专利名称：抗微生物剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗微生物剂。更准确地讲，本发明涉及一系列脱水果糖衍生物的抗微生物活性。
各种原因造成的食物腐败见于文献中，已知各种化学药品可抑制一种原因造成的各方面的降解。已知降解和新鲜割伤植物部分颜色或香味的丧失是由于氧化作用、酶、微生物和金属离子引起的。例如，已知酸化剂通过保持相对低pH环境可防止微生物降解，但其有效性仅仅是暂时性的。
其中有2000多种不同菌株的沙门氏菌属(Salmonella)，是人类食物中毒的一种主要病因。沙门氏菌属是棒状革兰氏阴性肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中的一个属，它在肠内定居且引起各种感染例如胃肠炎和伤寒。当侵入时，它们可以引起伤寒(例如，由伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)引起的伤寒或由副伤寒沙门氏菌(Salmonellaparatyphi)引起的副伤寒)。沙门氏菌属中的其它菌株与食物中毒有关(通常是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、巴拿马沙门氏菌(Salmonella panama)或肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)，后者是众所周知的家禽污染物)且偶尔在非肠组织中引起败血症。
本领域众所周知的是，沙门氏菌属不能在pH值低于4.5下繁殖。因此，弱酸性制品例如精制食品和非发酵肉制品对沙门氏菌属的攻击尤其敏感。
对于肉制品，通常用亚硝酸盐作为防腐剂。然而，亚硝酸盐的添加由于其有毒而受到限制(由于其急性毒性以及有与亚硝胺生成相关的危险性)。由于沙门氏菌属仅在亚硝酸盐浓度超过1,000ppm才被抑制，而这远远超过法规的限制。
然而，已经显示亚硝酸盐和山梨酸的组合可以增加对沙门氏菌属的有效性[亚硝酸钠和山梨酸钾可抑制沙门氏菌属，载于Frankfurters，Joumal of Food Science，47，1982，第1615ff页]。在浓度超过50ppm的亚硝酸盐联用2600ppm山梨酸时已经观察到抑制作用。
诸如细菌素(Nisin)的其它试剂不能抑制食物中的沙门氏菌，而苯甲酸由于只能在酸性制品中观察到抑制效应而不太适用。也测试了诸如得自不同香料的油提取物的植物成分(或“天然物质”)的抑制效应，但是再次证明达到对沙门氏菌属的抑制效应的所需浓度太高，而且对食物的感官影响太强。
因此，迄今为止，化学物质的应用因为以下原因而严重受限一方面，根据毒理学观点它们必须是安全的，而另一方面，它们必须不在感官上影响所述产品。
本发明力图解决与现有技术化学物质相关的问题，提供基于脱水果糖衍生物的新型抗微生物组合物。具体地说，本发明力图提供适合用于食品/饲料的抗微生物剂。
在第一个方面，本发明提供用于针对选自以下的微生物的抗微生物组合物李斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母属(Saccharomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、索丝菌属(Brochothrix)、微球菌属(Micrococcus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、肠杆菌属(Enterobacter)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)，所述组合物包含式I环状化合物或其衍生物， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和OR’，其中R’为H或-COR”，且R”为C1-10烷基；其中R3为包含OH基团的取代基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键。
在第二个方面，本发明提供一种防止和/或抑制某种物质中微生物生长和/或杀死所述微生物的方法，所述方法包括将所述物质与式I环状化合物或其衍生物接触的步骤， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和OR’，其中R’为H或-COR”，且R”为C1-10烷基；其中R3为包含-OH基团的取代基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述微生物选自李斯特氏菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、酵母属、假单胞菌属、梭菌属、乳杆菌属、索丝菌属、微球菌属、耶尔森氏菌属、肠杆菌属和接合酵母属。
在第三个方面，本发明涉及式I化合物或其衍生物在防止和/或抑制某种物质中微生物生长和/或杀死所述微生物中的应用， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和OR’，其中R’为H或-COR”，且R”为C1-10烷基；其中R3为包含-OH基团的取代基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述微生物选自李斯特氏菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、酵母属、假单胞菌属、梭菌属、乳杆菌属、索丝菌属、微球菌属、耶尔森氏菌属、肠杆菌属和接合酵母属。
