专利名称：一种具有LACK抗原Th2型表位的多肽在制备预防或治疗自身免疫性疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种功能多肽及其应用，特别涉及一种具有利什曼原虫LACK抗原的Th2型表位(氨基酸156-173)序列的多肽及其在制备预防或治疗自身免疫性疾病药物中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术：
自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。其中，较为常见的疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是引起关节炎症和破坏的一种自身免疫性疾病。该病发病率较高(0.32-0.36%)，致残率高，严重影响患者的生存质量(蒋明，David Yu,林孝义等。中华风湿病学。华夏出版社，2004年)。近年来，随着以各种细胞因子、T/B淋巴细胞等为靶点的多种生物制剂的出现，从根本上改变了该类疾病的治疗面貌，为患者带来了曙光。但是此类疾病目前病因尚未完全明了，仍然缺乏有效的根治方法。免疫系统的紊乱和失衡是引起自身免疫病发生和发展的主要原因。以目前发病机制较为明晰的RA为例，促炎性的Thl细胞和抗炎性的Th2细胞及其分泌的细胞因子失衡在 RA 的发病中起了决定性作用(Kawashima M, Miossec P.mRNA quantification ofT_bet，GATA—3，IFN—gamma，and IL_4shows a defective Thl immune response in theperipheral blood from rheumatoid arthritis patients:link with disease activity.J Clin Immunol.200 5;25:209-214 ；van Roon JAj Bijlsma JW, Lafeber FP.Suppressionof inflammation and joint destruction in rheumatoid arthritis may require aconcerted action of Th2 cytokines.Curr Opin Investig Drugs.2002;3:1011-1016.)。Thl细胞分泌IFN- γ.TNF- α等细胞因子，在抗感染、抗肿瘤中起重要作用，同时也是RA等自身免疫性疾病的发病机制之一；而Th2细胞分泌IL-4等细胞因子。近年来的研究认为作为第三大类细胞，Thl7是RA关节局部IL-17的主要来源，已证实IL-17在RA中起重要的促炎症作用(Luger D, Silver PB, Tang J, et al.Either a Thl7 or a Thl effectorresponse can drive autoimmunity: conditions of disease induction affect dominanteffector category.J Exp Med, 2008; 205:799—810.)。在类风湿关节炎的发病机制中，由Thl/Th2/Thl7三种类型的细胞因子的网络失衡在其中起着重要的主导作用，而其中Th2型免疫反应则起着难得的保护性作用。在我国，过敏(如哮喘)及自身免疫性疾病(如类风湿关节炎)的患病率越来越高，“卫生假说”提出可能是因为儿童时期较少接触微生物导致(Flohr C，Quinnell RJ, BrittonJ.Do helminth parasites protect against atopy and allergic disease.Clin ExpAllergy, 2009 ;39:20-32.)。越来越多的流行病学及实验证据支持该假说，从而使寄生虫成为抗过敏及抗炎因子的重要候选者。很多寄生虫看似在人类具有抗过敏或抗炎作用，实验研究同样显示寄生虫感染在自身免疫性动物模型同样具有保护作用如结肠炎、关节炎和糖尿病、过敏症如气道高反应性(McKay DM.The therapeutic helminth.Trends inParasitology,2009;25:109-114.)。利氏曼原虫是一种经典的细胞内感染寄生虫，可以引起利什曼病，也称黑热病。已证实一种来源于利氏曼原虫虫体成分的利氏曼原虫脂质是一种宿主细胞的免疫调节剂，它能够抑制活化的巨噬细胞产生炎症性细胞因子和NO，从而发挥免疫抑制作用(Hatzigeorgious DE, Geng J, Zhu B et al.Lipophosphoglycan fromLeishmania suppresses agonist-1nduced interleukin I beta gene expressionin human monocytes via a unique promoter sequence.Proc Natl Acad SciUSA.1996;93:14708-14713.)