专利名称：抗微生物剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗微生物剂。更准确地讲，本发明涉及一系列脱水果糖衍生物的抗微生物活性。
各种原因造成的食物腐败见于文献中，已知各种化学药品可抑制一种原因造成的各方面的降解。已知降解和新鲜割伤植物部分颜色或香味的丧失是由于氧化作用、酶、微生物和金属离子引起的。例如，已知酸化剂通过保持相对低pH环境可防止微生物降解，但其有效性仅仅是暂时性的。
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是可以污染某些食物的生物的一个例子，所述细菌表现出对多种理化处理有抗性。单核细胞增生李斯特氏菌是一种主要在免疫妥协患者和新生儿中引起严重感染的革兰氏阳性芽孢杆菌。脑膜炎和菌血症都是李斯特菌病最为常见的表现形式。
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)是食物中毒的另一种常见病因。已鉴定出两种不同的临床综合征，第一种具有约4小时的短潜伏期，第二种的潜伏期约为17小时。蜡状芽孢杆菌食物中毒当孢子形成没有烹调杀死时且让污染食物达到允许所述孢子萌发和释放肠毒素的温度时发生。
其中有2000多种不同菌株的沙门氏菌属(Salmonella)，是人类食物中毒的另一病因。沙门氏菌属是棒状革兰氏阴性肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的一个属，它在肠内定居且引起各种感染例如胃肠炎和伤寒。当侵入时，它们可以引起伤寒(例如，由伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)引起的伤寒或由副伤寒沙门氏菌(Salmonellaparatyphi)引起的副伤寒)。沙门氏菌属中的其它菌株与食物中毒有关(通常是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、巴拿马沙门氏菌(Salmonella panama)或肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)，后者是众所周知的家禽污染物)且偶尔在非肠组织中引起败血症。
本领域众所周知的是，沙门氏菌属不能在pH值低于4.5的情况下繁殖。因此，弱酸性制品例如精制食品和非发酵肉制品对沙门氏菌属的攻击尤其敏感。
对于肉制品，通常用亚硝酸盐作为防腐剂。然而，亚硝酸盐的添加由于其有毒而受到限制(由于其急性毒性以及有与亚硝胺生成相关的危险性)。由于沙门氏菌属仅在亚硝酸盐浓度超过1,000ppm才被抑制，而这远远超过法规的限制。
然而，已经显示亚硝酸盐和山梨酸的组合可以增加对沙门氏菌属的有效性[亚硝酸钠和山梨酸钾可抑制沙门氏菌属，载于Frankfurters，Journal of Food Science，47，1982，第1615 ff页]。在浓度超过50ppm的亚硝酸盐联用2600ppm山梨酸时已经观察到抑制作用。
诸如细菌素(Nisin)的其它试剂不能抑制食物中的沙门氏菌属，而苯甲酸由于只能在酸性制品中观察到抑制效应而不太适用。也测试了从不同诸如得自不同香料的油提取物的植物成分(“天然物质”)的抑制效应，但是再次证明达到对沙门氏菌属的抑制效应的所需浓度太高，而且对食物的感官影响太强。
因此，迄今为止，化学物质的应用因为以下原因而严重受限一方面，根据毒理学观点它们必须是安全的，而另一方面，它们必须在感官上不影响所述产品。
本发明力图解决与现有技术化学物质相关的问题，提供基于脱水果糖衍生物的新型抗微生物组合物。具体地说，本发明力图提供适合用于食品/饲料的抗微生物剂。
在第一个方面，本发明提供包含具有式I的环状化合物的抗微生物组合物， 其中R1和R2独立地选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立地选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基或者其中R4和R5代表与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。
本发明的第二个方面提供一种防止和/或抑制某种物质中微生物生长和/或杀死所述微生物的方法，所述方法包括将所述物质与具有式I的环状化合物接触的步骤， 其中R1和R2独立地选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立地选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基或者其中R4和R5代表与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。
在第三个方面，本发明涉及具有式I的化合物在防止和/或抑制某种物质中微生物生长和/或杀死所述微生物中的应用， 其中R1和R2独立地选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立地选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基或者其中R4和R5代表与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。
人们将会认识到，术语“酯基”是指式X-C(O)O-Y的基团，其中X和Y均为烃基。
