抗微生物剂的制作方法

专利名称：抗微生物剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离自植物染色质的蛋白成分的用途。更精确地说，本发明涉及分离自植物染色质的蛋白成分被解离后作为抗微生物剂的用途以及生产该蛋白成分的方法。
大多数真核生物产生多种针对感染病原体的保护机制。几种机制建立在那些基本差异的基础上，存在于微生物与复杂多细胞生物的细胞之间的膜组分和结构中，即它们针对敏感微生物的外膜。这些膜由脂质组成，所述脂质具有带有负电荷的首基，这些首基面向外，显然微生物难以抵消通过改变它们的膜组成和结构而产生的影响。因此，具有抗生素作用的物质可能会成为取代抗生素的候选物质。
一个实例是能够在膜之间转运磷脂的磷脂转运蛋白。据报道抗微生物的磷脂转运蛋白得自包括谷类植物在内的一系列植物物种，而且这些蛋白针对不同的病原体具有不同的活性。例如，在US 5,698,200中证实了借助于获自发芽谷粒的含水提取物，植物体能够预防植物致病菌。
然而，研究得最多的一类保护剂是抗微生物肽。抗菌肽被发现存在于所有生物物种体内，所述生物物种的范围从植物和昆虫到动物，包括软体动物、甲壳纲动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物和人。
这些肽与细菌直接发生作用并将细菌杀死。这些肽被称作抗微生物剂是由于它们通常具有宽的活性谱，所述活性包括杀死或中和革兰氏阴性和革兰氏阳性菌、真菌(包括酵母)、寄生虫(包括涡虫属和线虫)、癌细胞、甚至包膜病毒如HIV和单纯性疱疹病毒。总之，这些抗微生物剂是从长度仅仅为12个氨基酸到70个以上残基的分子。已经发现了500多个这种肽。
在这种肽如蜂毒肽、爪蟾抗菌肽、短杆菌肽、杀菌肽和防卫素中几乎总是详细研究阳离子抗微生物肽的抗微生物作用模式。所述抗微生物剂分子还通常损伤受其攻击的生物体的膜。阳离子抗微生物肽被发现具有体外以及体内的杀菌活性。它们杀伤作用快、不易选择出抗性突变体、与常规抗生素、其它肽以及溶菌酶具有协同作用以及能够杀死动物模型体内的细菌。
结果，目前研制出了作为新型抗生素药物的动物源抗微生物肽。实例是合成型的爪蟾抗菌肽(pexiganan)和protegrin的类似物，一种最初从猪嗜中性白细胞中分离得到的抗微生物肽。
然而，对于新型取代抗生素的生产来说，天然来源被证明是经济上盈利的。唯一例外的是抗微生物肽乳链球菌肽，该肽可以利用对该物质具有高抗性的乳球菌菌株来进行有效生产。
还发现愈来愈多的较大分子的蛋白或其片段具有抗微生物活性。例如，鼠类巨噬细胞蛋白，遍在蛋白似乎与核糖体蛋白S30相同。并且，牛蛙(Rana catesbeina)胃中的两种抗菌肽得自胃蛋白酶的N-端。同样，被称作蟾蜍素I(buforin I)的抗微生物肽是从亚洲蟾蜍(BBRC218408，1996)的胃组织中分离得到的。39个氨基酸长肽的氨基酸序列被发现与非洲蟾蜍组蛋白H2A的39个氨基端残基中的37个相同。
另外，完整蛋白分子可能具有抗微生物潜力。在大西洋鲑鱼(BBRC284549，2001)的肝、肠和胃的酸性提取物中检测到了抗微生物活性。利用酸性提取物通过硫酸铵沉淀、大规模凝胶色谱(凝胶过滤)、反相HPLC和大小排阻HPLC可以从鲑鱼肝脏中分离相应的抗微生物蛋白。所述鲑鱼抗微生物(SAM)蛋白的分子量为27.7Kd并且被鉴定为组蛋白H1蛋白。在WO 200110901中，在用于治疗不同真核生物的微生物感染的抗微生物组合物中采用了得自牛胸腺的哺乳动物组蛋白H1蛋白。因此，具有其它明确功能的蛋白似乎具有抗微生物的第二特性。
然而，应当避免使用牛蛋白，具体地是得自牛胸腺的蛋白，这是因为这种物质可能污染了有害病毒，具体地是肝炎病毒或其它病原体，例如朊病毒。牛物质-无论是否被污染，当计划被用于人体时，都必须进行极其严格的检测。
而且，新型取代抗生素的分离包括收集特定动物器官或组织，然后进行复杂的纯化程序从而获得能被用于人或家畜的产品。
本发明的目的在于提供一种新型抗微生物剂，其中克服了上述缺陷。
