血液中激素的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及激素检测领域，具体而言，涉及一种血液中激素的检测方法。
【背景技术】
[0002] 激素对机体的各种生理过程如代谢、生长、发育、繁殖等起重要的调节作用，是生 命中的重要物质。激素在人体内的含量很低，但调节作用极为显著，且在机体内的变化对健 康有很大的影响。目前临床激素检测亦已广泛开展。然而，涉及血液中的激素检测时，由于 血液存在长距离运输、保存极为不便的问题，而且存在运输、保存过程中受到生物安全问题 的影响，导致现有的血液激素检测方式受到较大的限制，而且现有的传统方法稳定性不高、 灵敏度低、特异性差、易产生交叉污染等不足。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种血液中激素的检测方法。针对血液运输过程中可能带 来的生物安全问题，同时易受微生物污染、不易存储和远距离运输的缺点，将血液制作为干 血片，以提高其安全性、稳定性，避免微生物的污染，有效解决了激素检测中血液无法长距 离运输、保存的问题，且该检测方法还具有灵敏度高、稳定性好的优点。
[0004] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0005] -种血液中激素的检测方法，包括以下步骤：
[0006] 将血液与含有激素同位素内标的内标液混合并保存于滤纸片上，制成干血片;通 过萃取从干血片得到提取液，并通过衍生化处理提取液得到检测液；以及通过液质联用检 测检测液中的激素。
[0007] 本发明的血液中激素的检测方法的有益效果：
[0008] (1)本发明将血液保存在滤纸片上制成干血片，以固体的形式固化进行保存，其稳 定性大大提高，避免了血液样本的安全性问题及微生物对检测样品的污染，解决了血液中 激素检测面临的长距离保存、运输的问题。
[0009] (2)本发明通过萃取和衍生化处理，可使得干血片中的各个组分充分溶出，从而真 实地反应待测样品的中激素的情况，使得检测结果的准确性和稳定性大大提高。
[0010] (3)本发明采用液相分离和质谱分析联用的检测方法，实现对血液中激素的定性 和定量分析，灵敏度高，并且精度高、速度快。
[0011] (4)本发明提供的检测方法中，采用激素一个代谢通路中的6种激素(包括孕酮、17 α_羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇）的激素同位素内标，可对血液中的 6种激素(包括孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇）同时进行定 性和定量分析，满足实际检测的需要，具有较高的应用价值。
【附图说明】
[0012] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0013] 图1为本发明实施例的色谱图。
【具体实施方式】
[0014] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售购买获得的常规产品。
[0015] 下面针对血液中激素的检测方法进行具体说明。
[0016] -种血液中激素的检测方法包括以下步骤：
[0017] 步骤S1.将血液与含有激素同位素内标的内标液混合并保存于滤纸片上，制成干 血片；
[0018] 步骤S2.通过萃取从干血片得到提取液，并通过衍生化处理提取液得到检测液；以 及
[0019] 步骤S3.通过液质联用检测检测液中的激素。
[0020] 该血液中激素的检测方法是将血液用内标液保存在滤纸上制成干血片，再通过萃 取和衍生化处理，运用液相分离-质谱联用检测的方法，实现对血液中激素进行检测的目 的。血液以固体形式被固化保存，其稳定性高，保存和运输均更方便，并且可以有效地避免 保存和运输过程中的生物安全问题。由于采用内标液与血液混合的方式保存，后续测量更 便于进行定量分析，且激素同位素内标具有易被色谱柱分离、不易受干扰的特点。此外，通 过衍生化处理，可以使激素发生结构上的改变，从而更利于提高检测的灵敏度和准确性。
[0021] 在检测过程中，不同的激素之间的离子化过程中的差异大，且离子化效率低，从而 造成其检测灵敏度很差。在实际检测中，对不同激素的高精度和定量检测就相对比较困难。 但是，经过衍生化处理后，激素的离子化效率得以提高，进而降低检测难度、提高精度。
[0022] 具体地，在步骤S1中，将血液保存于滤纸片上的方法为：向血液中加入内标液，混 匀，然后转移至滤纸片上并于室温下风干3小时以上。
[0023]较佳地，内标液可通过以下方法制作而成:将激素同位素内标溶解于乙腈溶液，并 由甲醇溶液定容制得。乙腈溶液和甲醇溶液溶解更利于提取需要的激素，使得后续的检测 结果能够更真实反映血液中的激素情况。在步骤S2中，萃取的步骤具体包括:将干血片置于 甲醇和乙腈的混合溶液中，混匀，然后以1 〇〇〇〇~1 SOOOrpm的转速离心取上清液，得到提取 液。为了将保存在干血片上的血液样本充分提取，将干血片放入甲醇和乙腈的混合溶液中 并采用例如超声、恒温震荡、杂交炉混匀等方式，使得干血片上的血液的各个组分充分溶解 到甲醇和乙腈的混合溶液中。