。另外有研究证实利氏曼原虫脂质能够抑制RA患者的滑液单核细胞(SFMCs)产生TNF- a、IL-1 β和NO并能够诱导细胞凋亡(MajumdarKN, Banerjee A, Ratha J et al.Leishmanial lipid suppresses tumor necrosis factoralpha, interleukin-lbeta, and nitric oxide production by adherent synovial fluidmononuclear cells in rheumatoid arthritis patients and induces apoptosisthrough the mitochondrial-mediated pathway.Arthritis Rheum.2008;58:696-706.),印证了利氏曼原虫虫体成分作为生物免疫抑制剂治疗RA的可行性。LACK抗原(Leishmaniahomo I og of mammalian RACKs, the receptors for activated C kinase)是在利氏曼原虫的不同生长状态中均表达的重要抗原(Julia V, Rassoulzadegan M, GlaichenhausN.Resistance to Leishmania maj or induced by tolerance to a single antigen.Science 1996; 274:421-423.)。疾病易感性的BALB/c小鼠在接种利氏曼原虫后，体内会产生强有力的Th2型免疫应答从而 导致感染的迁延不愈。而这种免疫反应正是由于小鼠体内表达V β 4/V a 8 T细胞受体的细胞在对于LACK蛋白的单一表位(氨基酸序列156-173)识别后扩增，从而产生大量IL-4而导致的(Maillard I，Launois P，Himmelrich H et al.Functional plasticity of the LACK-reactive Vbeta4-Valpha8CD4(+)T cells normally producing the early IL-4 instructing Th2 celldevelopment and susceptibility to Leishmania maj or in BALB/c mice.Eur.J.Tmmunol.2001;31:1288-1296.)。本发明利用了利什曼原虫LACK蛋白的Th2表位能够诱导强有力的Th2型免疫应答的特点，将其应用到RA等自身免疫性疾病的治疗中。目前与之相关或相似的治疗方法在国内外均无报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可用于基因治疗的重组多肽，本发明利用利什曼原虫LACK蛋白的Th2表位能够诱导强有力的Th2型免疫应答的特点，将其应用到RA等自身免疫性疾病的治疗中，应用动物模型验证了该治疗方法的可行性。研究表明，本发明的多肽对于自身免疫性疾病的预防或治疗具有重要的临床意义，同时还可以改善体内的免疫系统失衡状态，为自身免疫性疾病的生物治疗提供了一条新途径。为了达到以上目的，本发明所采用的技术手段为:1、合成编码该LACK蛋白的Th2表位多肽(氨基酸序列156-173)的核苷酸序列，并构建该多肽的表达质粒，免疫小鼠，并观察其对BALB/c小鼠免疫系统的影响。本发明所涉及的LACK蛋白的Th2表位多肽的氨基酸序列是LACK抗原第156-173位氨基酸序列，具体为:ICFSPSLEHPIVVSGSWD (SEQ ID N0.1所示)。2、构建类风湿关节炎动物模型 CAIA (collagen II antibody-1nducedarthritis, CAIA)关节炎小鼠模型，应用该多肽分别在造模前后对小鼠进行免疫或治疗，观察该多肽序列对关节炎发病的预防及治疗作用。3、应用表达质粒对CAIA小鼠进行基因治疗或DNA疫苗免疫，从足肿胀程度、关节炎指数及组织病理学三个角度观察治疗的疗效，并分析该治疗对TLR表达、Treg的功能及TLR的调控作用、以及Thl/Th2/Thl7平衡的影响。研究发现，构建的表达本发明所涉及的多肽序列的DNA疫苗可以有效地防止小鼠关节炎的发病；其基因治疗能够显著抑制病情进展。