所述物质最好是食品或饲料。因此，在一个优选的方面，本发明涉及适合用于食品和/或饲料中的抗微生物物质，以抑制食物中毒和其中所含有的腐败菌。
在另一个优选的实施方案中，所述物质是家用品、机体护理品或化妆品例如花露水。
作为定义，术语“抗微生物剂”是指杀死或防止或抑制微生物生长或繁殖的物质。抗微生物剂一般依照它们有效抵抗的微生物类型来分类。例如，抗细菌物质有效抵抗细菌，抗真菌物质有效抵抗包括酵母在内的真菌，而抗病毒物质有效抵抗病毒。某些抗微生物剂可以在体内使用例如抗生素类药物，而其它抗微生物剂仅可外用例如防腐剂。
本文所用的术语“烃基”是指包含至少C和H的基团并且可以任选包含一个或多个其它合适的取代基。这类取代基的实例可包括卤基-、烷氧基-、硝基-、羟基、羧基、环氧基、丙烯基、烃基、N-酰基或环基等等。除所述取代基可为环基外，所述取代基的组合也可以形成环基。如果烃基包含不止一个C，则那些碳不一定需要相互连接。例如，所述碳中至少2个可以通过合适的元素或基团连接。因此，烃基可以含有杂原子。合适的杂原子对本领域技术人员而言是显而易见的，包括例如硫、氮和氧。
在一个更优选的方面，本发明的环状化合物是具有式II的化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5如上文限定。
优选所述环状化合物是具有式III的化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5如上文限定。
在一个优选的实施方案中，所述环状化合物为式IV化合物， 其中R1和R2独立地选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立地选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基或者其中R4和R5代表与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中R6和R7各自独立地选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基，或者其中R4和R5代表与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。
更优选所述环状化合物为式V化合物， 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7如上文限定。
优选R1选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基。
优选R2选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基。
优选R3选自包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基。
甚至更优选R3为-OC(O)R’，其中R’为H或烃基。
甚至更优选R3为-OC(O)R’，其中R’为烃基。
在一个优选的实施方案中，R3为-OC(O)R’，其中R’为R”基团。
优选R’和/或R”为支链或直链、取代或未取代的烷基。
更优选R’和/或R”为(CH2)pCH3，其中p为1-24。
甚至更优选R’和/或R”为C8烷基。
在另一个优选的实施方案中，R’和/或R”为C12烷基。
在另一个优选的实施方案中，R’和/或R”为C16烷基或C18烷基。
在本发明的一个优选实施方案中，R3为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)pCH3，其中n和p各自独立地为1-24。
更优选R3为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)7CH3，其中n为1-24、最好是1-20、最好是1-10、最好是1-5或者最好是1、2或3。
在一个替代优选实施方案中，R3为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)11CH3，其中n为1-24、最好是1-20、最好是1-10、最好是1-5或者最好是1、2或3。
在一个优选的实施方案中，R4选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基。
在一个特别优选的实施方案中，R4选自烃基、H、OH和＝O。
在一个优选的实施方案中，R5选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基。
在一个特别优选的实施方案中，R5选自烃基、H、OH和＝O。
在一个优选的实施方案中，R4和R5代表与所述环状化合物环上与相邻原子的化学键。
在一个尤其优选的实施方案中，所述化合物被酯化为脱水果糖，其中脱水果糖的至少一个OH基团被酯化，形成-OC(O)R基团，其中R为烃基。
优选R为支链或直链、取代或未取代的烷基。
甚至更优选R为(CH2)pCH3，其中p为1-24。
再更优选R为C8烷基。
在一个替代优选实施方案中，R为C12烷基。
在另一个优选的实施方案中，R为C16烷基或C18烷基。
在本发明的一个优选实施方案中，所述环状化合物为下式化合物 在本发明的一个优选实施方案中，环状化合物为下式化合物 更优选所述环状化合物选自以下化合物 更优选所述环状化合物选自以下化合物 优选本发明的化合物为壳二孢吡喃酮(Ascopyrone)P、壳二孢吡哺酮M、壳二孢吡喃酮T、壳二孢吡喃酮T1、壳二孢吡喃酮T2、壳二孢吡喃酮T3的衍生物和它们的混合物的衍生物。