本发明的另一个目的在于提供一种抗微生物剂，其中避免了对人和/或动物致病的感染病原体进行传代的风险。
另一个目的在于提供一种当在食物中使用时无味的抗微生物剂。
本发明的另一个目的在于提供一种生产抗微生物剂的方法，在该方法中使用了廉价的原材料。
另一个目的在于提供一种实施规模不受限制的抗微生物剂生产方法。
另一个目的在于提供一种生产抗微生物剂的方法，该方法不需要投资制备细菌发酵设备。
这些目的通过利用本发明要求的用途和方法来实现。
根据本发明，提供了一种简单易行的生产蛋白成分的方法，所述蛋白成分可被用作抗微生物产品，例如被用作药物，一种生产和运输过程中使用的全防腐剂、一种功能食品和/或营养药物(neutraceutical)添加剂以及动物饲料添加剂。
蛋白成分可以非常容易地由含植物染色质的惰性原材料来制备。在本发明的方法中，DNA是由植物碱性核染色质分离的。优选地，所述植物染色质得自于植物种子。合适的植物种子得自燕麦、高粱、买罗高粱、小麦、大麦、黑麦、玉米、稻子、油菜、大豆、谷子或荞麦。然而，任何含染色质的植物材料如海藻和其它海洋植物可以被用来大规模制备抗微生物的蛋白成分。
用于分离蛋白成分的植物染色质应当是异染色质(沉默染色质或“无用”DNA)。异染色质是次乙酰化的(去乙酰化的)染色质，由于正电性较高所以其结构的凝聚性比过乙酰化的染色质更强。
另外，用于进一步提取特定蛋白的染色质原材料的选择还取决于植物细胞组织的定位和分化状态。例如，由小细胞组成的组织具有更高的细胞密度，因此可能比另一种具有较大细胞尺寸的等量组织含有更多的核酸和伴生抗菌性蛋白成分。
同样，由于异染色质的含量很高而使得多种植物带有非常大的基础基因组，由于可能存在的多倍性而进一步增加。就此而论，涉及到以碱基对数目形式测定的(c-值)每个单倍体细胞的DNA含量。生物体的DNA含量的变化反映在DNA c-值或基础基因组的大小上。c-值被定义为通过对在所述生物细胞内发现的单拷贝DNA全序列中的碱基对重量或数目进行测定而确定的DNA含量。就是核DNA在其未被复制的单倍体或配子核中的含量，而与分类群的倍性水平无关。因此，c-值相当于二倍体物种体内的基因组尺寸，但总是超过多倍体物种体内的基因组尺寸。
而且优选地是采用自我更新的未分化的植物干细胞。这些干细胞是在分生组织、枝条和根尖的新生部位内发现的。因此，植物幼苗的根尖是提取染色质并随后下游分离本发明的蛋白成分的优选原材料。作为酿酒麦芽和小麦胚油生产过程中的废料，可以不限量地方便获取这种原材料。
在最适生长条件下细胞进行有丝分裂的其它植物原材料也适于制备本发明的蛋白成分。可以使用发芽期的任何幼芽和小根或胚芽。优选地可以使用四种玉米之一的能够发芽的种子。
本发明可以使用的有价值的原材料是被称作绿麦芽的原材料，该原料被用作啤酒生产的原材料。酿造业由大麦生产绿麦芽，该绿麦芽被润湿后进行6天的发芽(发麦芽)。工业上生产的这种绿麦芽或其副产品(叶根苗(rootlings))可以在本发明中被用于生产抗微生物蛋白成分。
因此，二倍体玉米和大麦(DNA的c-值为5,000Mbp)以及洋葱(DNA的c-值为18,000Mbp)的叶根苗是合适的原始提取材料。优选地，抗菌蛋白成分是从DNA的c-值超过了3,000Mbp的染色质源中提取的。
特别优选地是纯化过程的原材料含有分离自S-期的增殖植物细胞的植物染色质。带有叶根苗以及嫩叶的发芽种子(谷粒)因而含有大量的S-期细胞。
本发明的生产具有抗微生物活性的植物蛋白成分的方法包括以下步骤对植物材料进行均质化以便使植物染色质暴露出来；采用离解剂在疏水条件下解离植物染色质；和通过疏水作用分离方法将解离的染色质分离成各个级分，其中一个级分含有所述的植物蛋白成分。
因此，首先对植物材料进行均质化。在这方面，均质化作用是指破坏植物材料的细胞壁，以这种方式使得植物的染色质暴露出来并同时获得了匀浆。可以通过本技术领域中的技术人员已知的多种方法中的任一种来破坏细胞壁，这些方法包括但不限于高剪切混合、超声波、机械裂解、通过增压进行爆裂等。细胞壁通过合适的装置来进行裂解，从而获得匀浆。
然后通过利用离解剂的水溶液在疏水性条件下解离匀浆中的植物染色质。这类条件是那些促进疏水作用的条件。
