相对于CD28更有利于T细胞在体内的存活。
[0023]根据本发明，所述4-1BB具有如SEQ ID N0:11所示的氨基酸序列，其编码基因序列 如SEQ ID N0:6所示。
[0024]根据本发明，所述细胞活化信号为CD3G信号传导结构域。
[0025]根据本发明，所述⑶3ζ信号传导结构域具有如SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列， 其编码基因序列如SEQ ID N0:7所示。
[0026]作为优选，本发明所述嵌合基因由Kozak序列、Fey Rma信号肽、Fey Rma细胞外 区域、CD8a跨膜区域、共刺激分子和CD3G信号传导结构域依次串联拼接而成，所述Fey Rma 细胞外区域直接与CD8a跨膜区域连接，不含有CD8a铰合区。
[0027] 本发明中的无⑶8a铰合区的Fc γ Rma-CAR分子结构具体为：
[0028] Kozak-Fc γ Rllla信号肽（signal peptide)_Fc γ Rllla细胞外区域（extracellular port ion) _CD8a 跨膜区域（transmembrane region )-4-lBB_CD3G。
[0029] 本发明优选采用上述串联拼接结构，作为一个整体，其具有的优势主要体现在： Kozak序列可以增强在真核细胞中的翻译效率;Fey Rma信号肽更有利于指引Fey Rma细 胞外区域蛋白穿膜，并在后期剪切;Fc γ Rllla的细胞外区域直接与CD8a跨膜区相连，更有利 于激活该CAR分子修饰的T细胞;4-1BB作为共刺激分子更有利于T细胞在体内的存活。本发 明所设计的上述串联拼接结构构成的CAR分子，可以靶向性高效的杀伤肿瘤细胞。
[0030] 根据本发明，所述嵌合基因优选具有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0031] 以上各分子的核苷酸序列和氨基酸序列可利用分子生物学领域已知的基因重组 方法获得，例如以表达基因的细胞的eDNA为文库，通过PCR扩增的方式得到该基因，优选核 酸序列被合成生产，而不是克隆。