甚至更优选本发明的化合物选自酯化壳二孢吡喃酮P、酯化壳二孢吡喃酮M、酯化壳二孢吡喃酮T、酯化壳二孢吡喃酮T1、酯化壳二孢吡喃酮T2、酯化壳二孢吡喃酮T3和它们的混合物。
壳二孢吡喃酮P、壳二孢吡喃酮M、壳二孢吡喃酮T、壳二孢吡喃酮T1、壳二孢吡喃酮T2和壳二孢吡喃酮T3的结构如下所示。 壳二孢吡喃酮M壳二孢吡喃酮P壳二孢吡喃酮T 壳二孢吡喃酮T1壳二孢吡喃酮T2壳二孢吡喃酮T3壳二孢吡喃酮是一种已知的化合物。在1978和1981年，一个美国科学家小组为了应用壳二孢吡喃酮P作为有机合成的原材料而在Montana的Wood Chemistry laboratory通过热解胶淀粉、直链淀粉和纤维素来制备壳二孢吡喃酮P[Shafizadeh，F.，Furneaux R.H.，Stevenson，T.T.和Cochran，T.G.，1，5-脱水-4-脱氧-D-甘油-己-1-烯-3-酮糖和纤维素的其它热解产物，Carbohydr.Res.67(1978)433-447；Stevenson，T.T.，Stenkmap，R.E.，Jensen，L.H.，Cochran，T.T.，Shafizadeh，F.和FurneauxR.H.，1，5-脱水-4-脱氧-D-甘油-己-1-烯-3-酮糖的晶体结构，Carbohydr.Res.90(1981)319-325]。他们通过例如1H和13C NMR以及IR光谱学技术表征了壳二孢吡喃酮P。提供了壳二孢吡喃酮P的三维结构。通过热解获得的壳二孢吡喃酮P的收率低于3％并且必须使用复杂的分离方法。
关于壳二孢吡喃酮P天然存在于得自Alps的非常少研究的真菌的某些种型中已有陈述[M.-A.Baute，G.Deffieux，J.Vercauteren，R.Baute和Badoc A.，盘菌目和块菌目酶活性降解1，4-α-葡聚糖为壳二孢吡喃酮P和壳二孢吡喃酮T(Enzymatic activity degrading 1，4-α-glucans toAscopyrones P and T in Pezizales ad Tuberales)，Phytochemistry，33(1993)41-45]。真菌中存在的壳二孢吡喃酮P立刻使人提出壳二孢吡喃酮P可作为抗生素使用的假说。然而，在所公开的试验中壳二孢吡喃酮P作为抗生素使用并不令人满意。
壳二孢吡喃酮P和壳二孢吡喃酮T可以采用从以下真菌制备的无细胞提取物从1，5-脱水-D-果糖酶法生产盘菌目(Pezizales)例如Plicaria leiocarpa和Anthracobia melaloma以及块菌目(Tuberales)例如黑孢块菌(Tuber melanosporum)。壳二孢吡喃酮T1是壳二孢吡喃酮T的二水合物形式，而壳二孢吡喃酮T2和壳二孢吡喃酮T3是壳二孢吡喃酮T的互变异构体一水合物形式。
壳二孢吡喃酮M可以通过从以下真菌分离的EDTA敏感的脱水酶从1，5-脱水-D-果糖来生产羊肚菌例如Morchella vulgaris、鹿花菌属(Gyromitres)、盘菌(pezizes)例如Peziza echinospora。
壳二孢吡喃酮M、P和T也可以在温和条件下通过用碱处理1，5-脱水-D-果糖来化学生产[对某些戊糖和1，5-脱水-D-果糖降解、淀粉降解酶a-1，4-葡聚糖裂合酶产物的研究(Studies on the degradation of somepentoses and of 1，5-anhydro-D-fructose，the product of the starch-degrading enzyme a-1，4-glucan lyase)；Ahmad，T.的论文，The SwedishUniversity of Agricultural Sciences，Sweden，1995]。
当通过化学方法制备本发明的化合物时，可以按照任一下述方法制备所述化合物(1)壳二孢吡喃酮P可以在温度升高的情况下例如在70℃下通过用非水酸处理1，5-脱水-D-果糖来生产。
(2)壳二孢吡喃酮(例如壳二孢吡喃酮P、T和M)可以通过依照Ahmad，T.，1995的碱处理法从1，5-脱水-D-果糖来生产。
所生产的所有壳二孢吡喃酮的结构都通过NMR技术加以证实。
本发明的化合物最好通过如M.-A.Baute等，[Phytochemistry，33(1993)41-45)中公开的酶法来制备。例如可以采用如M.-A.Baute等公开的酶法从1，5-脱水-D-果糖生产壳二孢吡喃酮(例如壳二孢吡喃酮P、T和M)。
在一个特别优选的实施方案中，所述化合物选自以下化合物或其酯化衍生物 在一个优选的实施方案中，具有式I的环状化合物具有针对革兰氏阳性细菌和酵母的抗微生物效应。
优选具有式I的环状化合物具有针对选自以下的微生物的抗微生物效应李斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母属(Saccharomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、索丝菌属(Brochothrix)、微球菌属(Micrococcus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、肠杆菌属(Eterobacter)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)。
