专利名称：鱼病多联免疫检测药物盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。
近年，随着我国海水养殖渔业的迅猛发展，鱼病特别是由细菌引起的鱼病越来越严重，每年因病而引起的死亡率约为30～40％，造成严重的经济损失。经调查，目前对我国海水、淡水养殖鱼危害最大的病菌为创伤弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、河弧菌及迟缓爱德华菌。国外对鱼病的检测技术从一般的形态学观察，生物特性测定，近年已发展到免疫检测技术及基因探针检测技术。免疫检测技术的建立，首要条件是产生各种病菌的特异性抗体或单克隆抗体，后者比前者更具有特异性。国外已有鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌等多种弧菌单克隆抗体成功制备的报道，并已有用免疫检测法，检测由弧菌引起的鱼病的报道，但这些仅仅是实验室的研究报告。国外已有迟缓爱德华菌多克隆抗体成功制备的报道，但还未见单克隆抗体成功制备的报道。国内迄今未见以上海鱼病菌单克隆抗体成功制备的报道。
本发明的目的是利用生物技术，生产多种多病菌单克隆抗体，筛选出特异性很强的单克隆抗体及杂交瘤细胞株，制备出鱼病多联免疫检测药物盒，能随时快捷、准确地检出各种鱼病，为鱼病的及时有效治疗提供保证。
本发明的技术方案鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌的标准菌株由青岛海洋大学提供。以上菌株经扩增培养后，用0．5％～2％甲醛固定过夜灭活，将灭活菌液(1×106个／ml～1×1010个／ml)以0．2～0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠。每隔一周到两周追加免疫一次，最后一次免疫后第3天，取脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合。脾细胞和SP2／0骨髓细胞的比例为2∶1～1∶1。将经细胞融合的细胞悬液加到辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0．1ml，在37℃，含5％CO2的孵箱中培养。用ELISA法(酶联免疫反应法)检测阳性克隆，将确定为阳性的孔以有限稀释法，进行克隆化。将阳性克隆的杂交瘤细胞株扩增培养，将扩增培养的杂交瘤细胞调整为1×106／ml，以每只小鼠0．5ml的量，腹腔注射接种到Ba／b／c小鼠，接种后7～14天，处死小鼠，吸取腹水，即为腹水型单抗。将以上腹水型单抗以ELISA法进行效价、亚类及交叉试验。结果显示，8株鳗弧菌单抗中有2株单抗不与弧菌属其它弧菌发生交叉反应；12株外伤弧菌单抗中有2株单抗不与其它弧菌发生交叉反应；8株溶藻弧菌单抗中有2株单抗除了拟态弧菌外，也不与其它弧菌发生交叉反应；8株迟缓爱德华菌单抗中有7株单抗不与肠道其它杆菌发生交叉反应。将以上4种特异性很强，且效价较高的单抗挑选出来按一定比例配制成鱼病多联免疫检测药物盒。
本发明的实施例(一)材料1．菌种鳗弧菌、外伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌的标准菌株由青岛海洋大学生命学院提供。以上菌种用作免疫原产生单克隆抗体。
溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、霍利斯弧菌、拟态弧菌、少女弧菌、麦氏弧菌的标准菌株购自北京生物制品公司。肠毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、志贺氏菌属的福氏志贺氏菌、绝氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、宋氏志贺氏菌，购自中国药品生物制品鉴定所。以上菌种用作单克隆抗体交叉试验。
2．细胞胞SP2／0小鼠骨髓瘤细胞株，由第四军医大学细胞工程研究中心惠赠。
(二)实验方法1．免疫原细菌的制备及灭活鳗弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、迟缓爱德华氏菌以平板划线培养于细菌培养基上，37℃培养箱中过夜，无菌生理盐水洗脱菌苔，3000rpm离心20分钟，弃上清，加入1％的甲醛固定过夜。3000rpm离心20分钟，弃上清，加无菌生理盐水，比浊记数后，4℃冰箱保存，以备用作免疫原菌液。2．Ba／b／c小鼠的免疫8周龄的Ba／b／c雌性小鼠10只，将以上灭活的细菌菌液(1×108个／ml)以0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第7、14、28天分别追加免疫，第31天取脾细胞进行细胞融合。
3．细胞融合(1)免疫脾细胞的制备①取免疫小鼠脾脏，放入盛有5ml不完全培养液的平皿中，置于200目的不锈钢铜网上。用注射器内芯研磨脾脏，并用平皿内不完全培养液轻轻冲洗钢网，使脾细胞全部通过网孔挤压到溶液中。
②将脾细胞悬液转入50ml离心管中，加不完全培养液至30ml，混匀，1000rpm离心5分钟，弃去上清。
③用不完全培养液将沉淀细胞再离心洗涤一次(重复步骤②)，将细胞垂悬至10ml，混匀，用细胞记数板记数。
(2)SP2／0骨髓瘤细胞悬液的制备①将4瓶扩增培养的骨髓瘤细胞收集到50ml离心管内。
②1000rpm离心5分钟，弃去上清。
③再加入30ml不完全培养液，重复步骤②再离心洗涤一次，然后将细胞垂悬至10ml，混匀，记数。
(3)细胞融合①分别吸取含1×108个脾细胞和悬液和含2-3×107个骨髓瘤细胞的悬液，加入一支50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分混匀。
②1000rpm离心7分钟，弃去上清。
③加50％的融合剂PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。
⑤800rpm离心7分钟，弃去上清。
⑥加入20ml HAT培养液，轻轻吹吸沉淀细胞，使其垂悬并混匀。
