达情况。结果显示，细胞数目 为1.5X104细胞/孔时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图8中的A图所示。 [0053] (3.5.2汨1￥药物司他夫定敏感性与病毒101相关实验 铺板96孔板huh7.5细胞，每孔20000个细胞，共设置10个实验组，当细胞汇合度达到 80%时，计数每个实验组孔中的细胞数目，按照每孔细胞数目计算当Μ0Ι分别为2、4、6、8、 10、12、14、16、18、20时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，并将上述所需 病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液，加入到96孔huh7.5细胞中。 感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶基因表达活性。结果显示，Μ0Ι为10时，药物浓度和荧 光素酶的活性相关性最佳。结果如图8中的B图所示。
[0054] (3.5.3)HIV药物司他夫定敏感性与病毒感染时间相关实验 铺板96孔板huh7.5细胞，分4组，每组20000个/孔，当细胞汇合度达到80 %时，按照每孔 细胞数目计算M0I = 10时所需要的病毒液体积。配制不同药物浓度的司他夫定，并将上述所 需病毒液加至不同浓度的药物中。将配制好的药物与病毒混合液，加入到96孔huh7.5细胞 中。分别于病毒感染36、48、60、72小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，感染时间 为60小时时，药物浓度和荧光素酶的活性相关性最佳。结果如图8中的C图所示。
[0055] (3.5.4)十二种抗病毒药物用于表型耐药检测的可重复性 通过测定12种抗病毒药物IC50的药物浓度来判断表型耐药检测的稳定性和可重复性。 根据上述3个实验，确定了用于表型耐药检测时的细胞数目、Μ0Ι以及病毒感染时间。铺96孔 板，当细胞汇合度达到80%时，按照每孔细胞数目计算Μ0Ι = 10时所需要的病毒液体积。与 此同时，用DMEM完全培养液配制不同药物浓度的HIV药物，将配置好的药物与病毒混合液， 加入到96孔huh7.5细胞中。感染60小时后，检测每孔细胞荧光素酶活性。结果显示，除了2种 药物(利匹韦林和依曲韦林)大部分药物都显示较高的重复性。结果如表7所示，其中，IC50， 能够使ZsGreen阳性细胞减少50 %的药物浓度;SD，标准差;CV，变异系数。
[0056] 表7十种药物用于表型耐药检测的可重复性
(3.5.5)病人体内HIV-1毒株的表型耐药分析 8名患者的HIV-1样本用本发明中带有双报告基因的重组慢病毒系统进行表型耐药分 析。野生型的慢病毒作为对照。病毒抑制率（％ ) = ( 1-药物处理组的荧光素酶RLU/对照组的 荧光素酶RLU)X100%。用非线性回归分析每个HIV-1毒株的ICSOAIV-l毒株对每种抑制剂 的表型耐药程度用倍数变化(FC)来表示，即测试株的IC50/野生株的IC50。校正的用于表型 耐药的分类标准:FC〈3为敏感，FC = 3-6为低度耐药，FC = 6.01-10为中度耐药，FC>10为高度 耐药[6,22,23]。表4呈现了6种6冊1'18(0丨(1&11〇8；[116,3七&￥11(1;[116,2丨(10￥11(1;[116,2&1(3；^&13；[116， Emtricitabine，Abacavir Sulfate)，4NNRTIs(Nevirapine，Etravirine，Dapivirine， Rilpivirine)及2种PIs(Nelfinavir and Lopinavir)的表型耐药情况。Zalcitabine(DDC) 和Dapivirine(DPV)两种药物在现有数据库中无基因型耐药情况分析。对10种药物的表型 耐药与基因耐药结果进行分析，表明，大部分一致(表8)。例如，HIV-1毒株0022表型耐药分 析对DDI和D4T两种药物敏感，但是基因型耐药分析显示为中度或高度耐药，毒株0312对ETR 表型耐药分析为高度耐药，但基因型分析为低度耐药。
[0057] 表8HIV-1毒株的基因型和表型耐药分析比较