甚至更优选具有式I的环状化合物具有针对选自以下的微生物的抗微生物效应单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、鼠伤寒沙门氏菌、沙门氏菌(Salmonella sp.)、蜡状芽孢杆菌、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酿酒酵母奇异变种(Saccharomyces cerevisiae var.paradoxus)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)。
甚至更优选具有式I的环状化合物具有针对选自以下的微生物的抗微生物效应单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、酿酒酵母、卡尔酵母、荧光假单胞菌、生孢梭菌、清酒乳杆菌、热杀索丝菌和藤黄微球菌。
在一个高度优选的方面，式I化合物的衍生物为下式化合物 该化合物(3，6-二-O-乙酰基-1，5-脱水-4-脱氧D-甘油-己-3-烯醇吡喃糖-2-酮糖)可以按照Andersen等(1998)(1，5-脱水-D-果糖的结构晶态乙酰化二聚体形式的X射线分析，J.Carbohydr.Chem.171027-1035)所述方法来制备。
本发明该方面特别优选的是其中式I化合物的衍生物为酯，因为所述化合物可以为亲脂性的和/或可以既具有疏水特性又具有亲水特性。当所述化合物既具有疏水特性又具有亲水特性时，所述化合物容易地存在于乳剂的水/油界面。
所述化合物存在于乳剂的水/油界面可以使其作为乳化剂起作用。因此，本发明可以进一步提供具有双功能效应的化合物。所述化合物既可以用作抗微生物剂又可以用作乳化剂。
许多本发明的化合物可以衍生自1，5-脱水果糖。1，5-脱水果糖是存在于细菌、红藻、真菌和哺乳动物中的单酮糖。在红藻和真菌中，通过α-1，4-葡聚糖裂合酶[EC 4.2.2.13]的作用分别从红藻淀粉和糖原产生1，5-脱水果糖。
当从1，5-脱水-D-果糖制备本发明化合物时，1，5-脱水-D-果糖最好是依照GB-A-2296717来制备。换句话说，1，5-脱水-D-果糖最好通过包括用所述酶α-1，4-葡聚糖裂合酶处理α-1，4-葡聚糖的方法来制备，其特征为使用基本纯形式的所述酶。
本发明的环状化合物最好包含五元环或六元环。
本发明的化合物包含至少一个酯基。因此，本文所用的术语“酯”包括单酯、二酯、三酯和多酯。
在一个优选的方面，式I化合物是二酯，其中R1取代基是-OH基团，其中由R4取代基的-OH基团和R3取代基的-OH基团形成所述酯键。
如上所述，在本发明一个特别优选的实施方案中，所述化合物是如下所示的6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖。 6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖的制备可以依照WO 00/56745中详述的方法通过化学方法或通过酶法来完成。
所述化学方法可以包括以下反应，以合成脱水果糖的C12酯 所述反应用月桂酰氯和吡啶来进行。酰化位点通过NH2OR衍生化后产物的分离和NMR来确定。已发现所述产物为50％ 6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖11％ 3-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖可以使用类似的方法来制备脱水果糖的其它酯衍生物。
制备6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖的酶学方法可以包括脂酶和蛋白酶的应用。在水溶液中，脂酶和蛋白酶可切割酯键。脂酶是糖特异性的，而蛋白酶是脂肪酸特异性的。然而，Synthesis 1990，112-115公开了脂酶和蛋白酶在非水溶液中可提供活性的逆转，从而形成酯键。因此可以用非水溶液中的脂酶和蛋白酶制备按照本发明的化合物。
按照J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，1995，2203-2222，对脂酶进行筛选以鉴定用于制备按照本发明化合物的合适脂酶。用吡啶筛选鉴定了Candida antarctica、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞菌和猪胰腺。用叔丁醇∶吡啶为2∶1筛选鉴定了Candida antarctica、Candida cylindrace、洋葱假单胞菌、荧光假单胞菌、猪胰腺。
因此，按照本发明的化合物最好用从Candida antarctica、洋葱假单胞菌、荧光假单胞菌、猪胰腺和Candida cylindrace中获得的脂酶来制备。
按照本发明的化合物最好用从Candida antarctica中获得的脂酶来制备。Candida antarctica可得自Novo Nodisk A/S，丹麦，商品名为Novozym 435。
所述酶法通过用月桂酸酶促酰化1，5-脱水-D-果糖生成6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖加以证实。
所述化学方法可以包括用月桂酸、棕榈酸和硬脂酸如下将1，5-脱水-D-果糖定量转化为6-O-酰基-1，5-脱水-D-果糖
