r>[0032] 本发明提供了一种通用型的基因工程修饰的免疫细胞制备方法，其既可以通过单 克隆抗体药物介导效应细胞对肿瘤细胞的识别，又可以发挥CAR的肿瘤细胞杀伤功能，解决 了现有单克隆抗体和嵌合抗原受体两种技术所存在的问题。
[0033] 本发明提供了基于Fc γ Rllla的基因工程化免疫细胞的制备方法，嵌合基因包括 Kozak序列，人Fc γ Rllla的信号肽和细胞外区域，CD8a跨膜结构域和细胞内共刺激信号传导 区（4-1BB)以及CD3G信号传导结构域。其中FcyRHIa的细胞外区域可以与多种单克隆抗体 的Fc段结合，靶向性识别相关肿瘤，启动ADCC作用和CAR分子的细胞毒性作用。
[0034] 为了比较本发明与现有技术的设计优势，本发明无 CD8a铰合区的嵌合基因命名为 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ，现有技术含有CD8a铰合区的嵌合基因结构命名为Fc γ RIIIa-CD8a-BB-G。发 明人经研究发现，无 CD8a铰合区结构设计的CAR分子，CD8a跨膜区直接与Fc γ Rllla的细胞外 区域相连，更有利于激活该CAR分子修饰的T细胞。
[0035] 第二方面，本发明还提供了一种重组表达载体，其包含如第一方面所述的嵌合基 因。
[0036]第三方面，本发明还提供了一种细胞，其表达如第一方面所述的嵌合基因或含有 如第二方面所述的重组表达载体。
[0037]根据本发明，所述细胞为T细胞、NK细胞或DC细胞中的任意一种。
[0038] 优选地，所述T细胞为中心记忆T细胞、效应记忆T细胞或效应T细胞中的任意一种。 [0039]优选地，所述NK细胞为原代培养的NK细胞或NK92细胞系。
[0040]将本发明所述嵌合基因导入效应细胞，使其持续表达。基因导入方法在本领域内 是已知的，具体的包括物理学方法、化学方法和生物学方法。物理学方法包括磷酸钙转染 法、显微注射、电穿孔等，化学方法包括脂质体转染系统等，生物学方法主要通过构建病毒 载体完成，优选米用生物学方法，其中病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病 毒和单纯疱疹病毒等，优选米用慢病毒。
[0041]采用本领域已知的方法构建本发明嵌合基因的慢病毒载体，与辅助质粒共转染 293T细胞，得到具有感染能力含有本发明嵌合基因的慢病毒。
[0042]本发明中效应细胞定义为能够整合转染本发明嵌合基因，可以介导ADCC作用，能 够杀伤靶细胞的细胞。该效应细胞可以是原代培养的效应细胞，也可以是来源于细胞系的 效应细胞。
[0043] T细胞的来源包括但不限于外周血、骨髓、淋巴结组织、脐带血、腹水、胸腔积液，优 选为外周血来源。采用本领域已知的Ficoll分离的方式进行PBMC的富集，然后采用流式分 选的方法或MACS磁珠分选的方法从中分离出CD3+T细胞，进行后续的基因修饰。
[0044] NK细胞的来源包括但不限于外周血、骨髓、淋巴结组织、脐带血、腹水、胸腔积液， 还可来源于NK92细胞系。采用本领域已知的Ficoll分离的方式进行PBMC的富集，然后采用 流式分选的方法或MACS磁珠分选的方法从中分离出⑶3-⑶16/56+NK细胞，进行后续的基因 修饰。
[0045] 与效应细胞协同使用的单克隆抗体包括但不限于CD20、CD52、Her-l/2、EGFR、 VEGF、CD117 或 PD-1 等。
[0046]第四方面，本发明还提供了根据第三方面所述的细胞在制备预防和/或治疗和/或 辅助治疗恶性肿瘤或者病毒感染性疾病的药物中的用途。
[0047]根据本发明，所述恶性肿瘤包含但不限于肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠 癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰 腺癌或前列腺癌中的任意一种。
[0048]本发明中，所述细胞与单克隆抗体联合使用。
[0049] 优选地，所述单克隆抗体为CD20、CD52、Her-l/2、EGFR、VEGF、CD117或PD-l中的任 意一种或至少两种的混合物。
[0050] 本发明设计的嵌合Fc γ Rma基因的免疫细胞，体外扩增后回输患者体内，补充有 功能的ADCC效应细胞，在单克隆抗体药物的介导下特异性识别肿瘤细胞，同时通过CAR分子 起到对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0051] 单克隆抗体的临床应用需要大量的抗体，而本发明可以使治疗性单克隆抗体与效 应细胞预先结合，即，在冻存T或NK细胞前预先用相应的治疗性抗体孵育细胞之后冻存，解 冻后直接回输使用，提高了抗体的使用效价，ADCC效应最大值在0. Uig/ml治疗性抗体，大大 减少了临床抗体的用量。
