br>[0105]本发明克隆卡那霉素抗性基因(Kan〇将其作为打断基因，插入乙酸激酶基因的同 源序列中，使乙酸激酶基因失活。同时，Karf也可作为后续工程菌株的筛选标记。以pET-28a (+)为模板，利用Kan-up和Kan-down为扩增引物(序列如表1)，对Karf进行PCR扩增。PCR反应 体系如表2,反应程序如表8^0?结果见图4^CR产物加"A"、目的条带胶回收纯化、"TA"连 接、E.coli DH5a感受态细胞的制备及连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞，筛选(含Amp， Kan终浓度为100yg/mL)菌落，接种到LB液体培养基培养。对阳性克隆子进行菌液PCR验证。 用限制性内切酶Xho I对阳性重组质粒进行酶切验证，酶切反应体系见表9。菌液PCR结果见 图5。
[0106] 表8 Kan"扩增的PCR反应程序
[0109] 表9 pT-Karf酶切验证反应体系 [0110]
[0107]
[0108]
[0111]结果如图5所示：1-5号阳性克隆扩增得到的片段长度均与Karf片段大小相符，为 813bp。重组质粒pT-Kan1'构建成功。
[0112] 6、同源重组片段ackL-Kanr-ackR的构建
[0113] 构建最终的同源重组片段ackL-Kar^-ackR前，先行构建了 pack_LR、pT_LKR，其中 pack-LR是将部分ack左右同源臂基因整合在一起的质粒，已构建完;pT-LKR是以pack-LR为 骨架载体，在ack同源臂中间插入了打断基因 Karf;然后通过酶切的方法获得同源重组片段 ackL_Kanr-ackR 〇
[0114] (1)以重组质粒pack-LR为骨架，选用限制性内切酶Xho I对重组质粒pT-Karf和 pack-LR进行酶切，将获得的Kan"片段插入质粒载体pack-LR中，构建成质粒载体pT-LKR。 pack-LR和pT-Kan11选择二者共有酶切位点Xho I，对重组质粒pack-LR和pT-Kan11分别进行酶 切，酶切反应体系见表8。酶切反应条件均为37°C下作用4h。琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物， 胶回收并纯化目的条带。经酶切反应后，条带大小与重组质粒pack-LR(3322bp)相符，说明 pack-LR酶切成功。条带大小分别与Karf片段(813bp)和pMD18-T(2692bp)相符，说明pT-Karf 酶切成功。两者的酶切产物pack-LR和Karf经胶回收纯化后可用于后续构建pT-LKR试验。
[0115] 用T4DNA连接酶将pT-KanXXho I)的酶切产物Karf连接到pack-LR(Xho I)质粒载 体上，连接反应在16 °C条件下过夜进行，连接产物转化E. co 1 i DH5a感受态细胞，抗生素筛 选终浓度为Amp 100yg/mL和Kan 100yg/mL。挑取菌落，接种到LB液体培养基(含Amp 100yg/ mL和Kan 100yg/mL)中，37°C，150r/min过夜培养。对阳性克隆子进行菌液PCR验证。结果见 图6。引物分别是ack-LdPack-R 2。用限制性内切酶Bgl II和BamH I对阳性重组质粒进行酶 切验证。验证正确阳性重组质粒命名为pT-LKR。
[0116] 如图6所示：泳道1-2均在lOOObp和2000bp之间有一清晰的条带，与ackL-Kan"- ackR(去除骨架pMD18-T部分）即ack-LRJarf片段大小之和相符，为1433bp，初步说明目的 基因 ackL-Karf-ackR连接到pMD18-T克隆载体上。用限制性内切酶Bgl II和BamHI酶切重组 质粒pT-LKR，结果显示重组质粒pT-LKR被Bgl II和BamH I完全酶切在约lOOObp和2500bp处 产生两条清晰的条带，其大小分别与骨架pMD18-T(2692bp)和目的片段ackL-Kaf-ackR (1433bp)相符，进一步证明重组质粒pT-LKR构建成功。
[0117] (2)构建的质粒载体pT-LKR含有完整的基因敲除序列，即同源基因中插入了打断 基因的序列。对质粒载体pT-LKR进行酶切，可获得用于ack基因敲除的同源序列，即为同源 重组片段ackL-Kaf-ackR。选择限制性内切酶BamH I与Bgl II对重组质粒pT-LKR进行酶 切。验证正确的线性片段命名为ackL-Karf-ackR。
[0118] 选用限制性内切酶Bgl II和BamH I对重组质粒pT-LKR进行酶切，其结果显示重组 质粒pT-LKR被Bgl II和BamH I完全酶切在2500bp左右处产生两条清晰的条带，其大小分别 与骨架pMD18-T(2692bp)和目的片段ackL-Karf-ackl^HSSbp)相符，对目的片段进行胶回 收并纯化可用于后续电转化试验。
[0119] 7、K.oxytoca HD79_01/pKD46菌株构建