所述反应形成包含单体酮/二聚体1型/二聚体2型-1∶3∶1的组合物。所述混合物可以经硅胶色谱纯化，得到约70％收率。
本发明的环状化合物可以单独使用或与其它组分联合使用，所述其它组分例如一种或多种防腐剂、一种或多种螯合剂(例如EDTA钠盐、多磷酸盐或柠檬酸盐)和/或一种或多种抗氧化剂(例如抗坏血酸、异抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、BHA或BHT)。
作为定义，在广义上，术语“防腐剂”意指包括所有抑制微生物生长或杀死所述微生物的物质。在狭义上，一般理解的是防腐剂以浓度为0.5％或更低浓度使用。有关除着色剂和甜味剂以外的食品添加剂，在1995年2月20日的European Parliament and Council的RegulationNo.95/2/EG中列出了允许用作防腐剂的食品添加剂。
EU许可的适合与本发明化合物联用的典型食品防腐剂包括山梨酸、苯甲酸、PHB酯(对羟基苯甲酸酯)和二氧化硫。这些防腐剂的作用模式以及它们的有效范围如下所述。山梨酸(E200-203)作用模式抑制所述微生物细胞内的各种酶。
有效范围主要抗酵母和霉菌以及过氧化氢酶阳性细菌。不抑制过氧化氢酶阴性细菌以及乳酸细菌和梭菌。
有效浓度500-3000ppm。
食品中的最大许可量马铃薯面团(potato dough)、加工干酪、包装面包、精加工焙烤产品、乳化调味汁等中至多2000ppm。苯甲酸(E210-213)作用模式抑制通过细胞膜的氧交换且影响酶结构。
有效范围仅对于酸性产品，至多约pH4.5；抑制酵母和霉菌，有限抑制细菌(没有或仅非常微弱地抑制乳酸细菌和梭菌)。
食品中的最大许可量肉冻、果品、果酱等中至多500ppm。PHB酯(对羟基苯甲酸酯)(E214-219)作用模式由于表面活性而损伤细菌膜，由于蛋白质变性而对原生质有毒性作用。
有效范围主要抑制酵母和真菌，但在pH范围3.0-8.0之间也抑制革兰氏阳性细菌。
有效浓度在浓度超过约0.08％时有感官影响。二氧化硫(E220-224；E226-227)作用模式在很大程度上取决于pH，事实上二氧化硫仅在酸性pH值(＜4，0)时有效。机制非常复杂。
有效范围主要抗细菌，尤其抗革兰氏阴性需氧细菌。
有效浓度250-500ppm可抑制需氧革兰氏阴性细菌，800-2000ppm可抗革兰氏阳性细菌、酵母和霉菌。
食品中的最大许可量用于家庭葡萄酒酿造的干果、葡萄汁浓缩物中最大2000ppm，在某些情况下，最大许可量仅为20-30ppm。
对于更为特殊的应用，本发明化合物也可以与以下防腐剂联合使用联苯、二苯、邻苯基苯酚、噻苯哒唑、乳链菌肽、那他霉素、六亚甲基四胺、二碳酸二甲酯、硼酸、四硼酸钠、亚硝酸盐、丙酸和丙酸盐以及溶菌酶。这些防腐剂的作用模式以及它们的有效范围和具体应用如下所述。联苯、二苯(E230)有效范围抑制霉菌。
用于处理水果的物质表面处理柑桔类水果。
最大许可量70ppm邻苯基苯酚(E231/E232)与E230一样，限于处理水果，如表面处理柑桔类水果。噻苯哒唑(E233)表面处理柑桔类水果和香蕉。乳链菌肽(E234)作用模式扰乱膜功能。
有效范围革兰氏阳性细菌，对革兰氏阴性细菌无影响。
食品中的最大许可量(EU)粗面粉布丁和类似产品3ppm，成熟干酪和加工干酪12.5ppm(＝12.5IU/g)，凝结奶油10ppm，马斯卡朋10ppm。那他霉素(海松素)(E235)作用模式特异性地攻击细胞膜，其中一般而言与甾醇相互作用，从而增加膜的通透性。
有效范围霉菌和酵母，对细菌无效。有效剂量率低于约50mg/l。表面最大浓度为1mg/dm2，最大穿透5mm。
应用表面处理硬质干酪、半硬质干酪和半软干酪以及干腊肠。六亚甲基四胺(E239)六亚甲基四胺通过将氨加入至甲醛水溶液中而形成。杀微生物作用由于甲醛所致。
仅许可用于意大利波罗伏洛干酪(25ppm残留量)。二碳酸二甲酯(E242)仅许可用于非酒精饮料、无醇果汁酒和液体浓缩物。硼酸、四硼酸钠(E284/E285)仅许可用于鱼子酱。亚硝酸盐(E249和E250)许可以亚硝酸盐腌制用盐形式用于处理肉制品(“红色制品”)。用于腌制的不能加热处理的干燥肉制品以及用于其它腌制的肉制品，按照指南固定添加150ppm。这些浓度显示起不到防腐作用。主要由于它们的技术特性(构成颜色、味道)以及由于它们的抗氧化作用而将其加入。丙酸和丙酸盐(E280、E281、E282和E283)作用模式与山梨酸相似，最适pH＜4.5。
在细胞内积累导致抑制各种酶。
抑制范围在pH5.5、浓度为125-12500ppm时抑制霉菌，为了抑制细菌，必需更高的浓度(＞16000ppm)。
应用切片包装面包。
最大许可量3000ppm。溶菌酶(E1105)仅许可用于成熟干酪。
最大许可量适量。
申请人通过对本发明化合物抑制效应进行研究，在近中性pH(pH6.8)的培养基(Elliker肉汤)中进行了测试，已显示可有效抵抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。上述多种防腐剂显示抑制效应主要在低pH，显然应用本发明化合物扩大了潜在的应用范围。
原则上，化学防腐物质的应用取决于下列因素(a)毒理学上无害·所述物质当短期、中期和长期应用时的效应。
·测试急性毒性(LD50)、动力学和代谢、药理学作用、生殖毒性等。
(b)技术/食品化学方面·水溶解性因为微生物在水相中生长，所以防腐剂必须为水溶性的·与食品成分的反应，异味问题(感官接受性)·干扰食品成分(例如硫酸破坏维生素B1)因此，一系列不同因素决定化学物质在食品和饲料中的抗微生物效应。其中，微生物组成、食品组成(成分、pH、水活度、含盐量等)、包装、时间-温度-条件等都是影响抗微生物剂的抑制活性的关键因素。
