器:B⑶-228CH冰箱(新飞电器），HH-2数显恒温水浴锅(华峰仪器），SmartGe凝胶 成像仪(北京赛智创业），GT9612梯度PCR仪(百泰克生物），WD900SL23-2型号微波炉(格兰仕 电器），DG-300C型电泳仪(鼎国昌盛生物)等。
[0059] 试剂:NEP004-1DNA提取试剂盒（鼎国昌盛生物），50bp DNA Ladder(莱风生物），2 XTaq PCR Mix(莱风生物），MspI(Thermo)，琼脂糖（SIGMA)等。
[0060] 1.2引物设计
[0061 ] 在NCBI的dbSNP数据库中，查找HOTAIR rs920778的核苷酸序列，在引物设计软件 Primer Premier 6.0中，设置引物长度和扩增目的片段长度等参数进行引物设计，根据GC 含量和退火温度等选择最优上下游引物，并将反向引物序列中倒数第二位碱基为错配碱基 C(该碱基在人HOTAIR基因序列中的相应位置为T)，因此错配后PCR产物中多态附近序列由 CCGT或CTGT更改为CCGG或CTGG(其中第二个碱基C/T多态位点，第四个碱基G为错配碱基）。 因此扩增产物中C等位基因片段可被识别CCGG序列的限制性内切酶MspI识别（即C等位基因 片段可被内切酶切开）。再将此引物与Pubmed中的Blast序列比对功能（http:// blast .ncbi.nlm. nih.gov/Blast · cgi)进行引物比对，最终确定的上下游引物为正向引物 序列：5'-AAAGAAATAAAACCAAGCCTCCTAC-3'，反向弓| 物序列：5'_ TACAGCTTAAATGTCTGAATGTTCC-3'。
[0062] 1.3限制性内切酶的选择
[0063] 根据dbSNP中rs920778位点的碱基序列，用WatCut在线限制性内切酶分析软件，在 线搜索获得可识别突变位点的限制性内切酶的信息，综合考虑其酶切特异性及经济适用性 选择最佳的限制性内切酶Msp I。
[0064] 1.4从全血中提取待测样本的基因组DNA
[0065]严格按照离心柱型DNA提取试剂盒操作步骤提取基因组DNA。
[0066] 1)在1.5ml离心管中加入300μ1血细胞后，再加入900μ1细胞裂解液混和均匀，在冰 上放置lOmin后，在离心机中12000rpm离心lmin，弃上清，再次加入900μ1细胞裂解液，用枪 吹起沉淀并混匀后，重复上述步骤；
[0067] 2)向沉淀物中加入600μ1 solution Β溶液，用移液枪轻轻吹起沉淀后，加入10μ1 蛋白酶Κ混匀，在70 °C水浴锅中放置lOmin后，12000rpm离心5min。
[0068] 3)将离心管中的上清转入编过号的新的离心管中，再向新的离心管中加入500μ1 无水乙醇，期间可能会出现絮状沉淀物，该絮状物即为DNA;
[0069] 4)将混匀的液体转入离心柱中（若一次转不完，可分次转入），室温静置2min，再 12000rpm离心lmin，弃废液；
[0070] 5)加入700μ1已加入相应体积无水乙醇的solution C漂洗液，室温静置2min， 12000rpm离心lmin，弃废液；
[0071] 6)加入700μ1已加入相应体积无水乙醇的solution D漂洗液，室温静置2min， 12000rpm离心lmin，弃废液；
[0072] 7)加入500μ1 solution D漂洗液，12000rpm离心lmin，弃废液；
[0073] 8)再次离心2min，将离心柱置于新的编过号的离心管中，敞口放入37 °C恒温箱内 lOmin直至无明显乙醇味；
[0074] 9)在娃基质膜中央加入已经预热到65°C的solution Ε 100μΙ，室温放置5min， 12000rpm离心lmin，重复上述步骤一次，终离心后的液体即为提取出的基因组DNA;
[0075] 10)吸取2μ1提取出的DNA用NanoPhotometer Pearl微量分光光度计测定其浓度和 纯度。
[0076] 2 结果
[0077] 2.1PCR 扩增
[0078] (1)根据提取基因组DNA的浓度，将研究对象的DNA进行稀释，使终浓度为20ygAU。 [0079] (2)PCR扩增体系为2XTaq PCR Mix 7.5μ1、上游引物和下游引物各0.3μ1、模板 DNA Ι.ΟμΙ，最后用双蒸水补充总体积至15μ1。
[0080] (3 )rs920778位点的PCR反应条件:第一个阶段为预变性阶段，94°C /5min;第二个 阶段包括三个步骤共35个循环，依次设置为94°C/35s、58°C退火时间45s、72°C/30s;第三个 阶段 72°C/5min。
[0081 ] 2.2酶切反应
[0082] 酶切体系为PCR扩增产物5μ1、上限制性内切酶0.5μ1、Buffer 1.0μ1，最后用双蒸 水补充总体积至15μ 1。混匀后置于水浴锅中3 7 °C水浴4-16小时。
[0083] 2.3基因型的判定
