?表示重组菌K. oxytoca HD79-02的葡萄糖消耗，▲ 表示出发菌株K.oxytoca HD79的2,3-丁二醇产量，Λ表示重组菌K.oxytoca HD79-02的2， 3_ 丁二醇产量。
【具体实施方式】
[0044] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0045] 一:本实施方式提高2,3_ 丁二醇产量的产酸克雷伯氏基因工程菌株 的构建方法，按以下步骤进行：
[0046] -、敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建；
[0047] 二、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建；
[0048] 三、pack-L 和 pack-R 质粒构建；
[0049] 四、pack-LR质粒构建；
[0050] 五、pT_Kanr质粒构建；
[0051 ] 六、同源重组片段ackL-Kanr_ackR的构建；
[0052] 七、K.oxytoca HD79_01/pKD46菌株构建；
[0053] 八、同源重组片段ackL_Kanr-ackR转化K.oxytoca HD79_01/pKD46〇
[0054] 本实施方式首先PCR扩增ack基因同源左臂片段ack-L产物与目的片段大小相符约 308bp，将ack-L基因片段连接入pMD18-T质粒载体，构建pack-L质粒，经PCR验证及Bgl II、 Xho I双酶切验证上述质粒载体构建正确。PCR扩增ack基因同源右臂片段ack-R产物与目的 片段大小相符约312bp，将ack-R基因片段连接入pMD18-T质粒，构建pack-R质粒，经PCR验证 及Xho I、BamH I双酶切验证上述质粒载体构建正确。以质粒载体pET-28a( + )为模板，利用 Kan-up和Kan-down为引物对卡那霉素抗性基因进行PCR扩增。PCR扩增卡那霉素抗性基因 (Kan〇产物与目的片段大小相符约813bp，与设计的预期相符。将Kaf基因片段连接入 pMD18-T质粒载体，构建pT-Kan1·质粒，经PCR验证及Xho I酶切验证质粒载体构建正确。以 pack-LR为骨架，在ack基因同源臂插入打断基因 Karf;经Xho I与EcoR I酶切验证正确。电 转化质粒pKD46到Klebisella oxytocaHD-79-Ol构建Klebisella oxytocaHD_79-〇2/ pKD46;将同源重组片段ldhL-Cnf-ldhR转化到经L-阿拉伯糖诱导的K.oxytoca HD-79/ PKD46中，以达到敲出乳酸脱氢酶基因的目的。
[0055] 本实施方式中每个步骤的具体内容及结果如下：
[0056] 1、敲除ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01的构建：
[0057] 一、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建：
[0058] 以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh-L!、ldh-L2和ldh-R!、ldh-R2 引物进行PCR反应；
[0059] 二、pldh-L 和 pldh-R 质粒构建：
[0060] 向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25yL 5UAiL的 TaqDNA聚合酶，72°C水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ldh-L和ldh-R，将 片段1 dh-L和1 dh-R分别与pMD 18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为p 1 dh-L和p 1 dh-R;
[0061] 三、pldh-LR质粒构建：
[0062] 以pldh-L为骨架，选用限制性内切酶Xho I和EcoR I对质粒载体pldh-L与pldh-R 分别进行双酶切，用T4DNA连接酶将pldh-R的酶切产物连接到pldh-L质粒载体上，得到重组 质粒pldh-LR;
[0063] 四、pT-Cnf质粒构建：
[0064]以pGP704-Cm为模板（质粒pGP704-Cm购买自普如汀生物技术有限公司，货号 3617178)，利用Cm-up和Cm-down为扩增引物，对Cnf进行PCR扩增，对PCR产物进行TA克隆，得 到pT-Cnf质粒；
[0065] 五、同源重组片段1 dhL-Cm1-1 dhR的构建：
[0066] 以重组质粒pldh-LR为骨架，选用限制性内切酶Xho I对重组质粒pT-Cm"和pldh-LR进行酶切，将获得的Cnf片段插入质粒载体pldh-LR中，构建质粒载体pT-LCR;
