一种抗Scl-70抗体酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种抗Scl-70抗体酶联免疫检测试剂盒，属于诊断试剂领域。
【背景技术】
[0002]硬皮病患者血清中有一种抗核抗体，其靶抗原为细胞核中一种非组蛋白蛋白质，因在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中移动的分子量为70kD，故称为Scl-70。1986年Scl-70被证实其本质是DNA拓朴异构酶-1，其天然分子量为100kD，70kD抗原为其降解片段。DNA拓朴异构酶-1，位于核质中，在核仁中的浓度很高。它与DNA超螺旋的松解过程有关，在DNA双链的复制和转录中起作用。此酶将DNA链切断，并附着在产生的游离端上，因此，不需整个DNA分子解螺旋，而仅发生于将复制的区域。一旦某一区域复制或转录完成，DNA双链就重新结合，拓朴酶释放。它是细胞内具有重要生物功能的关键蛋白。
[0003]抗Scl-70抗体主要见于全身性进行性硬化症(PSS)中的弥漫型，是该病的标志性抗体，其阳性率25%?70%，阳性率的差异可能与免疫扩散法所用可提取性核抗原(ENA)的浓度不同以及选择的病例类型不同有关，在重型弥漫型硬皮病患者可高达75%，在CREST综合征患者抗Scl-70检出率仅4%?11 %，此抗体阳性者抗着丝粒抗体多为阴性。局限型硬皮病病人，此抗体检出率很低，仅约20%左右。
[0004]抗Scl-70抗体检测的经典方法是琼脂双向免疫扩散法(Ouchterlony法)，近年来多采用免疫印迹法，亦可用免疫荧光法予以检测，不过此法检测结果很难与其他抗核抗体发光模式予以区别。以上方法操作技术复杂，无法定量，对实验人员要求较高，并需要特殊的实验操作仪器，难以普及。
【实用新型内容】
[0005]本实用新型要解决的技术问题是提供一种抗Scl-70抗体酶联免疫检测试剂盒。
[0006]为实现上述目的，本实用新型采用以下设计方案:
[0007]一种抗Scl-70抗体的酶联免疫检测试剂盒，由盒体及试剂固定件、包被Scl-70抗原的酶标板、封板膜、标准品、阳性质控品、阴性质控品、底物液A、底物液B、酶标抗原工作液、样品稀释液、洗涤液和终止液组成。
[0008]所述试剂固定件为纸质固定件或高分子材质固定件，例如塑料泡沫固定件。固定件上设有试剂固定位，例如孔洞或凹槽，用于固定各种试剂，便于运输和贮藏。
[0009]所述包被Scl-70抗原的酶标板为96孔酶联免疫试剂板，优选可拆96孔酶联免疫试剂板。酶标板采用可拆96孔酶联免疫试剂板作为固相载体，在微孔板条上预包被重组表达的Scl-70抗原制成检测板。96孔可拆酶标板置于铝箔袋内。可拆酶标板是由外框及卡在内框上的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆微孔条有8个反应孔，每孔预先包被重组表达纯化的Scl-70抗原。
[0010]Scl-70抗原为DNA拓扑异构酶I，具有四个结构域，其中核心结构域和羧基端结构域含有抗体识别的主要优势表位。根据编码Scl-70抗原的核酸序列，设计并合成一对寡聚核苷酸引物，以人胎盘cDNA第一链为模板，采用高保真DNA聚合酶，PCR法扩增获得编码Scl-70抗原第207至第765位氨基酸的基因片段。将目标基因片段载入PET-44 Ek/LIC载体中完成重组质粒构建，重组质粒转化宿主菌E.coli BL2KDE3)诱导表达融合蛋白，采用His.MagTM琼脂糖珠纯化后WB鉴定抗原性。
[0011]所述封板膜为有数位标记的塑料硬膜，封板膜大小与酶标板一致。
[0012]所述标准品为6个不同浓度的标准品，可依浓度梯度置于固定件相应位置。
[0013]所述阳性质控品是确诊含有抗Scl-70抗体的患者血清。
[0014]所述阴性质控品是正常人血清。
[0015]所述底物液A是含有1.2ml冰醋酸、0.37g过氧化氢脲的混合溶液。
[0016]所述底物液B是四甲基联苯胺(TMB)工作液。
[0017]所述酶标抗原工作液是酶稀释液稀释过的已标记辣根过氧化物酶(HRP酶)的Scl-70 抗原。
[0018]所述样品稀释液是含有4.7g/L酪蛋白、Proclin3000.34ml/L、胎牛血清100ml/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)。
[0019]所述洗涤液是PBST溶液。
[0020]所述终止液是3M浓硫酸稀释液。
[0021 ] 所述标准品、阳性质控品、阴性质控品、底物液A、底物液B、酶标抗原工作液、样品稀释液、洗涤液和终止液可以用不同颜色的容器进行区分，以便于使用者操作。例如，标准品置于蓝色瓶盖玻璃瓶内，阳性质控品置于红色瓶盖玻璃瓶内，阴性质控品置于黄色瓶盖玻璃瓶内，底物A液置于白色瓶盖的白塑料瓶内，底物B液置于棕色瓶盖的盖棕色瓶内，酶标抗原工作液置于红盖白塑料瓶内，样品稀释液置于红盖白色瓶内，洗涤液置于蓝盖白色瓶内，终止液置于蓝盖白色瓶内。
[0022]每个试剂盒中的预装试剂可以进行96样本量测定(包括标准品及阴阳性对照品)，即可一次满板大样本量检测，也可以通过可拆卸微孔板条分批多次检测。铝箔袋一端胶封一端拉链式合口，可以保证未使用板条的存放。检测时，待检血清中目标抗体与包被抗原发生抗原抗体反应，加入标记有辣根过氧化物酶(HRP酶)的抗原形成结合物，用TMB (3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺)底物显色，其待检血清中抗体含量与底物显色吸光度成线性关系，与标准曲线方程式代入计算即可得出血清中所测抗体含量。
[0023]经样本实验表明，本试剂盒标准品线性回归与预期浓度相关系数R2值，大于等于0.990，灵敏度0.5U/ml，批内差小于10%。本试剂盒操作无须特殊实验仪器，仅需酶标仪、移液器、振荡器等实验室基本仪器，操作简便快捷。
[0024]本实用新型的优点是:抗Scl-70抗体酶联免疫检测试剂盒灵敏度高、检测快速可量化，稳定性好，并可同时对多个样本进行检测，减少了检测样本所需要的时间；该试剂盒操作简便，不需要特殊实验仪器设备，可广泛应用于抗Scl-70抗体的实验室检测。
[0025]以下通过附图和【具体实施方式