合适的离解剂是尿素、氯化胍和氯盐。氯盐优选地是高离子强度的氯化纳。
有利的是植物材料的均质化是在离解剂中进行的。以这种方式可以使纯化过程操作简单并且可以省去若干纯化步骤。
通过在含4M氯化纳的几乎饱和的盐溶液中对麦芽进行均质化作用来开始绿麦芽的纯化过程。通过高离子强度作用解离染色质以及核小体，同时避免了蛋白酶对蛋白成分的同步降解。优选地所述均质化作用是在有疏水性基质存在的条件下进行的。
然后可以用筛或金属丝网等对所述匀浆进行筛分从而除去保留在其上的细胞碎片或其它源自植物染色质的颗粒。这样就获得了一种清澄的溶液从而便于对被解离的植物染色质进行后续纯化。
然后将被解离的植物染色质分离成各个级分，其中一个级分含有具有抗微生物活性的植物蛋白成分。所述级分的分离优选地通过疏水作用分离方法来进行。优选地，所述疏水作用分离方法是疏水层析。
适当的分离方法的其它实例是在聚合体系统中进行的分配，诸如分配色谱、逆流分布和气相分配(gas aphron partition)。或者被解离的染色质成分的分离可以利用载有金属螯合物凝胶或固定化肝素的柱子来进行。
用于疏水作用和/或分离过程中的基质的功能性配体应当是醚、异丙基、丁基或辛基。应当避免使用苯基。优选地，功能性配体是交联度达到4％的琼脂糖基质上的丁基。达到了40-50μmol/ml的配体密度，结果产生7mg IgG/ml的结合能力。
例如，筛滤了绿麦芽匀浆后，将疏水性基质分批加到所获得的溶液中，所述疏水基质是含有活性丁基的疏水作用色谱凝胶(HIC)。合适的基质是购自Inovata AB，Bromma，瑞典的NovaroseS-Butyl1000/40和购自Amersham Pharmacia Biotech，瑞典的ButylSepharose4。然后用高离子强度的盐溶液冲洗疏水性基质从而洗脱出DNA。
绕后将所述基质注入到柱子中并用离子强度递减的氯化钠进行梯度洗脱。在1M NaCl浓度下洗脱出清晰可见的抗微生物蛋白成分。
所述蛋白成分可以通过适于肽/蛋白纯化的常规方法来进一步进行纯化。这些方法包括离心、等电点沉淀、相分离、超滤、凝胶色谱(大小排阻层析)、离子交换层析或HPLC以及这些方法的组合。优选地，后续分离过程是凝胶色谱或离子交换层析。
最优选地是，制备型凝胶色谱步骤是在填装了排阻限为100kD的凝胶的柱子中完成的。所述柱子在装载具有抗生素活性的1M NaCl的级分前用蒸馏水进行平衡。然后用蒸馏水或醋酸铵洗脱柱子。这样在一个且同一步骤中同时达到了脱盐和纯化的目的。由此蛋白成分不需要进一步的纯化步骤，例如通过冻干法就能被浓缩至干。
分离出了表观分子量在10至20kD之间的具有抗微生物特性的蛋白级分。
本技术领域的技术人员能够理解所述蛋白成分的纯化也可以通过本技术领域的技术人员已知的其它多种方法来完成，所有这些方法都被包括在本发明中。
一种络合剂如肝素、藻酸、肌醇六磷酸或钒化合物也可被用作离解剂，条件是它能够将植物染色质解离成其单个组分。作为离解剂，形成藻酸盐与抗微生物活性的蛋白成分的络合物，藻酸是特别优选的。这种络合物可被用于纯化目的或被用于抗微生物活性从中缓慢释放。
在按照本发明利用例如疏水作用分离方法将被解离的植物染色质分离成各个级分前，被解离的染色质的原材料中根本不存在抗微生物活性。当植物蛋白成分按照本发明的方法进行纯化时，异染色质被自动利用。因此，通过物理分离染色质成分可以连续产生生物活性。从理论上讲，分离方法能够使所述成分的分子结构发生改变。
通常认为抗微生物肽通过正电荷作用于原核生物。预计按照本发明的方法获得的蛋白成分的最可能的作用机制与其它阳离子多肽的已知作用机制没有区别。然而，已知的碱性肽能够实现与细胞膜的相互作用，该作用与洗涤剂的作用相类似。蛋白成分的这种作用机制通过其针对革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌的活性而得到证实。
根据本发明，从疏水性基质中洗脱出来后可以利用其它纯化方法从其它植物材料中获得其它抗微生物活性的蛋白成分。这是由于源自不同生物材料的蛋白质具有不同的后合成修饰模式，该模式反映出植物材料的细胞活性。因此，分离模式应当受例如按照本发明获得的蛋白成分的乙酰化、磷酸化、甲基化、遍在蛋白化、糖基化以及ADP-核糖基化程度的影响。
