配置方法如下：
[0055] 标准液：
[0056]将上述6种激素标准品（包括孕酮、17α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质 酮、皮质醇)分别用甲醇溶解配成l〇mg · ml/1的甲醇溶液，再混合成各激素浓度均为10yg · ml/1的标准液。
[0057]内标液：
[0058] 取适量激素同位素内标(包括d9-孕酮和d8-17a-羟孕酮，d5-ll-脱氧皮质醇，(Μ Ε质酮， d5-皮质醇 ） 用乙腈溶解并稀释为 lmg · ml/1 的储备液，再用甲醇溶液稀释定容至含 量为0. lmg · ml/1的内标液。
[0059] 待测标准液：
[0060] 分别取 5yL、10yL、20yL、50yL、100yL、200yL、400yL、800yL 标准液于 1.5ml 离心管 中，并分别加入20yL内标液，用甲醇分别定容至lmL，得到不同浓度的标准品溶液。各取标准 品溶液20~100yL，并加入50~200yL的胎牛血清、600yL的乙腈，充分混匀，然后离心并分别 取上清液，将上清液冻干后加入20~200yL、20~75%盐酸羟胺复溶并于37~75°C条件下衍 生化处理，得到待测标准液。
[0061] 检测液：
[0062]取待测血液50-1000yL，加入占血液体积的1/10的内标液，充分混匀，然后直接保 存在滤纸片上，在室温下风干3小时以上，得到含有血液和激素同位素内标的干血片。在制 得的干血片上打孔，孔径为3mm，获得直径为3mm的取样圆片，取1~5取样圆片置于1.5mL离 心管中，向离心管中加入0.3~1.5mL的甲醇和乙腈的混液溶液（甲醇占混液溶液的体积百 分数为20~80% )，并超声20~90分钟，之后以10000~18000rpm的转速离心5~20分钟后取 上清液，将上清液冻干后用20~200yL、20~75 %的盐酸羟胺复溶，并于37-75 °C衍生化处理 15~60分钟，得到检测液(待测定激素含量的样品溶液）。
[0063]将制得的待测标准液和检测液进样至液相色谱-质联用仪中进行检测。
[0064]其中，液相色谱的条件为：
[0065]流动相:A相和B相的混合溶液，其中，A相为甲酸水溶液，甲酸占甲酸水溶液体积的 10~50% ;B相为乙腈液体。
[0066] 流动相的流速为0.1-2mL/min。
[0067] 流动相的梯度（以体积百分比计)为：
[0068] 0~〇.5min，A:97%、B:3% ;
[0069] 0.5~3min，A:97~5%、B:3~95% ;
[0070] 3~3.01min，A:5~97%、B:95~3% ;
[0071] 3.01 ~llmin，A:97%、B:3%。
[0072] 色谱柱:C18色谱柱，规格为2.7以111，3.0\5〇111111;进样量 :1(^匕 [0073]质谱条件为：
[0074] 采用ESI离子源，正离子MRM模式扫描，喷雾口位置3:7;雾化气流速：10L/min，气帘 气流速:l〇L/min，碰撞气流速:8L/min，离子源电压:2500V，离子源温度:400°C。.
[0075] 将待测标准液中检测到的各激素的峰面积与激素同位素内标的峰面积之比(X)对 待测标准液中各激素的浓度(Y)进行线性回归，得到各激素的线性方程。其结果如表1所示。
[0076] 表1 6种激素的线性方程及在检测液中的激素含量 [00771
[(
[0079] 如表1所示，检测液中的激素含量是将检测液中各激素的峰面积与激素同位素内 标的峰面积之比，分别代入表1中的线性方程，得到检测液中各激素的浓度。
[0080] 其检测结果如图1所示，图1中各数字表示的组分为：1为皮质醇；2为皮质酮；3为 11-脱氧皮质醇;4为脱氧皮质酮;5为17α-轻孕酮;6为孕酮。
[0081 ]从图1中可以看出，出峰顺序为:皮质醇;皮质酮；11-脱氧皮质醇;脱氧皮质酮；17 α-轻孕酮;孕酮。
[0082] 试验例1
[0083]本发明提供的检测方法的回收率分析
[0084] 取标准液200yL，并加入20yL内标液，并用甲醇溶液补足到1ml，使其充分混合后直 接取10-100yL上清液滴到滤纸片上，风干3小时以上，萃取后进行盐酸羟胺衍生后， 15000rpm离心取上清，利用液质联用检测仪进行检测，检测过程中的液质联用的液相色谱、 质谱条件均与上述实施例1的检测待测标准液和检测液的条件相同。
[0085]将检测到的标准液的各激素的峰面积与激素同位素内标的峰面积之比代入表1的 线性方程，计算标准液中各激素的含量，进而计算绝对回收率，本试验例1所计算出的绝对 回收率为80-110%。另将通过新鲜血液中添加标准液干血片处理后的检测结果中激素的峰 面积与激素同位素内标的峰面积之比，与新鲜血液直接检测的结果中激素的峰面积与同位 素内标的峰面积之比进行比较，计算得相对回收率，本试验例1计算出的相对回收率为83~ 105%〇
[0086] 重复3次操作，结果相对标准偏差2.01 %-3.47 %，样品回收率在80.23 Χ-?Ο?. 56 % ， 表明本发明检测方法 的重现性好。
[0087] 本发明检测方法精密度准确度分析（日内差日间差分析）
