c γ Rma-ΒΒ-ζ-NK细胞冻存前和冻存后的细胞活率比较图。 [0068]图10是本发明制备的Fc yRIIIa-ΒΒ-ζ-ΝΚ细胞冻存前和冻存复苏后的细胞杀伤能 力比较图。
[0069] 下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代 表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
【具体实施方式】
[0070] 下面结合附图并通过【具体实施方式】来进一步说明本发明的技术方案。
[0071] 为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的 实施例如下：
[0072] 图1示出了本发明嵌合基因的结构，该FcyRHIa-CAR分子结构具体为：
[0073] Kozak-Fc γ Rma信号肽-Fc γ Rma细胞外区域-CD8a跨膜区域-4-1ΒΒ-〇)3ζ
[0074] 本发明中的嵌合基因不含有⑶8α铰合区，其是采用Fey Rma细胞外区域直接与 ⑶8α跨膜区域连接而成。
[0075] 实施例1Fe γ Rma-ΒΒ-ζ慢病毒表达载体的限制性内切酶BamH/Sall双酶切鉴定
[0076] 图2是嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ在慢病毒表达载体pLVX-EFla载体上用BamHl和 Sail双酶切后释放的目的基因部分，目的基因片段1269bp。泳道1为核酸分子量标准，泳道2 为BamHl和Sail双酶切产物。
[0077]将双酶切鉴定正确的质粒送上海生工生物工程有限公司对插入的嵌合基因片段 进行测序。将测序测序正确的质粒命名为pLVX-Fc γ Rma-ΒΒ-ζ。
[0078] 实施例2Fc γ Rma-ΒΒ-ζ慢病毒的制备
[0079] Fc γ Rma-ΒΒ-ζ嵌合基因如本发明所述进行设计和构造。嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ 的慢病毒制备和纯化采用如下所述方法：
[0080] 1 ·米用Qiagen EndoFree Plasmid Maxi Kit抽提质粒；
[0081 ] 2.预先准备100mm培养皿的293T细胞；
[0082] 3.将细胞用胰酶消化后，用电动移液器吸取10ml完全培养基，将所有细胞吹打成 单细胞悬液，按比例转到其他100mm培养皿中；37°C，5%C02培养箱过夜；
[0083] 4.细胞融合度在70 %-80 %时转染；
[0084] 5.细胞换液，全量替换为新鲜无血清DMEM培养基；
[0085] 6.配制质粒混合液:取一个新的1.5ml离心管，加入0.5mL DMEM和质粒；
[0086] 7.配制ΡΕΓ混合液:取一个新的1.5ml离心管，加入0.5mL DMEM和30μ1 PEI，混匀；
[0087] 8.将PEI混合液加到质粒混合液中，混匀，室温静置15min;
[0088] 9.取一皿细胞，将离心管中的1ml混合液滴加进去，尽可能使转试剂分布到整个培 养皿中；
[0089] 10.将培养皿放还到5 % C02培养箱中，放置6h;
[0090] 11.转染6h后换液，换成10ml完全培养基；
[0091 ] 12.转染48h后，将同一个病毒包装上清液收集到一起，丢弃培养皿；
[0092] 13.分装到50ml离心管中，500g室温离心10min，除去细胞和大的碎片；
[0093] 14.用0.22μΜ针式滤头过滤上清液，置于4°C，待纯化；
[0094] 15.使用AKTA flux 6机器，5L病毒0.65μπι中空纤维微滤柱过柱；
[0095] 16.使用AKTA flux 6机器，病毒300kD中空纤维超滤柱过柱；
[0096] 17.病毒浓缩至200ml;
[0097] 18.使用AKTA pure 150Protein Purification System进行病毒纯化；
[0098] 19.病毒用50ml PBS洗脱；
[0099] 20.病毒用0.22μΜ的滤头过滤，病毒管分装。
[0100] 慢病毒包被体系包括但不限于三质粒表达系统和四质粒表达系统，本实施例中优 选四质粒表达系统（目的质粒、pRRE、pREV、VSVG)。
[0101] 慢病毒纯化体系包括但不限于超速离心法、透析法、超滤法等，本发明优选中空纤 维超滤法。