[0084] 表2 rs920778位点基因型判定
[0085]
[0086] 实施例2.人乳腺癌组织标本测定人HOTAIR rs920778多态性
[0087]与实施例1的步骤基本相同，只是采用下面的方法从乳腺癌组织标本中提取DNA作 为待测DNA。
[0088]使用手机切除乳腺癌组织，酚-氯仿法提取乳腺癌组织基因组DNA作为待测DNA。 [0089] 1)将乳腺癌组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取0 . lg左右的组织碾磨，加入 lml的灭菌水，颠倒混匀，10000转离心10分钟，弃上清。管底应该有沉淀。重复两次
[0090] 2)加入200u 1的DNA裂解液，5u 1的蛋白酶K混匀，55度过夜消化。
[0091] 3)消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液（1:1)，剧烈震荡，使其变成奶咖色。 12000转离心10分钟。
[0092] 4)取上清，注意不要洗到中间介质以及下层液体。加入等体积的氯仿，颠倒混匀。 12000转离心10分钟。
[0093] 5)取上清，注意不要洗到中间介质以及下层液体。加入10分之一的醋酸钠以及2.5 倍的无水乙醇，颠倒混匀。
[0094] 6)12000转离心10分钟。弃上清。
[0095] 7)加入lml 70%乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次。12000转离心10分钟。
[0096] 8)弃上清，然后室温开盖静置分钟使其乙醇挥发干净。
[0097] 9)加入灭菌水溶解DNA，一般加入50ul灭菌水溶解
[0098] 10) -20 °C保存，即得乳腺癌组织基因组DNA
[0099]结果:将酶切产物用3%的琼脂糖凝胶电泳20-40min，至紫外灯下能分清明显的条 带并拍照鉴定。对于不同的基因型，rs920778位点不同基因型展现出不同的条带（见图2)， CC野生基因型，98bp及26bp两条带;CT杂合基因型，长为124bp，98bp及26bp三条带；TT杂合 基因型，长为124bp-条带。各基因型均经测序以进一步鉴定，测序结果(见图3-5)显示与现 有技术测得的结果完全相同。
[0100]以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明 披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的 保护范围内。
【主权项】
1. 一种用MspI鉴定人HOTAIR基因多态性rs920778的方法，其特征在于，包括以下步骤： (a) 抽提样品的基因组DNA; (b) 提供扩增人HOTAIR基因多态性rs920778位点附近序列的正向引物和反向引物，以 所述待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获取扩增产物； (c) 使用限制性内切酶对所述扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物； (d) 将酶切产物采用3%的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定HOTAIR基因多态性rs920778的 各基因型。2. 根据权利要求1所述的用MspI鉴定人HOTAIR基因多态性rs920778的方法，其特征在 于，所述反向引物其3'末端倒数第一位碱基与多态rs920778碱基相邻，倒数第二位碱基为 错配碱基C，以便在扩增产物中与多态C等位基因形成CCGG结构，第二个碱基C为多态等位基 因，第四个碱基G为错配碱基。
【专利摘要】本发明公开了一种用MspI鉴定人HOTAIR基因多态性rs920778的方法，抽提样品的基因组DNA；提供扩增人HOTAIR基因多态性rs920778位点附近序列的正向引物和反向引物，以所述待测人基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，获取扩增产物；使用限制性内切酶对所述扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，以判定HOTAIR基因多态性rs920778的各基因型。本发明建立的HOTAIR？rs920778多态性的检测方法，内切酶价格十分便宜，同时PCR产物纯度较高，酶切结果易于分辨。该检测方法通过测序验证，其结果准确可靠。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105648068
【申请号】
【发明人】宋春花, 王凯娟, 李丽, 蔡建有, 闫芮, 曹祯, 王静娴, 王艳娜
【申请人】郑州大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月22日