下公式计算：
2.DNA标准基因均匀性分析 为检查制备的目的核酸标准样品的均匀性，采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法及 紫外分光光度法，取随机抽取15管样品，每管样品分成2份子样进行测试，结果见表1数据，F 检验见表2,结论:在95%置信概率下，与其他因素对测试结果的影响相比，样品的不均匀性 是可接受的。
[0028]表1嗜人按蚊鉴定用DNA标准基因均匀性检测结果 3 .DM称准基因椋足性分析
本标准样品采用的是加速稳定性实验，温度分为3个档，分别为_20°(：、-10°(：、0°(：，时间 点分为3个，分别为0天、5天、10天，对制备的标准样品分阶段每次取二份样品，按照不同保 存条件进行定性测定，每份样品以测定3次值为其定值结果。在全部稳定性测试中，所用人 员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。
[0029]依据上述测定方法分别计算结果，本DNA标准基因在真空、避光、-20°C下贮存，稳 定有效期为2年，测定结果见表3,稳定性方差分析见表4。
[0030]表3嗜人按蚊鉴定用DNA标准基因稳定性检测结果
表4稳定性方差分析表
直线上的点的标准偏差可由下式计算：
取其平方根s = 〇:〇〇251 %，与斜率相关的不确定度用下式计筧：
自由度为n-2=5和p=0.95(95%置信水平)的学生分布t一因子等于2.57。
[0031] 由于:|·Μ<?_，κ_2_^Λ)故斜率是不显著的。因而稳定性实验中未观测到不稳定 性。
[0032] 4.标准值及其不确定度 中国检验检疫科学研究院媒介生物实验室等3家单位与本实验室采用PicoGreen DNA 分子荧光定量法进行了合作定值。测试汇总表见表5。计算嗜人按蚊鉴定用DNA标准基因的 标准值及置信区间结果见表6。
[0033] 表5嗜人按蚊鉴定用DNA标准基因定值结果汇总表
表6嗜人按蚊鉴定用DNA标准基因定值结果统计分析表
5.灵敏度检验 将该序列标准样品稀释至lOng/μΙ，作为母液，然后按10倍浓度梯度进行稀释，按说明 书中方法进行PCR检测。检测结果(见图2)表明，当该样品稀释至10000(即10-4Χ)倍，条带不 可见，因此判定该标准品的灵敏度为1 0-4。
[0034]利用所述用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因鉴定嗜人按蚊的分子生物学鉴 定方法，包括如下步骤： (1)提取待检标本的DNA 对待检的一只残缺的蚊虫标本的DNA通过宝生物DNA提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒（Code No. 9765))进行提取，提 取步骤如下： 1) 将待检蚊虫置于1.5mL离心管中，用微型研磨棒研磨匀浆； 2) 加入180μ1的Buffer GL、20yl的蛋白酶K(Proteinase K)和10μ1的核糖核酸酶A (RNase A)(10 mg/ml)，于56°C水浴温浴至组织完全裂解2小时； 3) 向裂解液中加入200μ1 Buffer GB和200μ1无水乙醇，充分吸打混匀； 4) 将核酸纯化柱（Spin Column)安置于接收管(Collection Tube)上，溶液移至Spin Column中，12,000 rpm离心2分钟，弃滤液； 5) 将500μ1的Buffer WA加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液； 6) 确认Buffer TO中已经加入了56ml的无水乙醇，后将700μ1的Buffer TO加入至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液； 7) 重复操作步骤4); 8) 将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心2分钟； 9) 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入100μ 1的灭菌水，室温静置5分钟； 10) 12，000 rpm离心2分钟洗脱DNA。
[0035] (2)以得到的DNA为模板，使用如下的引物进行PCR，得到PCR产物 上游引物UP: 5 ' -CCATGACGTACACATACTTG-3 ' ； 下游引物AP: 5 ' -GCTCCATCTACACACAGCGT-3 ' ； PCR的条件为：94°C预变性5min;94°C 30s，50°C 30s，72°C 2min，35个循环；72°C延伸 2min； PCR 的体系为：25yL PCR 体系：2.5yL lOXbuffer(含 Mg2+)，2yL dNTPs(2.5 mmol/L)， 上下游lyL，0.5yL Taq酶，lyL模板DNA，去离子水定容至25yL; (3)得到PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。