相应地，从植物染色质中分离出的蛋白成分接下来可以进行化学修饰。这种修饰包括分子量和/或乙酰化程度方面的变化并且会产生生物活性的特异性更强的制剂形式。
由本发明的方法获得的蛋白成分的抗微生物效果可以通过采用标准化的Bioscreen方法，以乳链菌肽作为对照物来进行测定。与乳链菌肽相比，采用蛋白成分获得的效果相当于2-4mg/ml，该效果是cidal。而且，获得了抗革兰氏阴性菌的效果，该效果是乳链菌肽所不具备的。
本发明的简单纯化方法使得抗微生物蛋白成分的生产不受实施规模的限制。该方法的产率达到约1g蛋白/kg原材料(例如叶根苗)。通过利用蛋白合成最多的发芽种子可以使产率最大化，就象例如通过进行6天的发麦芽所显示的。当使用S-期的增殖植物细胞时，天然染色质蛋白的合成达到最大化并且能占所合成总蛋白的80％。
根据本发明从植物染色质中分离得到的作为抗微生物剂的蛋白成分可以通过与一种或多种抗微生物增效剂结合而得到加强。这种抗微生物增效剂的实例是溶菌酶、精蛋白、螯合剂、正铜化合物和杀菌素。
所述植物染色质蛋白成分适用于生产用于治疗微生物感染的药物组合物。本发明还涉及一种用于治疗包括人在内的哺乳动物的微生物感染的方法，其中施用了治疗有效量的蛋白成分。
所述蛋白成分可以口服使用以便治疗牙齿和牙床疾病，局部外用以便治疗诸如皮肤病、皮肤和头发疾病和耳-眼科疾病。所述植物染色质蛋白成分还可被用于体腔如口、喉、肺、阴道和直肠，以及在摄入了致病性微生物后用于治疗胃肠疾病的单次口服。
当蛋白成分被用作抗微生物剂时，可以将其配制成含多种盐和缓冲剂的缓冲含水介质。优选地，所述盐是碱和碱土卤化物，例如氯化钠、氯化钾或硫酸钠。可以使用各种诸如缓冲剂如柠檬酸盐、磷酸盐、HEPES、Tris等，针对其目的这种缓冲剂的使用量是生理可接受的。
可以使用各种赋形剂或其它添加剂，在这种情况下将所述蛋白成分配制成冻干粉末以便随后以溶液形式使用。所述赋形剂可包括各种多元醇、惰性粉末或其它膨胀剂。
本发明的用途还包括一种含杀死细菌或真菌有效量的纯化蛋白成分和适当载体的组合物。这种组合物可以以多种抵抗细菌和真菌的方式进行使用，例如在家庭或实验室使用的抗微生物制剂中使用了本技术领域中公知的载体。
不同组合物针对不同的微生物具有不同程度的活性。本技术领域的技术人员可以容易地测定用于杀死有害微生物如细菌和真菌和其它有害病原体的有效量。
本发明的蛋白成分还可以与其它作为防腐剂的蛋白质结合从而防止该蛋白成分发生蛋白降解。或者，本发明的蛋白成分或组合物可以作为防腐剂或消毒剂用于多种制剂中，诸如用于接触镜片溶液、软膏、洗发剂、药物、食品等中。蛋白成分的用量根据其它成分的性质、所需的抗微生物防护程度和所述组合物的目的用途来进行变化。
所述蛋白成分例如可以与合适的载体一起在一种表面消毒和冷冻灭菌的组合物中使用和用作为食品高压巴氏消毒的辅剂以及在组合物中作为水防腐剂，例如在鱼养殖中作为水防腐剂。当被包封在填充材料中以便从中进行缓释时，所述蛋白成分还能以杀菌有效量进行使用。
实施例参照下列实施例将对本发明进行进一步的描述和说明。然而应当注意，无论如何这些实施例不应被解释为是对本发明的限制。
实施例1.抗菌测定以其两倍的浓度向微滴板上的各孔中注入300μl培养基(营养肉汤+1％葡萄糖)。加入样品一式两份至蛋白成分的终浓度分别为2、0.5和0.2mg/ml蛋白。
使用两种测试微生物荧光假单胞菌(革兰氏阴性需氧细菌)和无害李斯特氏菌(革兰氏阳性需氧细菌)。
所述细菌菌株的过夜培养物用蛋白胨水溶液进行稀释，并将50μl的每个菌株加到孔中，其浓度为104个细胞/ml。使用了不含测试细菌材料的对照孔(阳性对照)。
于30℃下将所述平板在Bio-screen分析装置中温育72小时，每15分钟记录增加的可见光吸光度，该吸光度代表细菌的生长。