[0088] 在同实施例1相同的液相色谱质谱条件下，取不同体积的混合标准品储备液进行 检测，1天内连续进样3次，3天内每天进样一次，结果日内CV在1.94 % -3.53 %波动，日间CV 在3.69%-13.35%波动，符合要求。
[0089] 由上述结果可以，本发明提供的血液中激素的检测方法，激素的损失少，检测的结 果可以真实反应血液中的激素含量和种类。
[0090] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
【主权项】
1. 一种血液中激素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 将血液与含有激素同位素内标的内标液混合并保存于滤纸片上，制成干血片； 通过萃取从所述干血片得到提取液，并通过衍生化处理所述提取液得到检测液；以及 通过液质联用检测所述检测液中的激素。2. 根据权利要求1所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，所述内标液是通过将所 述激素同位素内标溶于乙腈溶液中，并由甲醇溶液定容制得。3. 根据权利要求1所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，所述萃取的步骤包括： 将所述干血片置于甲醇和乙腈的混合溶液中经超声、离心取上清液作为所述提取液，所述 混合溶液中甲醇的体积百分数为20~80%。4. 根据权利要求3所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，所述衍生化处理的步骤 包括:干燥所述提取液，并用盐酸羟胺水溶液复溶，于30~80°C衍生15~60分钟，得到所述 检测液。5. 根据权利要求4所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，干燥所述提取液的方法 为冷冻干燥或者氮气吹干。6. 根据权利要求1所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，通过所述液质联用检测 所述检测液中的激素包括以下步骤： 取激素标准品，用甲醇溶解，得到标准液； 将所述内标液加入所述标准液中并用甲醇定容，然后加入胎牛血清和乙腈，离心取上 清液，干燥后通过盐酸羟胺水溶液复溶进行衍生化处理，得到待测标准液； 将所述待测标准液和所述检测液通过液质联用检测检测，得到激素的种类和含量。7. 根据权利要求6所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，所述液质联用检测的液 相色谱条件为： 色谱柱为键合相色谱柱，进样量:5~50yL，流动相包括A和B，其中A为甲酸水溶液，B为 乙腈溶液，流动相的流速为0.1-2. OmL/min;流动相的梯度（以体积百分比计）： 0 ~0.5min，A:97%、B:3%; 0.5~3min，A:97~5%、B:3~95%; 3~3.01min，A:5~97%、B:95~3%; 3.01~llmin，A:97%、B:3%; 所述液质联用检测的质谱条件为:ESI离子源，正离子MRM模式扫描，雾化气流速8-20L/ min，气帘气流速8-20L/min，碰撞气流速5-15L/min，离子源电压2-4KV，离子源温度200-400 Γ。8. 根据权利1至7之一所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，制成所述干血片是 将保存有混合所述内标液和所述血液的所述滤纸片并于室温下风干3小时以上。9. 根据权利要求7所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，所述键合相色谱柱为 C18或C8色谱柱，规格为(50-100)mmX (1 · 8-3)mm，（ 1 · 8-3)μπι。10. 根据权利要求1所述的血液中激素的检测方法，其特征在于，所述激素包括孕酮、17 α-羟孕酮、脱氧皮质酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮、皮质醇，所述激素同位素内标包括d9-孕酮 和d8-17a-轻孕酮，d5-ll-脱氧皮质醇，d4-皮质酮，d5-皮质醇。
【专利摘要】本发明提供了一种血液中激素的检测方法，属于激素检测领域。该检测方法包括以下步骤：将血液与含有激素同位素内标的内标液混合并保存于滤纸片上，制成干血片。通过萃取从干血片得到提取液，并通过衍生化处理提取液得到检测液。通过液质联用检测检测液中的激素。本发明提供的检测方法中，将血液保存于滤纸片上，再通过萃取、衍生化过程，运用液质联用方法，实现了快速、有效地对血液中的激素进行定性和定量检测的目的。由于将血液保存于滤纸片上，以固体的形式保存，避免运输过程中可能带来的生物安全问题，并且可大大提高稳定性，从而避免微生物污染检测样品。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/88
【公开号】CN105651924
【申请号】
【发明人】童鸿斌
【申请人】杭州汉库医学检验所有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月16日