现在仅通过实施例并参考附图来描述本发明，附图中
图1显示一幅用以下试剂处理的藤黄微球菌(上面1个平板)、蜡状芽孢杆菌(中间2个平板)和生孢梭菌(下面2个平板)的孔扩散试验照片上面右边部分3％ C8脱水果糖酯；中间右边部分0.3％ C8脱水果糖酯；下面右边部分3％ C12脱水果糖酯；下面左边部分0.3％ C12脱水果糖酯；中间左边部分25％甲醇的等量甲醇对照；上面左边部分2.5％甲醇的等量甲醇对照。
图2显示一幅用以下试剂处理的藤黄微球菌的孔扩散试验照片部分13％ C8脱水果糖酯；部分20.3％ C8脱水果糖酯；部分33％ C12脱水果糖酯；部分40.3％ C12脱水果糖酯；部分525％甲醇的等量甲醇对照；部分62.5％甲醇的等量甲醇对照。
对于肉汤培养物和Bioscreen试验，让大多数细菌在脑心浸液(BHI，Oxoid，pH7.4)中生长。让清酒乳杆菌A10在de Man，Rogosa，Sharpe培养基(MRS，Oxoid)中生长。让酵母在沙氏液体培养液(SabouraudLiquid medium)(SLM，Oxoid)中生长。大多数细菌于30℃培养。让乳酸细菌在富含CO2的环境下在固体培养基上生长。让梭菌在强化梭菌培养基(RCM)中在无氧条件下于37℃生长。让热杀索丝菌和酵母于25℃生长。Rioscreen试验采用自动化微生物读数仪Bioscreen C测量在有和无试验样品的情况下所述菌株的生长曲线。Bioscreen C可通过纵向光度测定法同时测量200孔蜂窝状微量滴定板中的动力学浊度(即生长)。所述系统由Bioscreen C分析仪(它有一个培养箱和测量装置)、集成PC、软件(BioLink v 5.30)、打印机和‘Honeycomb 2’比色杯式多孔板组成。可以用BioLink软件分析生长曲线数据或将所述数据输出到诸如Excel的程序中。方案向14mg样品中加入50μl 100％甲醇。然后加入66.7μl IMS(工业含甲醇酒精，96％乙醇)，以制备12％(w/v)溶液。
对于所述试验，然后该溶液用无菌蒸馏水以1∶4进行稀释。这一步是必需的，因为样品中的乙醇浓度会抑制所述试验微生物。这制成3％(w/v)的终溶液。
所述试验样品不能进行过滤除菌，因为损失会太大，仅可得到约470μl。对样品进行无菌操作，希望该样品是无菌的。由于相同原因未测量样品的pH。
然后在Bioscreen中在0.3％浓度下测试所述样品。然而，立刻会认识到，这可能有问题，因为AF酯1试验样品是浑浊的乳白色。遗撼的是，当将其加入到Bioscreen各孔中时，原始浊度太高，以致无法分辩任何微生物的生长。因此，为了确证是否发生任何抑制，必需对接种物进行活菌计数，然后在Bioscreen中于30℃培养24小时后，直接取样测试Bioscreen板中的样品。然后可通过将其与含有2.5％乙醇的对照孔最终活细胞数进行比较来评价抑制。Bioscreen BS021100结果AF酯1＝脱水果糖的C8酯(权利要求32中所示结构-LHS)。表1
结论表1中的结果显示AF-酯1抑制所有被测微生物。抑制活性的顺序如下革兰氏阳性细菌＞酵母＞革兰氏阴性细菌。该样品对单核细胞增生李斯特氏菌特别有效，但对芽孢杆菌也非常有效。有针对单核细胞增生李斯特氏菌杀菌活性的证据，并且可能对所述酵母有杀菌活性。脱水果糖酯1杀菌试验在Bioscreen中用活菌计数证实较早测试的样品进行初步杀菌实验。这显示良好活性。对于所述杀菌实验，所选试验生物为单核细胞增生李斯特氏菌S23，因为该菌在生长抑制试验中显示最高敏感性。方案等份3×890ml 10mM HEPES缓冲液，pH7。向一个试验对照中加入100ml水，向另一个试验对照中加入100ml等量乙醇对照，向试验样品中加入100ml AF酯1。向所有试验中加入10ml过夜培养物。将样品在环境保护温度下静置2小时。进行活菌计数。请注意AF酯1会在试验期间沉淀出来。结果试验活菌计数(cfu/ml)对照/水 3.1×108对照/乙醇 2.0×107试验/AF酯12.4×107根据该结果得出的结论是，AF酯1不具有任何杀菌活性。新样品的测试脱水果糖酯C8(AFC8)＝脱水果糖的C8酯(权利要求32中所示结构-LHS)脱水果糖酯C12(AFC12)＝脱水果糖的C12酯(权利要求32中所示结构-RHS)葡萄糖酯C8(GC8)-对照葡萄糖酯C12(GC12)-对照将AF酯通过于70℃加热10-15分钟或者于100℃加热5-10分钟而溶于水中。两种方法均未取得成功，加热后所述酯最终制成0.5％(w/v)的50∶50甲醇/水溶液。AFC8未溶解，但其它样品较好溶解。结果未观察等量甲醇对照区。表2
BS191200 Bioscreen试验结果表3
*AF C12显示Bc204和Bc Campden在最低试验浓度0.0125％时的完全抑制。
该轮对照基于在等量甲醇浓度于30℃生长18小时或24小时的终OD。根据细菌数目是否比甲醇对照细菌数目低来判断所述AF酯的抑制作用。结论·孔扩散结果显示0.5％ AFC8和AFC12两者均有抗梭菌活性，并且AFC12还有抗芽孢杆菌属、索丝菌属、微球菌属的活性，也许还有抗酵母活性，但无抗单核细胞增生李斯特氏菌或革兰氏阴性(GN)细菌的活性。
·Bioscreen结果得自0.05％样品的试验。