实施例2.提取和分级分离当对植物蛋白和多肽进行提取和分级分离时，由于植物组织在结构、生理学和生物化学功能方面存在着差异，因此常常不能使用常规或传统的动物缓冲液和/或浸渍技术。植物组织内的大分子组分(例如酚化合物、碳水化合物和烃化合物)和相互作用愈复杂以及细胞壁愈致密，则需要植物提取制剂的浸渍和分离方法的条件愈严格，从而保证多肽的完整性。
对大麦叶(1kg，鲜重)进行提取和分级分离，该提取和分级分离采用的是由Langenbuch等，Plant Molecular Biology 2，207-220(1983)记载的方法。采用0.4N的硫酸获得了大麦的核染色质，产率通常为10-20mg.。
接着进行特殊的次分级分离技术的操作来对蛋白成分进行大规模的制备型分离。利用在乙醇(80％)HCl(0.25N)中的溶解度上的差异获得了特定的蛋白成分(MW 17,300)。
测定所述蛋白成分抵抗普通住屋李斯特氏菌和假单胞菌菌株的抗微生物活性。
通过采用既溶解于乙醇又溶解于水的级分实现了对两种微生物生长的总抑制作用。该效果是浓度依赖型的，即必须达到一定的临界值(稀释度为1∶1时没有获得效果)。
抗微生物活性仅仅局限于特定的MW17300蛋白成分。分子量较大的蛋白成分没有活性。
实施例3.其它的提取和分级分离方法按照Sidorova & Konarev，Biokhimiia 46，1298(1981)中所记载的方法对两周龄的豌豆、小麦、黑麦和棉花幼苗进行次分级分离。
得到MW 17300的特定蛋白成分和分子量更大的蛋白成分。
测定所述蛋白成分的抗微生物活性并且结果与实施例1中的结果相同。
实施例4.改进的分级分离方法从本地的酿酒厂获得绿色麦芽。利用常规的麦芽处理方法使该麦芽发芽6天。
将绿色麦芽(100g)悬浮在4M NaCl中并在Braun混合器中进行大约10分钟的均化。利用20μm的滤网对匀浆进行过滤，然后将得到的溶液加到20g的疏水性基质(NovaroseS-Butyl 1000/40Inovata AB，瑞典)中，该疏水性基质被4M NaCl所平衡。将该混合物搅拌10分钟并利用40μm的滤网对基质进行过滤。
然后将所述基质装载到柱(25×50mm)上并在洗脱前用4M NaCl进行冲洗。正如在254nm下所测得的洗脱液的吸光度增加了一样，在该高离子强度下，DNA不与所述基质结合，因而在装柱和柱冲洗过程中被洗脱出来。
在分别用2M NaCl、1M NaCl和水分步洗脱后，通过276nm下的UV吸收来记录不同的蛋白峰。这与非染色质物质在2M NaCl下的解吸作用一致。
实施例5.次分级分离方法利用NovaroseSE-100/40，(Inovata AB，瑞典)的柱子(25×500mm)通过制备型凝胶色谱手段以0.1M醋酸铵对在实施例4中于1MNaCl下解吸下来的级分进一步进行次分级分离。
获得了三种蛋白级分并进行冻干。中间蛋白级分的保留体积相应于分子量在10至20Kd之间。
因此，在该分子量范围内的低乙酰化的疏水性碱性蛋白中，植物染色质是用于分离的合适来源，其中所述疏水性碱性蛋白带有较多的正电荷。
通过利用NovaroseSE-100/17，(Inovata AB，瑞典)的柱子(8×300mm)在pH 7.0的0.1M磷酸盐缓冲液中进行分析型的凝胶色谱，发现该级分的平均分子量约为14kD。
实施例6.其它的分级分离方法以与实施例4同样的条件但以NovaroseS-Phenyl(Inovata AB，瑞典)为疏水性基质进行对比实验。当用1M NaCl洗脱柱子时未能检测到蛋白的解吸，用水洗脱后只获得了一个级分。22％的乙醇水溶液也没能使蛋白物质从疏水性基质上解吸，表明基质与蛋白物质间结合的疏水性极强。
实施例7.抗微生物活性的确定检测按照实施例5获得的中间级分的抗微生物活性。通过将冻干级分溶解在磷酸盐缓冲液(pH 7，0)中，使浓度达到4mg/ml来制备样品。然后用磷酸盐缓冲液将这些溶液稀释四至十倍。
当按照实施例4和5的方案进行制备时，所得到的结果与实施例5中由MW17,300的特定蛋白成分获得的结果密切相关。
应当注意的是由凝胶色谱方法得到的其它级分根本不具有抗微生物活性。