⑦将细胞悬液加入辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培养。
4．抗体检测--间接ELISA法(1)用已知抗原灭活菌液包被。
(2)加有克隆长生的孔中的培养上清100μl。
(3)加酶标单抗鼠IgG抗体100μl。
(4)加底物液100μl，室温避光显色10～20分钟。
(5)判定结果在酶联免疫检测仪492nm波长下测定OD值，空白对照调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔2．1倍，即为阳性克隆。
5．克隆化--有限稀释法将96孔板中待做克隆化的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后记数，然后采取有限稀释法进行逐级稀释，加到96孔板进行培养。观察克隆生长，记录单克隆孔，并及时进行阳性检测。将阳性单克隆的细胞转到24孔板培养，待其增殖到一定数量后再转入细胞瓶中扩大培养。
6．杂交瘤细胞的冻存将成对数生长的杂交瘤细胞收集入离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清，加入1ml冻存液混匀，然后加到冻存管，在-70℃代温冰箱过夜后移入液氮罐长期保存。
7．腹水型单克隆抗体制备将培养的杂交瘤细胞吹打下来，1000rpm离心10分钟，收集上清作亚型试验，加无血清培养液到沉淀的细胞中，调整细胞数为1×106个／ml。每只Ba／b／c小鼠注射0．5ml，接种杂交瘤细胞后7～14天，拉颈脱臼处死小鼠，吸取腹水，离心，收集上清，分装后-20℃冻存备用。
8．单克隆抗体的鉴定抗鳗弧菌单抗筛选到8株能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株，分别命名为2H2、3B2、3D2、3A3、3C4、4A6、4E3和4E12。经亚类鉴定其中2H2、3D2、3B2和4E12为IgG3；4E3为IgG2a；3A3、3C4、4A6为IgG1。经效价测定，这些单抗效价为1×10-5～1×10-7。
抗创伤弧菌单抗筛选到12株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株，命名为1B12、3E9、3F11、3E3、2G8、3D5、1E11、3H4、2F1、1A1、2F6和1G1。经亚类鉴定，其中2F6为IgG3、1B12、3E3、3H4、1A1为IgG2a；2G8、3D5、2F1为IgG1。经效价测定，以上单抗的效价为1×10-5～1×10-7。
抗溶藻弧菌单抗筛选到8株能稳定分泌单抗的杂交瘤细胞中，命名为2E3、2E4、2G2、2G8、2D11、3A10、3B12和4C7。经亚类鉴定，其中2E3为IgG3，2G2、2D11、3A10为IgG2a；2E4、3B12为IgG2b；2G8、4C7为IgG1。经效价鉴定，以上单抗的效价为1×10-6～1×10-7。
抗迟缓爱德华菌单抗筛选到10株单抗杂交瘤细胞株，分别命名为1B4、4D3、4D5、3F7、5A11、5H5、6B11、6E1、6E6和6H3。经亚类鉴定，其中1B4、3F7、5A11、5H5、6B11为IgG1，6E1为IgG2b；4D3、4D5、6E6、6H3为IgG3。经效价测定，以上单抗的效价为1×10-6～1×10-7。
9．制备成品将抗鳗弧菌单抗中的2H2单抗、抗创伤弧菌单抗中的1B12，抗溶藻弧菌单抗中的2G8，抗迟缓爱德华菌单抗的5H5单抗，以1∶1∶1∶1的比例混合，制成鱼病多联免疫检测药物盒。
本发明的优点本发明鱼病多联免疫检测药物盒所具有的特异性很强的单克隆抗体，可以特异性地检测出创伤弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌及迟缓爱德华氏菌四种鱼病，并且能产生这些单抗的杂交瘤细胞株可通过生物效应器无限扩增，所以以上单抗可实现工业化大量生产，具有很高的社会和经济效益。
权利要求
1．鱼病多联免疫检测药物盒，其特征是鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌经扩增培养后，用0．5％～2％甲醛固定过夜灭活，将灭活菌液(1×106个／ml～1×1010个／ml)以0．2～0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠；每隔一周到两周追加免疫一次，最后一次免疫后第3天，取脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞进行细胞融合；脾细胞和SP2／0骨髓细胞的比例为2∶1～1∶1；将经细胞融合的细胞悬液加到辅有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0．1ml，在37℃，含5％CO2的孵箱中培养；用ELISA法(酶联免疫反应法)检测阳性克隆，将确定为阳性的孔以有限稀释法，进行克隆化；将阳性克隆的杂交瘤细胞株扩增培养，将扩增培养的杂交瘤细胞调整为1×106／ml，以每只小鼠0．5ml的量，腹腔注射接种到Ba／b／c小鼠，接种后7～14天，处死小鼠，吸取腹水，即为腹水型单抗；将以上腹水型单抗以ELISA法进行效价、亚类及交叉试验；将以上4种特异性很强，且效价较高的单抗挑选出来按一定比例配制成鱼病多联免疫检测药物盒。
全文摘要
鱼病多联免疫检测药物盒,涉及生物技术领域。本发明将鳗弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、迟缓爱德华菌免疫小鼠,进行细胞融合,再克隆化,制备出特异性很强,且效价较高的单克隆抗体,按一定比例配制成多联免疫检测药盒,能随时快捷、准确地检出各种鱼病,为鱼病的及时有效治疗提供保证。
文档编号A01K61/00GK1292992SQ0011392
公开日2001年5月2日 申请日期2000年9月20日 优先权日2000年9月20日
发明者黄威权, 夏永娟, 李元, 李别虎, 金晓航, 张荣庆 申请人:中国人民解放军第四军医大学