[0052]含有该发明嵌合基因的工程化免疫细胞可与治疗性抗体结合，提升单抗的临床治 疗效果。同时本发明嵌合基因修饰的免疫细胞在有抗体存在的情况下可以在体内扩增，所 以可以通过控制注射的抗体的剂量，从而可控性地杀伤肿瘤细胞，避免常规CAR分子治疗带 来的细胞因子风暴。
[0053] CART细胞虽然在临床治疗中表现出安全性和有效性，但是目前应用范围不广，只 在血液肿瘤中表现出较好的治疗效果，然而本发明的CAR分子可用于多种肿瘤的治疗，同时 又能够发挥CAR分子对多种肿瘤细胞的高效杀伤功能，克服了CART在治疗多种肿瘤时肿瘤 特异性抗原的局限性问题。
[0054] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0055] (1)本发明在优化CAR分子结构的基础上，设计了作用位点为Fc γ Rma的CAR分子， 其采用将FcyRHIa细胞外区域直接与⑶8α跨膜区域连接，删除了常规CAR分子⑶8α铰合区 的独特设计，不仅可与多种不同的单克隆抗体药物联合使用，用于多种肿瘤的治疗，同时与 含有CD8a铰合区的结构相比，其更有利于激活效应细胞，能更进一步发挥CAR分子对肿瘤细 胞的高效杀伤功能，在效靶比5:1时其细胞杀伤率可高达90%以上。
[0056] (2)本发明设计的嵌合Fc yRIIIa基因的免疫细胞，体外扩增后回输患者体内，补充 有功能的ADCC效应细胞，在单克隆抗体药物的介导下特异性识别肿瘤细胞，同时通过CAR分 子起到对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0057] (3)本发明可以使治疗性单克隆抗体与效应细胞预先结合，即，在冻存T或NK细胞 前预先用相应的治疗性抗体孵育细胞之后冻存，解冻后直接回输使用，提高了抗体的使用 效价，大大减少了临床抗体的用量;另外，其冻存复苏后仍能达到90%以上的细胞活率。
[0058] (4)本发明设计的嵌合FcyRHIa基因的免疫细胞在有抗体存在的情况下可以在体 内扩增，通过控制注射的抗体的量，从而能够可控性地杀伤肿瘤细胞，避免常规CAR分子治 疗带来的细胞因子风暴。
【附图说明】
[0059] 图1是本发明嵌合基因的结构示意图。
[0060] 图2是本发明的嵌合基因 Fc yRina-BB^在慢病毒表达载体pLVX-EFla载体上用 BamHl和Sail双酶切后释放的目的基因部分，目的基因片段1269bp，泳道1为核酸分子量标 准，泳道2为BamHl和Sail双酶切产物。
[0061 ] 图3是采用Western Blotting检测嵌合Fey Rma-ΒΒ-ζ基因的T细胞中内源性CD3 和融合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ的表达结果图，泳道1为未转染的T细胞作为阴性对照，泳道2为 5Μ0Ι慢病毒转染的Τ细胞，泳道3为10Μ0Ι慢病毒转染的Τ细胞。
[0062]图4是采用流式细胞仪检测病毒转导效率结果图；其中，图4-Α为CD3PE和CD16FITC 双标散点图，表示所培养的细胞为CD3阳性，CD3阳性细胞中有83.57 %为CD 16阳性，说明病 毒转导效率为83.57%;图4-B为⑶16FITC直峰图，表示在总细胞中的转导效率。
[0063]图5是采用流式细胞术检测CD3G的磷酸化水平结果图，其中图5-A是Fc γ Rma-CD8 α-ΒΒ-ζ的磷酸化水平，图5-B是Fc γ Rma-ΒΒ-ζ的磷酸化水平。
[0064]图6是本发明的嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ对靶细胞的杀伤能力测试图，其中，图6-Α 中是嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ对靶细胞Raji的杀伤能力测试图；图6-Β是嵌合基因 Fc γ Rm a-ΒΒ-ζ对靶细胞SK0V3的杀伤能力测试图；图6-C是嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ对靶细胞ANTI 的杀伤能力测试图；图6-D是嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ与CD8aleader-Fc γ Rma-CAR分别对 靶细胞的杀伤能力测试图。
[0065] 图7是本发明的嵌合基因？〇丫1?11^-88气对1^〇丨、31(0￥3和六阶1三种细胞的1?1丫 分泌水平的检测图。
[0066]图8是本发明嵌合Fey Rma-ΒΒ-ζ基因的NK92细胞的杀伤能力图。
[0067]图9是本发明制备的F