[0058]以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技 术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种转移质粒，其特征在于，其结构如图1所示。2. -种如权利要求1所述的转移质粒的构建方法，包括以下步骤:使用BamH I和Κρη I 双酶切pMD2. G质粒，回收酶切产物，收取119bp CMV片段;将pHAGE-EFla-IRES-ZsGreen质粒 用BamH I和Κρη I进行双酶切，回收4736bp pHAGE-IRES-ZsGreen片段;将回收的CMV片段和 pHAGE-IRES-ZsGreen用T4 DNA连接酶进行连接，连接成功后，提取的质粒命名为pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen质粒；使用Ncol和Xbal双酶切PGL3-Promoter Vector，回收 1906 bp Luciferase 片段，pHAGE-CMV-IRES-ZsGreen 质粒用 Ncol 和 Xbal 双酶切，回收4855bp 的片段， 将该片段和Luciferase片段用T4 DNA连接酶进行连接；连接成功后，提取的质粒即为 pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen 〇3. -种重组慢病毒，其特征在于，是包装质粒、包膜质粒和如权利要求1所述的转移质 粒共转染293FT细胞或293T细胞后得到的包装体;其中，所述包装质粒为psPAX2m-pol质粒。4. 根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m-pol质粒结构如图3所 不。5. 根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m-p〇l质粒序列如SEQ ID No .6所示。6. 根据权利要求3所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m-p〇l质粒的构建方法， 包括以下步骤： psPAX2载体重建:利用长引物法突变psPAX2载体的酶切位点Agel，获得psPAX2-l载体； 利用定点突变试剂盒突变PSPAX2-1载体的酶切位点Apal，获得psPAX2-2载体;Dpnl酶切 psPAX2-2载体，酶切产物转化XL 10-G0LD感受态细胞，质粒提取，Apal酶切该质粒，挑取酶 切产物鉴定测序，获得psPAX2m载体，其序列如SEQIDN 0.4所示； psPAX2m-pol质粒构建：利用PCR扩增pol片段，其序列如SEQIDNo.5所示；用ApaI和 Agel酶切扩增后的pol片段回收并插入psPAX2m载体，得到psPAX2m-p〇l质粒，其序列如SEQ ID No .6所示。7. 根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2-l载体的序列如SEQ ID No. 2所示。8. 根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2-2载体的序列如SEQ ID No. 3所示。9. 根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述psPAX2m载体的序列如SEQ ID No. 4所示。10. 根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述长引物法突变psPAX2载体所 用的引物为Age I-F和Age I-R，其中， AgeI-F：CGAAGAGCTC ATCAGAACAG TCAGACTCAT CAAGCTTCTC TATC； AgeI-R：CTGCTAGCTA TAGTTCTAGA GGTATCGGTT GTTTCGAGCT TATAG； 模板为 psPAX2，PCR 条件:94°C 预变性 4min，94°C 变性 2〇8、55°(：退火2〇8、72°(：延伸11^11， 循环35次，最后72°C延伸5min; 所述利用定点突变试剂盒突变PSPAX2-1载体所用的引物为M-Apal-F和M-Apal-R;其 中， M-ApaI-F：GCC TTG AGG GGC CTC CGG GGA CGG CCC TTT GTG CGG GG M-ApaI-R：CCC CGC ACA AAG GGG CCG TCC CGG AGC CCC CTC AAG GC； 模板为psPAX2-l，PCR条件：95°C预变性2 min，95°C变性30 sec，55°C退火lmin，68°C延 伸lOmin，循环18次。
【专利摘要】本发明公开了一种转移质粒，其结构如图1所示。本发明还公开了一种转移质粒的构建方法及重组慢病毒。该转移质粒，其报告基因Luciferase与ZsGreen位于pHAGE-CMV-Luc-IRES-ZsGreen上，且由CMV启动子控制报告基因Luciferase与ZsGreen的表达，使得HIV-1抑制剂的抗病毒效果能够简易地通过在倒置荧光显微镜下观察到或通过测定荧光素酶活性而获得，将pol区导入后，多种细胞用具有此转移质粒的重组慢病毒均可进行耐药性检测。
【IPC分类】C12R1/93, C12N15/66, C12N15/63, C12N7/01
【公开号】CN105647947
【申请号】
【发明人】黎诚耀, 翁云层, 张玲, 李金峰
【申请人】南方医科大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2015年12月30日