[0102] 实施例3嵌合Fc yRina-BB-G基因的细胞产物的制备
[0103] 细胞来源于患者或者健康供者，采用静脉采血方式或者血液成分单采术获得外周 血单个核细胞(PBMChT细胞培养方法采用⑶3、⑶28单克隆抗体包被培养瓶活化T细胞方 法，或者采用包被有CD3和CD28单克隆抗体的顺磁聚丙乙烯珠 T细胞活化方法，NK细胞培养 方法如所述进行(Hiroyuki等，Cancer Res 2009; 69:4010-4017)。慢病毒转导如文所述操 作（Levine等，2006，Proc Natl Acad Sci USA103:17372-17377)。
[0104] 实施例4流式细胞术检测嵌合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ修饰的T细胞表型鉴定
[0105] 采用实施例3的方法培养Τ细胞至第14天，Western Blotting检测嵌合Fc γ RHIa- ΒΒ-ζ基因的T细胞中内源性⑶3和融合基因 Fc γ Rma-ΒΒ-ζ的表达。如图3所示。
[0106] 图3示出了转染融合基因 Fey Rma-ΒΒ-ζ慢病毒的Τ细胞，用Western Blotting检 测内源性CD3和融合蛋白的表达。泳道1为未转染的T细胞作为阴性对照，泳道2为5M0I慢病 毒转染的T细胞，泳道3为10M0I慢病毒转染的T细胞，内参为β-actin。结果显示成功表达融 合蛋白。
[0107] 实施例5病毒转导效率检测
[0108] 10M0I融合基因 Fey Rma-ΒΒ-ζ慢病毒感染T细胞5天，取样做流式细胞仪检测 ⑶3PE、⑶16FITC表达，⑶16表达量表示慢病毒的转导效率。
[0109] 如图4-A和4-B所述，CD16的表达量为83.57%，即融合基因 Fey Rma-ΒΒ-ζ慢病毒 的转导效率为83.57%。
[0110] 实施例6流式细胞术检测⑶3ζ的磷酸化水平
[0111] 采用同一供者来源的PBMC，10M0I融合基因 Fey Rma-ΒΒ-ζ慢病毒感染Τ细胞，培养 至第5天。对照组采用10M0I融合基因 Fc γ Rma-⑶8α-ΒΒ-ζ慢病毒感染T细胞，培养至第5天。 取CD20阳性的Raji细胞1 X 105,加入lμg/ml的Rituximab抗体，与转染后培养到第5天的Τ细 胞1 X 106共孵育2小时。流式细胞术检测CD3G的磷酸化水平。结果如图5所示。
[0112] 如图5-A所示，Fc γ RIIIa-CD8a-BB-G磷酸化水平为50 · 45 %，如图5-B所述，Fc γ Rm a-ΒΒ-ζ磷酸化水平为79.77%，两者有明显差异。说明本发明所设计的CAR分子结构Fey Rm a-ΒΒ-ζ较已有技术Fc γ RIIIa-CD8a-BB-G更有利于0)3ζ的磷酸化，有利于转染的T细胞的活 化，预示着对肿瘤细胞更高的杀伤能力。
[0113] 实施例7细胞杀伤试验
[0114] 抗体孵育的浓度为 0 · lμg/ml，Ε:Τ = 5:1、2.5:1、1.25:1、0.6:1、0.3:1，5 种靶效比 情况下对Raji细胞（CD20+，rituximab)、SK0V3细胞（Her2+，trastuzumab)、ΑΝΤ1细胞（CCR4 +，mogamulizumab)的杀伤能力分析。
[0115] 结果如图6-A、图6-B和图6-C所示，在不同的效靶比的情况下，针对Ra j i、SK0V3和 ANTI三种细胞，在相应的抗体0. lμg/ml共同孵育的情况下，本发明Fc γ Rma-ΒΒ-ζ对靶细胞 的杀伤能力都明显优于Fc γ RIIIa-CD8a-BB-G。
[ΟΙ1 ?] 图6-D示出了在不同的效革Ε1比的情况下，针对Ra j i细胞，在ri tuximab抗体0 . lyg/ ml共同孵育的情况下，Fc yRHIa signal peptide-Fc yRHIa-CAR对革巴细胞的杀伤能力明显 优于⑶8aleader-Fc γ Rma-CAR。所以本发明优选Fc γ Rma信号肽作为信号肽，而不用常规 的⑶8α前导序列。
[0117] 实施例8检测IFN-γ分泌量
[0118] 抗体孵育的浓度为0 · lμg/ml，E: Τ = 1:1情况下对Raji细胞(CD20+，rituximab)、 SK0V3细胞（Her2+，trastuzumab)、ANT1细胞（CCR4+，mogamulizuma