且这些治疗能够改善机体的免疫失衡，通过调节Toll样受体、调节性T细胞及Thl/Th2/Thl7的免疫平衡状态来达到预防或治疗自身免疫性疾病的目的。在此基础上，本发明提出了一种具有LACK抗原Th2型表位序列的多肽在制备预防或治疗自身免疫性疾病药物中的应用。在本发明中，优选的，所述的多肽具有SEQ ID N0.1所示的LACK抗原Th2型表位序列。更优选的，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。在本发明中，优选的，所述的自身免疫性疾病为类风湿关节炎。此外，本发明还提出了一种编码本发明所述多肽的核苷酸序列在制备预防或治疗自身免疫性疾病药物中的应用。在本发明中，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。在本发明中，优选的，所述的自身免疫性疾病为类风湿关节炎。
进一步的，本发明还提出了一种用于预防或治疗自身免疫性疾病的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗是通过将SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列克隆入p⑶NA3.1表达载体中构建得到。更进一步的，本发明还提出了所述的DNA疫苗在制备预防或治疗自身免疫性疾病药物中的应用。优选的，所述的自身免疫性疾病为类风湿关节炎。相较于现有技术，本发明的有益效果是:1.本发明利用了微生物抗原成分来调节自身免疫病机体的免疫失衡状态，避免了微生物的致病性，又可以有效地改善免疫平衡，从而对自身免疫性疾病实现有效地预防和治疗，为自身免疫性疾病的生物治疗提供了有效的方法，具有极大的社会和经济效益价值。2.本发明中所涉及的多肽序列可以有效地增强正常小鼠的Th2型免疫应答，并且不具有致病性。3.本发明所涉及的多肽序列可以预防和改善小鼠关节炎的发生和进展。4.根据本发明所涉及的多肽的编码序列构建的DNA疫苗可以有效地防止小鼠关节炎的发病；其基因治疗能够显著抑制病情进展。研究显示这些治疗能够改善小鼠机体的免疫失衡，通过调节Toll样受体、调节性T细胞及Thl/Th2/Thl7的免疫平衡状态来达到防病和治病的目的。
图1为LACK蛋白Th2表位表达质粒对正常小鼠免疫系统产生影响；图2为应用LACK蛋白Th2表位表达质粒对CAIA关节炎小鼠关节炎的预防及治疗效果;图3为应用LACK蛋白Th2表位表达质粒治疗后，CAIA小鼠滑膜的细胞因子、转录因子及Toll样受体的表达水平变化图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明内容的具体实施方案如下:1.构建P⑶NA3.1为载体的表达LACK抗原Th2型表位多肽的重组质粒；本发明中的LACK蛋白Th2表位的氨基酸序列为:LACK蛋白氨基酸第156-173位，即 ICFSPSLEHPIWSGSWD (SEQ ID N0.1 所示)；2.进行重组质粒的大量制备；3.应用构建得到的 重组质粒免疫正常小鼠，观察免疫后小鼠免疫系统的变化；4.建立胶原抗体诱导性关节炎(CAIA)小鼠模型，应用构建得到的重组质粒免疫小鼠，观察小鼠关节炎的预防效果，同时分析免疫学机制；5.对已发病的关节炎小鼠模型(CAIA)应用多肽或表达质粒进行治疗，观察治疗效果，并进行免疫学机制分析。实施例1表达LACK抗原Th2型表位多肽的表达载体(pLACK)的构建1.表达质粒的构建:将编码LACK蛋白第156至173位的18个氨基酸的基因片段(ATC TGC TTC TCG CCG TCG CTG GAG CAC CCG ATC GTG GTG TCC GGC AGC TGG GAC， SEQID N0.2所示。)插入真核表达载体pcDNA3.1 (+)(即本实验中使用的空白对照质粒pcDNA)的BamHI和XhoI两个限制性内切酶位点之间，形成本实验中所用的治疗质粒一pLACK，经测序确定治疗质粒PLACK构建成功。将pLACK转入大肠杆菌ToplO中，形成携带治疗质粒的大肠杆菌菌株。2.治疗质粒的大量制备:取携带pLACK表达质粒的大肠杆菌菌株，接种在LB固体培养基上，37°C培养16h，用接种环挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基中，37°C水浴震荡培养16小时。将菌液倒入500ml LB液体培养基中，37°C水浴震荡培养16小时，按照高纯度质粒大提试剂盒说明书操作提取治疗质粒PLACK，溶于高压灭菌的去离子水中，分光光度计测定所提质粒浓度及纯度，并将其浓度调整浓度为lmg/ml，-20°C保存。实施例2构建的LACK蛋白Th2表位表达质粒对正常小鼠免疫系统的影响1.向正常BALB/c小鼠腓肠肌肌肉注射50 μ g的LACK蛋白Th2表位表达质粒(pLACK)或等量的P⑶NA3.1载体质粒作为对照(P⑶NA)。