[0067] 选择限制性内切酶BamH I与Bgl II对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片 段ldhL-Cmr-ldhR;
[0068] 六、K.oxytoca HD79/pKD46菌株构建：
[0069] 将质粒pKD46电转化到K.oxytoca HD79感受态细胞，得到K.oxytoca HD79/pKD46 菌株；（质粒PKD46购买自普如汀生物技术有限公司，货号Bi〇VeCtorl058)
[0070] 七、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR转化K.oxytoca HD79/pKD46:
[0071] 将同源重组片段ldhL-Cnf-ldhR电转化到K.oxytoca HD79/pKD46中，得到的目的 菌株为高产2，3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytoca HD79-01。
[0072] 步骤一中 ldh-Li 引物序列为5 ' -GGAAGATCTCAGTACGACAAGAAGTATCTG-3 '，ldh-L2引 物序列为5 ' -CCGCTCGAGACCGAAGCCTTTAAGAATGCGCAGC-3 '，ldh-Ri 引物序列为5 ' -CCGCTCGAGCTTCGGTATGCGCCTGCT-3 '，ldh-R2引物序列为5 ' -GGAGGATCCTCAGACCAGCGCGTTAGGG-3，。
[0073] 步骤一中PCR反应体系如下：
[0074]
[0075] PCR扩增的反应程序为：
[0076]
[0077] 步骤四中 Cm-up 引物序列为5 ' -CCGCTCGAGGCTTGCGCAGACCAAAACG-3 ' 和Cm-down 引 物序列为5 ' -CCGCTCGAGGCAGGCATGCAAGCTTGGT-3 '。
[0078] 步骤四中PCR反应体系如下：
[0079] -
[0080]
[0081 ] PCR反应程序如下：
[0082]
[0083] 2、ack基因同源左臂片段ack-L和右臂片段ack-R的构建
[0084]以敲除了 ldh基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株HD79-01基因组DNA为模板，分别 用ack-Li、ack_L2和ack-Ri、ack_R2引物进行PCR反应，引物序列如表1，反应体系如表2，反应 程序如表3,结果如图1。
[0085] 表1引物序列
[0086]
[0087] 表2 ack左臂和右臂扩增的PCR反应体系组分
[0088]
[0089] 表3右臂和左臂PCR扩增的反应程序
[0090]
[0091 ] 3、pack_L 和 pack-R 质粒构建
[0092]向含有乙酸激酶基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25yL Taq (5U/yL)DNA聚合酶，72°C水浴中反应lOmin。将目的条带胶回收纯化，获得的ack的左臂和右 臂与PMD18-T载体在16°C水浴中过夜连接，即进行"TA"克隆，反应体系如表4。获得克隆载体 分别命名为pack-L和pack-R。将其转入到转化至E.coli DH5a中。分别挑取5株白色菌株进 行PCR鉴定和酶切验证，反应体系如表5和表61CR验证ack-L结果如图2所示：1-5号阳性克 隆扩增得到的片段长度均与ack-L片段大小相符，为308bp;ack-R结果如图3所示：1-5号阳 性克隆扩增得到的片段长度均与ack-R片段大小相符，为312bp。质粒载体pack-L与pack-R 构建成功。
[0093] 表4 ack的左臂和右臂连接体系组分 [0094]
[0095] 表5 ldh的左臂和右臂菌液PCR验证反应体系组分
[0096]
[0097] 表6 pack-L和pack-R酶切验证反应体系
[0098]
[0099]
[0100] 4、pack-LR 质粒构建
[0101]以pack-L为骨架，选用限制性内切酶Xho I和Bgl II对质粒载体pack-L进行酶切， 选用限制性内切酶Xho I和BamHI对质粒载体pack-R进行酶切，用T4DNA连接酶将pack-R (Xho Ι/Bgl II)的酶切产物连接到pack-L(Xho I/BamH I)质粒载体上。连接反应在16°C条 件下过夜进行，连接反应体系如表7，反应程序：16 °C，过夜。连接产物转化E. co 1 i DH5a感受 态细胞，抗生素筛选终浓度为(Amp，Kan lOOyg/mL)。对重组质粒的阳性转化子以引物分别 是ackLdPack-R2进行菌液PCR验证及用限制性内切酶Bgl II和BamH I酶切验证。根据图上 结果表明重组质粒p 1 dh-LR构建成功。
[0102] 表7骨架载体pack-L与目的基因 ack-R连接反应体系
[0103]
[0104] 5、pT_Kanr 质粒构建<