目的条带为在DNAMarker 240bp条带位置的电 泳带(如图1所示）； PCR产物采用宝生物琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒(Code No. 9762))进行纯化回收，纯化步骤如下： 1) 向电泳凝胶块中加入胶块融化液DR-I Buf f er (4个凝胶体积量）； 2) 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合； 3) 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上； 4) 将上述操作3)的溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液； 5) 将500 μL的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液； 6) 将700 μL的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液； 7) 重复操作步骤6); 8) 将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000 rpm离心 1 分钟； 9) 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入25 μ 1的灭菌蒸馏水，室温静置1分钟，把灭菌蒸馏水加热至60°C使用时有利于提高洗脱效率； 10) 12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。
[0036] (4)测序:测序得到的结果与所述的用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因的同 源性在98%，则能判断待检标本为嗜人按蚊。
【主权项】
1. 用于鉴定嗜人按蚊的D N A条形码标准基因，其特征在于：所述用于鉴定嗜人按蚊 的D N A条形码标准基因的核苷酸序列如下所示： CGTCCTGACTTCGCCATCGCGGGACACATCTGCTGCTGTTTACTACTTGTCTGTCTTCGCGGCCTTTCAACAC AAGTTCCGAGATGCAAGCGATCGACGAGATCTCTCTTACACCTTTATGCACGACTGTGACGTGGTGACCAGCACCAA TCACTGCGTAATTTTCTGTTTGCCAAACTTCTAATTATAAGCGCTCAAGTATGTGTACGTCATGGAA。2. -种根据权利要求1所述用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因的应用，其特征在 于:将所述的用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因应用于鉴定待检标本中。3. 根据权利要求2所述的用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因的应用，其特征在 于:所述待检标本为非成虫虫态，残缺不全的虫体或成虫。4. 一种利用权利要求1或2所述用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因鉴定嗜人按蚊 的分子生物学鉴定方法，其特征在于:包括如下步骤： (1)提取待检标本的基因组DNA: (2 )使用如下的引物进行PCR扩增，得到PCR产物； 上游引物UP: 5 ' -CCATGACGTACACATACTTG-3 ' ； 下游引物AP: 5 ' -GCTCCATCTACACACAGCGT-3 ' ； (3) 将PCR产物进行电泳分析，如果能扩增出目的条带，则提取该目的条带中的产区进 行测序，如果扩增出的产物没有目的条带，则能排除该待检标本为嗜人按蚊的可能性； (4) 测序得到的结果与所述的用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因的同源性在98% 以上时，则能判断待检标本为嗜人按蚊。5. 根据权利要求4所述的鉴定嗜人按蚊的分子生物学鉴定方法，其特征在于:步骤（1) 中所述的待检标本为非成虫虫态、残缺不全的虫体或成虫。6. 根据权利要求4所述的鉴定嗜人按蚊的分子生物学鉴定方法，其特征在于:步骤(2) 中所述的PCR的条件为：94°C预变性5min;94°C 30s，50°C 30s，72°C 2min，35个循环；72°C 延伸2min; 步骤(2)种所述的PCR的体系为：25yL PCR体系：2.5yL lOXbuffer(含Mg2+)，2yL dNTPs (2.5 mmol/L)，上下游引物各lyL，0.5yL Taq酶，lyL模板DNA，去离子水定容至25yL; 步骤(2)中所述的PCR在进行时设置阴性对照和阳性对照： 所述的阳性对照为权利要求1所述的用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因或含有 权利要求1所述的用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因的序列； 步骤(3)中所述的目的条带为在分子标记(DNA Marker)240bp条带位置的电泳带，或是 与阳性对照同一位置的电泳带。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因及应用。该用于鉴定嗜人按蚊的ＤＮＡ条形码标准基因的核苷酸序列如序列表中的ID？No.1所示。可将所述的用于鉴定嗜人按蚊的DNA条形码标准基因应用于鉴定待检标本是否为嗜人按蚊。本发明适应国境口岸卫生检疫工作的实际需要，利用DNA条形码技术，针对嗜人按蚊，建立一种相对稳定和准确的分子鉴定方法。可以对残缺样品进行鉴定，对嗜人按蚊与其近缘种能够很好的区分鉴定，对嗜人按蚊非成虫阶段的能够进行准确的鉴定。对提高嗜人按蚊分类鉴定的准确性、促进卫生监管工作的质量提升具有重要的促进作用。
【IPC分类】C12N15/12, C12Q1/68
【公开号】CN105648096
【申请号】
【发明人】程晓兰, 宋锋林, 高玉峰, 姜陆, 万雪, 岳巧云, 王静, 韩雪清, 王慧煜
【申请人】宋锋林, 程晓兰
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月22日