2.一周后取局部引流淋巴结进行实时定量RT-PCR，分析细胞因子及相关转录因子的表达，结果如图1所示。结果显示，该表达质粒可以有效地增强正常小鼠的Th2型免疫应答，并且不具有致病性。实施例3构建的LACK蛋白Th2表位表达质粒对CAIA关节炎小鼠关节炎的预防及治疗效果1.胶原抗体诱导性关节炎(CAIA)小鼠模型的建立:用无菌PBS溶液将LPS稀释成50μ g/ml。所有造模组小鼠，第14天于尾静脉注入致关节炎的C II单克隆抗体合剂(购于美国Chondrex公司)2mg，第17天，腹腔注射0.5ml含25 μ g LPS的PBS溶液。2.质粒导入干预CAIA小鼠:透明质酸酶用无菌PBS溶液配制成90U/ μ I的溶液。进行质粒注射前，先在腓肠肌部位注射90U透明质酸酶溶液，接着在相同部位注射质粒。分别在造模前和造模后向小鼠注射空白对照质粒P⑶ΝΑ3.1 (P⑶NA)和治疗质粒pLACK各50 Ug (50 μ I)。PBS组小鼠则在腓肠肌部位注射50 μ I无菌PBS溶液作为空白对照。3.CAIA关节炎评价:质粒导入干预后，每天进行I次对造模组小鼠的关节炎评分。评分采用双盲法。评分标准:O分正常；I分红肿涉及一个指关节；2分>2个指关节或整个足爪轻度红肿；3分整个足爪红 肿较重；4分重度红肿，僵直，缺乏弹性。在造模后不同天数对小鼠的关节炎程度进行评分，结果如图2所示。研究结果表明构建的LACK蛋白Th2表位表达质粒可以预防和改善小鼠关节炎的发生和进展。实施例4构建的LACK蛋白Th2表位表达质粒对CAIA小鼠滑膜的细胞因子、转录因子及Toll样受体表达的影响1.CAIA小鼠的基因治疗:CAIA小鼠造模后向小鼠腓肠肌注射空白对照质粒PCDNA3.1 (pCDNA)和治疗质粒pLACK各50 μ g (50 μ I)。PBS组小鼠则在腓肠肌部位注射50 μ I无菌PBS溶液作为空白对照。2.免疫学机制分析 第28天，处死小鼠并分离髌骨和邻近的滑膜组织，Real timeRT-PCR检测滑膜髌骨及淋巴结中细胞因子转录因子的表达。检测结果如图3所示，研究显示这些治疗能够改善CAIA小鼠机体的免疫失衡，LACK蛋白Th2表位通过调节Toll样受体、调节性T细胞及Thl/Th2/Thl7的免疫平衡状态来达到预防或治疗自身免疫性疾病的目的。
权利要求
1.一种具有LACK抗原Th2型表位的多肽在制备预防或治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的多肽具有SEQID N0.1所示的LACK抗原Th2型表位序列。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDN0.1所/Jn ο
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的自身免疫性疾病为类风湿关节炎。
5.一种编码权利要求1所述多肽的核苷酸序列在制备预防或治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特性在于所述的核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的自身免疫性疾病为类风湿关节炎。
8.一种用于预防或治疗自身免疫性疾病的DNA疫苗，其特征在于所述的DNA疫苗是通过将SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列克隆入P⑶NA3.1表达载体中构建得到。
9.权利要求8所述的DNA疫苗在制备预防或治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
10.如权利要 求9所述的应用，其特征在于所述的自身免疫性疾病为类风湿关节炎。
全文摘要
本发明公开了一种具有LACK抗原Th2型表位的多肽在制备预防或治疗自身免疫性疾病药物中的应用，属于生物医药领域。本发明的一种用于预防或治疗自身免疫性疾病的多肽具有利什曼原虫LACK抗原的Th2型表位(氨基酸156-173)序列，研究发现该多肽可以作为生物免疫抑制剂用于预防或治疗自身免疫性疾病。利用本发明的重组多肽进行基因治疗对于自身免疫性关节炎的预防或治疗具有重要的临床意义，同时可以改善体内的免疫系统失衡状态，为自身免疫性疾病的生物治疗提供了一条新途径。
文档编号A61K39/00GK103143005SQ20131005697
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者李洋, 杨帆, 赵艳宁, 彭静, 元绍苓 申请人:哈尔滨医科大学