实施例8.c-值的效果按照实施例4和5中记载的方法从72小时的拟南芥和小麦幼苗的染色质中分离抗微生物活性相似的蛋白成分。这些物种的10-20kD的中间级分的平均产率显著不同，相对而言小麦是非常合适的提取源。与大麦相比，所需的级分以约两倍的含量存在。
实施例9.分析电泳按照标准方案(Panyim & Chalkley，Biochem.83972，1969)进行的分析电泳显示出多个MW17,300的特定蛋白成分的变体，而没有显示分子量在28,000和35,000间的蛋白成分的具有较高分子量的次级级分。
这些结果还反映了植物物种间在基因组大小上存在着差异。与小麦相比，拟南芥具有200Mbp的小二倍体基因组和较低的产率，所述小麦具有17.000Mbp的大六倍体基因组。
因此，提取率与以c-值表示的基因组大小密切相关。
对比实施例1.与动物组蛋白的比较由于在实施例5的缓冲分离介质中进行的色谱分析产生分子量约为14kD的分子，该分子量对应于牛组蛋白H2A和H2B的分子量，所以进行了本发明的蛋白成分与动物组蛋白之间的比较。
通过在pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液中利用NovaroseSE-100/17，(Inovata AB，瑞典)的柱子(8×300mm)进行分析凝胶色谱来对商购的牛组蛋白H2A和H2B(Sigma，USA)和实施例4中得到的分子量在10和20kD之间的中间级分进行平行对照实验。
测定获得的所有级分的抗微生物活性，重复分离自植物染色质的蛋白成分的阳性结果。
另一个对比实验证明接近空白的第一个级分不具有任何抗微生物活性，该第一个级分预计是植物组蛋白H1的位置。而且，再一次证明在动物与植物之间，核小体在盐溶液中的解离模式存在着差异，并且用于动物的常规方法不能用于植物。
对比实施例2.水性溶剂的提取提取完整植物组织多肽的方法很少。所使用的方法能够制备各种组织的级分，这些级分富含亚细胞成分。相反，对于动物系统来说已经记载了多种大体上“通用的”制备技术。
这种技术由Karen Barrett，US 5698200进行了研究，同时检测了几种简单的针对发芽谷粒的水性溶剂提取方法。
US 5698200的实施例1和2中公开的相同下游技术被用于作为原材料的大麦叶(参照实施例2)。
仅仅鉴定了10-20kD范围内的贮存蛋白。这些蛋白根本不具有任何抗细菌活性。
得出的结论是通过US 5698200中记载的任何方法都不能使染色质释放出来，所述原材料是胞质物质。最有可能的是，获得了硫素，该硫素是公知的植物防御素，其特征是2-3kD低分子量的细胞毒性硫多肽。
权利要求
1.分离自植物染色质的蛋白成分在被解离后作为抗微生物剂的用途，所述蛋白成分的表观分子量在10至20kD之间。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述植物染色质是异染色质。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述植物染色质具有超过3000Mbp的DNA c-值。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述植物染色质得自植物种子。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述得自植物种子是得自燕麦、小麦、大麦、黑麦、玉米、稻子、油菜、大豆、谷子或荞麦。
6.如权利要求4或5所述的用途，其中所述植物染色质得自发芽过程中的所述种子。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述抗微生物剂是抗革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌的。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述革兰氏阳性菌是无害李斯特氏菌。
9.如权利要求7所述的用途，其中所述革兰氏阴性菌是荧光假单胞菌。
