一种环瓜氨酸肽抗体酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种环瓜氨酸肽抗体酶联免疫检测试剂盒，属于诊断试剂领域。
【背景技术】
[0002]类风湿关节炎(RA)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。RA的发病可能与遗传、感染、性激素等有关。RA关节炎的病理主要有滑膜衬里细胞增生、间质大量炎性细胞浸润，以及微血管的新生、血管翳的形成及软骨和骨组织的破坏等。
[0003]抗环瓜氨酸肽抗体(CCP)是环状聚丝蛋白的多肽片段，是以IgG型为主的抗体，对类风湿性关节炎(RA)具有很好的敏感性和特异性，且抗CCP抗体阳性的RA病人骨破坏较抗CCP抗体阴性者严重。通过检测患者样本中抗环瓜胺酸肽抗体，能诊断出约80%的类风湿性关节炎病人，而在非患有类风湿性关节炎的病人中则很少呈阳性反应，专一性达至98%。另外，这些抗体在早期病患时，甚至比发病前更早亦能测得。
[0004]目前，实验室检测方法分为胶乳凝集法、散射比浊法和ELISA法等。目前国内主要采用乳胶凝集法，此法操作简便，不需要特殊仪器，试剂成本较低，但只能检测IgM类抗体，且灵敏度及特异性较差，易受多种因素影响，如乳胶颗粒的大小、浓度、实验温度、稀释液的Ph值，致敏时γ球蛋白含量等，重复性较差，且只能进行半定量结果分析，手工操作费时费力，对临床的测定有一定的局限。国外主要采用比浊法、酶联免疫法等。酶联免疫法所采用的的是抗原抗体反应，较比浊法特异性较高，重复性好，试剂稳定，敏感性好，不需特殊仪器设备，还可对各抗体型别进行检测，目前是临床检测的优选方法。
【实用新型内容】
[0005]本实用新型要解决的技术问题是提供一种环瓜氨酸肽抗体酶联免疫检测试剂盒。
[0006]为实现上述目的，本实用新型采用以下设计方案:
[0007]一种环瓜氨酸肽抗体酶联免疫检测试剂盒，由盒体及试剂固定件、包被环瓜氨酸肽抗原的酶标板、封板膜、标准品、阳性质控品、阴性质控品、底物液Α、底物液B、酶标抗原工作液、样品稀释液、洗涤液和终止液组成。
[0008]所述试剂固定件为纸质固定件或高分子材质固定件，例如塑料泡沫固定件。固定件上设有试剂固定位，例如孔洞或凹槽，用于固定各种试剂，便于运输和贮藏。
[0009]所述包被环瓜氨酸肽抗原的酶标板为96孔酶联免疫试剂板，优选可拆96孔酶联免疫试剂板。酶标板采用可拆96孔酶联免疫试剂板作为固相载体，在微孔板条上预包被环瓜氨酸肽抗原制成检测板。96孔可拆酶标板置于铝箔袋内。可拆酶标板是由外框及卡在内框上的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆微孔条有8个反应孔，每孔预先包被环瓜氨酸肽抗原。
[0010]所述封板膜为有数位标记的塑料硬膜，封板膜大小与酶标板一致。
[0011]所述环瓜氨酸肽抗原为根据丝聚蛋白(Filaggrin)的cDNA序列合成一条含瓜氨酸的环肽或市售商品化的环瓜氨酸肽。
[0012]所述标准品为6个不同浓度的标准品，可依浓度梯度置于固定件相应位置。
[0013]所述阳性质控品是确诊含有抗环瓜氨酸肽抗体的患者血清；
[0014]所述阴性质控品是临床非内风湿关节炎正常人血清；
[0015]所述底物液A是含有1.2ml冰醋酸、0.37g过氧化氢脲的混合溶液；
[0016]所述底物液B是四甲基联苯胺(TMB)工作液；
[0017]所述酶标抗原工作液是酶稀释液稀释过的已标记辣根过氧化物酶(HRP酶)的环瓜氨酸肽；
[0018]所述样品稀释液是含有4.7g/L酪蛋白、Proclin3000.34ml/L、肽牛血清100ml/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液);
[0019]所述洗涤液是PBST溶液；
[0020]所述终止液是3M浓硫酸稀释液。
[0021 ] 所述标准品、阳性质控品、阴性质控品、底物液A、底物液B、酶标抗原工作液、样品稀释液、洗涤液和终止液可以用不同颜色的容器进行区分，以便于使用者操作。例如，标准品置于蓝色瓶盖玻璃瓶内，阳性质控品置于红色瓶盖玻璃瓶内，阴性质控品置于黄色瓶盖玻璃瓶内，底物A液置于白色瓶盖的白塑料瓶内，底物B液置于棕色瓶盖的盖棕色瓶内，酶标抗原工作液置于红盖白塑料瓶内，样品稀释液置于红盖白色瓶内，洗涤液置于蓝盖白色瓶内，终止液置于蓝盖白色瓶内。
[0022]每个试剂盒中的预装试剂可以进行96样本量测定(包括标准品及阴阳性对照品)，即可一次满板大样本量检测，也可以通过可拆卸微孔板条分批多次检测。铝箔袋一端胶封一端拉链式合口，可以保证未使用板条的存放。检测时，待检血清中目标抗体与包被抗原发生抗原抗体反应，加入标记有辣根过氧化物酶(HRP酶)的抗原形成结合物，用TMB (3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺)底物显色，其待检血清中抗体含量与底物显色吸光度成线性关系，与标准曲线方程式代入计算即可得出血清中所测抗体含量。
[0023]经样本实验表明，本试剂盒标准品线性回归与预期浓度相关系数R2值，大于等于0.990，灵敏度0.5U/ml，批内差小于10%。本试剂盒操作无须特殊实验仪器，仅需酶标仪、移液器、振荡器等实验室基本仪器，操作简便快捷。
[0024]本实用新型的优点是:环瓜氨酸肽抗体酶联免疫检测试剂盒灵敏度高、检测快速可量化，稳定性好，并可同时对多个样本进行检测，减少了检测样本所需要的时间；该试剂盒操作简便，不需要特殊实验仪器设备，可广泛应用于环瓜氨酸肽抗体的实验室检测，准确检测血清样本中环瓜氨酸肽抗体的含量。
[0025]以下通过附图和【具体实施方式】详细说明本实用新型的技术方案，并不以此限定本实用新型的实施范围，凡依照本实用新型披露内容所进行的本领域等同替换，均属于本实用新型的保护范围。
【附图说明】
[0026]图1为本实用新型的结构示意图
[0027]图2为