[0120] 本实施方式选用的同源辅助质粒PKD46(购买自普如汀生物技术有限公司，货号 BioVector 1058)不仅编码ARed重组系统Exo、Bet和Gam三种蛋白因子，并受到L-阿拉伯糖的 诱导表达，而且其本身含有氨苄青霉素抗性基因筛选标记。K. oxytoca HD79-01电转化感受 态细胞的制备，取纯化后PKD46 10yL与50yL K.oxytoca HD79-01感受态细胞充分混合后， 转移至0.2cm预冷电转化杯中电击。电转化仪电击参数设置为电压1.8kV，电容25yF，电阻 200 Ω。电击结束后，立即用lmL新鲜LB液体培养基悬浮电转化杯内的菌液，30°C、150r/min 摇床培养4h。菌液6000r/min离心3min收集菌体。用lOOyL LB液体培养基重悬浮沉淀，然后 涂布于含有2mg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，30 °C恒温培养过夜。挑取转化的单菌落，接 种于20mL LB培养基中（含2mg/mLAmp和150ug/mLKan)，30°C振荡培养12-16小时或过夜，保 菌。
[0121] 8、同源重组片段ackL-Kanr-ackR转化K.oxytoca HD79-01/pKD46
[0122] 将同源重组片段ackL-Kaf-ackR电转化到含有经过5mM L-阿拉伯糖诱导的同源 辅助质粒PKD46的K.ocytoca HD79-01宿主菌中，使其与宿主菌中的乙酸激酶基因发生区域 同源重组，以达到敲除乙酸激酶基因的目的。ackL-Karf-ackR电转化K.oxytoca HD79-01/ PKD46方法同质粒pKD46转化K.ocytoca HD79-01。得到的目的菌株为高产2，3-丁二醇的产 酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytoca HD79-02。
[0123] 9、重组菌株K.oxytoca HD79-01 产2,3-丁二醇实验
[0124] 重组菌株K.oxytoca HD79-02和出发菌株K.oxytoca HD79分别接种到种子培养基 中30°(：，15(^/1^11培养至对数生长期，以5%接种量分别转接到，装液量为15〇1111750〇1^发酵 培养基中，底物葡萄糖15(^/1，30°(：，15(^/1^11发酵15611后结束。每隔1211取样，测定其?!1和 。样品经处理后，经高效液相色谱检测乳酸、乙酸、2，3-丁二醇产量和葡萄糖浓度。 结果如图7和图8。
[0125] 由图7可知原始菌株K· oxytoca HD79生长速率快，在60h达到最大0D6QQr?为0 · 820， 但随着发酵时间的延长逐渐趋于平稳。而重组菌株κ. oxytoca HD79-02生长缓慢，在60h后 便趋于稳定，但均小于相应时刻的对照菌株。两者的pH值变化均处于下降趋势，但是重组菌 株K.oxytoca HD79-02发酵液中的pH略高于原始菌株，介于0.005和0.235之间，原因可能是 重组菌株K.oxytoca HD79-02敲除ldh和ack基因致使酸性产物乳酸和乙酸的产量下降，导 致发酵液中pH略微升高。
[0126]从图8可知，重组菌株的葡萄糖消耗速率明显高于原始菌株，重组菌株在发酵84h 时葡萄糖消耗量达到最大值为97.4g，而原始菌株在发酵156h，达到最大值为90.5g。对2，3-丁二醇的产量变化来说，重组菌株K. oxytoca HD79-02在72h，2，3-丁二醇的产量最大值为 46.21g/L，而此时对于同等条件下发酵的重组菌株K. oxytoca HD79-01来说，其2，3-丁二醇 的产量为33.94g/L，说明由于乙酸代谢途径的敲除，将多余碳流量也流向了2,3_丁二醇途 径。原始菌株K. oxytoca HD79则在发酵96h时2，3-丁二醇产量达到最大值为29.83g/L，重组 菌株的2，3-丁二醇的产量为38.81g/L，重组菌株是原始菌株的1.3倍。同样是选取2，3-丁二 醇产量最高的时间点作比较，即重组菌株72h的2,3_ 丁二醇产量是原始菌株96h的2,3_ 丁二 醇1.55倍，差异显著(p〈0.05)。此时，重组菌株2，3-丁二醇的产量的生产强度为0.64g/L · h，转化率为0.47g/g，原始菌株的2,3_丁二醇的产量的生产强度为0.31g/L · h，转化率为 0.39g/g，分别提高了 106.5%和20.5%。差异显著(p〈0.05)。在2,3_ 丁二醇产量出现峰值以 后，葡萄糖还继续消耗，这是由于葡萄糖继续用于其它代谢产物的生成。另外，2,3_丁二醇 纯度由57.9%增加到71.2%。
【主权项】
1. 高产2,3-下二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按W 下步骤进行： 一、 敲除1化基因的产酸克雷伯氏基因工程菌株皿79-01的构建； 二、 ack基因同源左臂