10.如权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述蛋白成分与至少一种抗菌增效剂联用。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述至少一种抗菌增效剂是溶菌酶、精蛋白、螯合剂、正铜化合物或杀菌素。
12.如权利要求1至11中任一项所述的用途，其中所述蛋白成分与一种络合剂进行络合以便从中缓慢释放。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述络合剂是藻酸。
14.如权利要求1至13中任一项所述的用途，其中所述蛋白成分以杀菌有效量与适当的载体一起被含在一种作为食品添加剂的组合物中。
15.如权利要求1至13中任一项所述的用途，其中所述蛋白成分与适当的载体一起被含在一种作为促进生长的动物饲料添加剂的组合物中。
16.如权利要求1至13中任一项所述的用途，其中所述蛋白成分以杀菌有效量与适当的载体一起被含在一种组合物中，该组合物用于表面的消毒和冷消毒并且作为食品高压巴氏消毒的辅剂。
17.如权利要求1至13中任一项所述的用途，其中所述蛋白成分以杀菌有效量被包封在填充材料中以便从中缓慢释放。
18.如权利要求1至13中任一项所述的用途，其中所述蛋白成分以杀菌有效量与适当的载体一起被含在一种作为水防腐剂的组合物中。
19.如权利要求18所述的用途，其被用于养渔业。
20.一种生产具有抗微生物活性的植物蛋白成分的方法，其包括以下步骤对植物材料进行均质化以便使植物染色质暴露出来；采用离解剂在疏水条件下解离植物染色质；和通过疏水作用分离方法将解离的染色质分离成各个级分，其中一个级分含有所述的植物蛋白成分。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述的均质化是在所述的离解剂中进行的。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述离解剂是尿素、氯化胍或氯盐。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述氯盐是氯化钠。
24.如权利要求20或21所述的方法，其中所述离解剂是络合剂，与所述蛋白成分形成一种络合物。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述络合剂是肝素、藻酸、肌醇六磷酸或钒化合物。
26.如权利要求20所述的方法，其中进行了所述的分离。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述疏水作用分离方法是疏水性层析、金属螯合层析、分配层析、逆流分布或气相分配。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述疏水作用分离方法中的功能性配体是乙醚、异丙基、丁基或辛基。
29.如权利要求26所述的方法，其中在所述疏水作用分离过程之后接着另一个分离过程。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述另一个分离过程是凝胶色谱或离子交换层析。
31.分离自植物染色质的蛋白成分在被解离后在制备用于治疗微生物感染的药物中的用途，所述蛋白成分的表观分子量在10至20kD之间。
32.用于治疗包括人在内的哺乳动物体内微生物感染的方法，其中施用了治疗有效量的被解离后的蛋白成分，所述蛋白成分分离自植物染色质，其表观分子量在10至20kD之间。
全文摘要
本发明涉及分离自植物染色质的蛋白成分在被解离后作为抗微生物剂的用途，所述蛋白成分的表观分子量在10至20kD之间。所述植物蛋白成分通过包括以下步骤的方法来生产对植物材料进行均质化以便使植物染色质暴露出来；采用离解剂在疏水性条件下解离植物染色质；和通过疏水作用分离方法将解离的染色质分离成各个级分，其中一个级分含有所述的植物蛋白成分。
文档编号A23K1/175GK1561164SQ02819376
公开日2005年1月5日 申请日期2002年8月28日 优先权日2001年8月29日
发明者U·罗瑟曼 申请人:瑞典环境Svv股份公司