·Bioscreen证实的活性顺序如下AFC12＞AFC8。Bioscreen也证实抗芽孢杆菌属的活性，但也观察到抗单核细胞增生李斯特氏菌和清酒乳杆菌的活性以及一定抗革兰氏阴性(GN)细菌的活性。Bioscreen分析的描述BS040101将0.3％ AF酯溶于2.5％甲醇中。制备连续稀释液。测试以下浓度0.3％、0.15％、0.075％、0.038％和0％。将APP溶于水中。该样品在30℃24小时后进行分析(表4)。表4
BS040101的活菌计数通过在任一种AF酯存在下的终计数是否比在2.5％甲醇(对照)的终计数低来判断抑制。结果示于表5中。表5
孔扩散试验藤黄微球菌、蜡状芽孢杆菌204、蜡状芽孢杆菌Campden、生孢梭菌1.221和生孢梭菌Campden的结果示于
图1和图2和表6中。甲醇对照试验没有得到任何扩散区。各孔编号1＝3％ AFEC8，2＝0.3％AFEC8，3＝3％ AFEC12，4＝0.3％ AFEC12，5＝25％甲醇的等量甲醇对照，6＝2.5％甲醇的等量甲醇对照，表6
代码(CODE)(酵母)E＝生长增加；+＝观察到抑制区。APP的进一步试验3％时的孔扩散区(相对于生孢梭菌Campden(4.72)和热杀索丝菌7883(2.96))BS040101的活菌计数表7
本发明的所述方法和系统在不偏离本发明的范围和精神的情况下的各种修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此对实施本发明的所述方式进行相关领域技术人员显而易见的修改属于下列权利要求书范围。
权利要求
1.一种抗微生物组合物，所述组合物包含式I环状化合物， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基，或者其中R4和R5为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。
2.一种防止和/或抑制某种物质中微生物生长和/或杀死所述微生物的方法，所述方法包括将所述物质与式I环状化合物接触的步骤， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基，或者其中R4和R5为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。
3.式I化合物在防止和/或抑制某种物质中微生物生长和/或杀死所述微生物方面的应用， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基，或者其中R4和R5为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。
4.任一前述权利要求的本发明，其中所述物质是食品或饲料。
5.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物是式II化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5同前述权利要求定义。
6.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物是式III化合物 其中R1、R2、R3、R4和R5同前述权利要求定义。
7.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物为式IV化合物， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基；其中R3选自-OH、＝O、包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基，或者其中R4和R5为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中R6和R7各自独立选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基，或者其中R4和R5为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述化合物包含至少一个酯基。
8.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物为式V化合物， 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7同权利要求7定义。
9.任一前述权利要求的本发明，其中R1选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基。
10.任一前述权利要求的本发明，其中R2选自-OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为烃基。
11.任一前述权利要求的本发明，其中R3选自包含-OH基团的取代基和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基。
12.任一前述权利要求的本发明，其中R3为-OC(O)R’，其中R’为H或烃基。
13.任一前述权利要求的本发明，其中R3为-OC(O)R’，其中R’为烃基。
13.任一前述权利要求的本发明，其中R3为-OC(O)R’，其中R’为R”基团。
14.任一前述权利要求的本发明，其中R’和/或R”为支链或直链、取代或未取代的烷基。
15.任一前述权利要求的本发明，其中R’和/或R”为(CH2)pCH3，其中p为1-24。