[0024] 在实际检测过程中，可将保存有血液的干血片打孔，孔径为3mm，获得直径为3mm的 取样圆片，取多片取样圆片置于离心管中，加入甲醇和乙腈的混合溶液后进行超声20~90 分钟、离心操作。优选地，为了保证干血片上的血液中的各个组分能够充分溶解至甲醇和乙 腈的混合溶液中，混合溶液中甲醇的体积百分数优选为20~80%。
[0025] 在步骤S2中，衍生化处理的步骤具体为：干燥提取液，然后用盐酸羟胺水溶液复 溶，于30~80°C衍生15~60分钟，得到检测液。优选地，盐酸羟胺的水溶液浓度为80-120mg/ mL。为了提高干燥效率，避免干燥过程中对激素的破坏，优选采用冷冻干燥或者氮气吹干提 取液。盐酸羟胺与人体内激素如孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮 质醇进行衍生化反应，使得孕酮、17α_羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇 的检测更容易。
[0026] 在步骤S3中，通过液质联用检测检测液中的激素包括以下步骤：
[0027] 取激素标准品，用甲醇溶解，得到标准液；
[0028]将内标液加入标准液中并用甲醇定容，然后加入胎牛血清和乙腈，离心取上清液， 干燥后通过盐酸羟胺水溶液复溶进行衍生化处理，得到待测标准液；以及
[0029] 将待测标准液和检测液通过液质联用检测检测，得到激素的种类和含量。
[0030] 在步骤3中通过液质联用采用内标法对血液中激素进行检测。在检测过程中，配置 待测标准液和检测液，使用液相分离-质谱联用检测仪进行检测，以各激素的峰面积与激素 同位素内标的峰面积之比对血液中各激素的浓度进行线性回归，得到各激素的线性方程， 从而对血液中各激素进行定量检测。
[0031] 本发明提供的检测方法中，以孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮 质酮、皮质醇6种激素为激素标准品，可对血液中的孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧 皮质醇、皮质酮、皮质醇6种留体激素通路中的激素进行定性和定量分析。相应地，内标液中 的内标物选择为激素同位素内标d9_孕酮和d8-17a-轻孕酮，d5-l 1-脱氧皮质醇，d4-皮质 酮，d5-皮质醇。
[0032] 为了确保液质联用检测结果的准确性，特采用下述的液相色谱条件和质谱条件， 经过液相色谱和质谱检测后，可高效地对血液中的激素进行定性和定量分析。本方法分析 速度快，完成一次分析只需10分钟。
[0033] 其中，液质联用检测的液相色谱条件为：
[0034]色谱柱为键合相色谱柱，进样量:5~50yL，流动相包括A和B，其中A为甲酸水溶液， 较佳地，A为10-50 %甲酸水溶液;B为乙腈溶液。流动相的流速为0.1 -2. OmL/min;
[0035] 流动相的梯度（以体积百分比计）：
[0036] 0~〇.5min，A:97%、B:3% ;
[0037] 0.5~3min，A:97~5%、B:3~95% ;
[0038] 3~3.01min，A:5~97%、B:95~3% ;
[0039] 3.01 ~llmin，A:97%、B:3% ;
[0040] 较佳地，键合相色谱柱可采用C18色谱柱或C8色谱柱。
[0041 ]液质联用检测的质谱条件为:ESI离子源，正离子MRM模式扫描，雾化气流速8-20L/ min，气帘气流速8-20L/min，碰撞气流速5-15L/min，离子源电压2-4KV，离子源温度200-400 Γ。
[0042]以下结合实施例对本发明的血液中激素的检测方法作进一步的详细描述。
[0043] 实施例1 [0044]仪器和材料：
[0045] 美国Agilent公司6495串联质谱仪，Angilent 1290液相色谱仪;C18色谱柱，规格 为50mm X 3·Omm，2·7ym。
[0046]药品与试剂：
[0047]激素标准品：孕酮、17α_羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇，均 购买自Sigma公司。
[0048] 激素同位素内标:d9-孕酮和d8-17a-轻孕酮，d5-ll-脱氧皮质醇，d4-皮质酮，d5- 皮质醇，均购买自Sigma公司。
[0049] 甲酸:色谱纯，Merck公司。
[0050] 乙腈:色谱纯，Merck公司。
[0051 ] 盐酸羟胺:色谱纯，Merck公司。
[0052] 双蒸水：Thermo公司。
[0053] 血样:志愿者血液。
[0054]检测过程中，各种溶液的