16.任一前述权利要求的本发明，其中R’和/或R”为C8烷基。
17.任一前述权利要求的本发明，其中R’和/或R”为C12烷基。
18.任一前述权利要求的本发明，R3为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)pCH3，其中n和p各自独立为1-24。
19.任一前述权利要求的本发明，R3为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)7CH3，其中n和p各自独立为1-24。
20.任一前述权利要求的本发明，R3为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)11CH3，其中n和p各自独立为1-24。
21.任一前述权利要求的本发明，其中R4选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基。
22.任一前述权利要求的本发明，其中R4选自烃基、H、OH和＝O。
23.任一前述权利要求的本发明，其中R5选自烃基、H、OH、＝O和-OC(O)R’，其中R’为H或烃基。
24.任一前述权利要求的本发明，其中R5选自烃基、H、OH和＝O。
25.任一前述权利要求的本发明，其中R4和R5为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；
25.任一前述权利要求的本发明，其中所述化合物为酯化脱水果糖，其中脱水果糖的至少一个OH基团酯化形成-OC(O)R基团，其中R为烃基。
26.权利要求25的本发明，其中R为支链或直链、取代或未取代的烷基。
27.权利要求25的本发明，其中R为(CH2)pCH3，其中p为1-24。
28.权利要求25的本发明，其中R为C8烷基。
29.权利要求25的本发明，其中R为C12烷基。
30.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物为下式化合物
31.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物为下式化合物
32.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物选自以下化合物
33.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物选自以下化合物
34.任一前述权利要求的本发明，其中所述化合物为壳二孢吡喃酮P、壳二孢吡喃酮M、壳二孢吡喃酮T、壳二孢吡喃酮T1、壳二孢吡喃酮T2、壳二孢吡喃酮T3的衍生物和它们的混合物。
35.任一前述权利要求的本发明，其中所述化合物选自酯化壳二孢吡喃酮P、酯化壳二孢吡喃酮M、酯化壳二孢吡喃酮T、酯化壳二孢吡喃酮T1、酯化壳二孢吡喃酮T2、酯化壳二孢吡喃酮T3和它们的混合物。
36.任一前述权利要求的本发明，其中所述化合物选自以下化合物或其酯化衍生物
37.任一前述权利要求的本发明，其中所述式I环状化合物具有针对选自以下的微生物的抗微生物效应李斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母属(Saccharomyces)、假单胞菌属(pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、索丝菌属(Brochothrix)、微球菌属(Micrococcus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、肠杆菌属(Enterobacter)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和埃希氏菌属(Escherichia)。
38.任一前述权利要求的本发明，其中所述式I环状化合物具有针对选自以下的微生物的抗微生物效应单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酿酒酵母奇异变种(Saccharomycescerevisiae var.paradoxus)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas，uorescens)、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、热杀索丝菌(Brochothrixthermosphacta)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)。
39.任一前述权利要求的本发明，其中所述式I环状化合物具有针对选自以下的微生物的抗微生物效应单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌、酿酒酵母、卡尔酵母、荧光假单胞菌、生孢梭菌、清酒乳杆菌、热杀索丝菌和藤黄微球菌。
40.任一前述权利要求的本发明，其中将所述式I化合物与一种或多种抗氧化剂、防腐剂和/或螯合剂联合使用。
全文摘要
本发明提供一种包含具有式I的环状化合物的抗微生物组合物，其中R
文档编号A23K1/16GK1466423SQ0181630
公开日2004年1月7日 申请日期2001年9月27日 优先权日2000年9月27日
发明者D·埃泽尔, A·J·莫甘, L·V·托马斯, 于书坤, D 埃泽尔, 托马斯, 莫甘 申请人:丹尼斯科有限公司