所述物质最好是食品或饲料。因此，在一个优选的方面，本发明涉及适合用于食品和/或饲料中的抗微生物物质，以抑制食物中毒和其中所含有的腐败菌。
作为定义，术语“抗微生物剂”是指杀死或防止或抑制微生物生长或繁殖的物质。抗微生物剂一般依照它们有效抵抗的微生物类型来分类。例如，抗细菌物质有效抵抗细菌，抗真菌物质有效抵抗包括酵母在内的真菌，而抗病毒物质有效抵抗病毒。某些抗微生物剂可以在体内使用例如抗生素类药物，而其它抗微生物剂仅可外用例如防腐剂。
在一个优选的方面，本发明的环状化合物是式I化合物或其衍生物，其中R1和R2独立选自-OH、＝O；其中R3为包含-OH基团的取代基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键。
在一个更优选的方面，本发明的环状化合物是式II化合物或其衍生物， 其中R1、R2、R3、R4和R5如上定义。
在进一步优选的方面，本发明的环状化合物是式III化合物或其衍生物， 其中R1、R2、R3、R4和R5如上定义。
在本发明的一个优选方面，所述通式中的基团R4和R5可以独立为烃基。
本文所用的术语“烃基”是指至少包含C和H的基团并且可以任选包含一个或多个其它合适的取代基。这类取代基的实例可包括卤基-、烷氧基-、硝基-、羟基、羧基、环氧基、丙烯酸基、烃基、N-酰基或环基等等。除所述取代基可为环基外，所述取代基的组合也可以形成环基。如果烃基包含不止一个C，则那些碳不一定需要相互连接。例如，所述碳中至少2个可以通过合适的元素或基团连接。因此，烃基可以含有杂原子。合适的杂原子对本领域技术人员而言是显而易见的，包括例如硫、氮和氧。
所述通式中的基团R4和R5可以独立选自烷基、链烯基、环烷基和芳基，或者可以一起代表一个亚烷基。
在本发明一个特别优选的方面，式I化合物的衍生物为酯。术语“酯”包括单酯、二酯、三酯和多酯。
式I化合物的衍生物最好为酯，其中酯键由R3取代基的-OH基团形成。在该方面，所述衍生化R3取代基最好为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)pCH3的基团，其中n和p相互独立为1-24、最好是1-20、最好是1-10、最好是1-5或者最好是1、2或3。在再一个优选的实施方案中，所述衍生化R3取代基为式-CH2-OC(O)-(CH2)pCH3的基团，其中p为1-24、最好是1-20，或者p为1-10，或者p为1-5，且n＝1、2或3。
式I化合物的衍生物最好为酯，其中R1取代基和/或R2取代基为-OH基团，并且其中酯键由R1取代基和/或R2取代基的-OH基团形成。在该方面，所述衍生化R1取代基和/或R2取代基最好为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)pCH3的基团，其中n和p相互独立为1-24、最好是1-20、最好是1-10、最好是1-5或者最好是1、2或3。在再一个优选的实施方案中，所述衍生化R1取代基和/或R2取代基为式-CH2-OC(O)-(CH2)pCH3的基团，其中p为1-24、最好是1-20，或者p为1-10，或者p为1-5，且n＝1、2或3。
式I化合物的衍生物最好为酯，其中R1取代基和/或R2取代基为-OH基团，并且其中酯键由R1取代基和/或R2取代基的-OH基团形成。在该方面，所述衍生化R1取代基和/或R2取代基最好为式-OC(O)-(CH2)pCH3的基团，其中p为1-24、最好是1-20、最好是1-10、最好是1-5或者最好是1、2或3。
在一个优选的方面，式I化合物是二酯，其中R1取代基为-OH基团，并且其中酯键由R4取代基的-OH基团和R3取代基的-OH基团形成。
在一个高度优选的方面，式I化合物的衍生物为下式化合物 该化合物(3，6-二-O-乙酰基-1，5-脱水-4-脱氧-D-甘油-己-3-烯醇吡喃糖-2-酮糖)可以按照Andersen等(1998)(1，5-脱水-D-果糖的结构晶态乙酰化二聚体形式的X射线分析，J.Carbohydr.Chem.171027-1035)所述方法来制备。
本发明该方面特别优选的是其中式I化合物的衍生物为酯，因为所述化合物可以为亲脂性的和/或可以既具有疏水特性又具有亲水特性。当所述化合物既具有疏水特性又具有亲水特性时，所述化合物容易地存在于乳剂的水/油界面。
所述化合物存在于乳剂的水/油界面可以使其作为乳化剂起作用。因此，本发明可以进一步提供具有双功能效应的化合物。所述化合物既可以用作抗微生物剂又可以用作乳化剂。
在本发明特别优选的方面，所述环状化合物选自壳二孢吡喃酮(Ascopyrone)P、壳二孢吡喃酮M、壳二孢吡喃酮T、壳二孢吡喃酮T1、壳二孢吡喃酮T2、壳二孢吡喃酮T3及其混合物，它们的结构如下所示 壳二孢吡喃酮M 壳二孢吡喃酮P 壳二孢吡喃酮T 壳二孢吡喃酮T1壳二孢吡喃酮T2壳二孢吡喃酮T3壳二孢吡喃酮是一种已知的化合物。在1978和1981年，一个美国科学家小组为了应用壳二孢吡喃酮P作为有机合成的原材料而在Montana的Wood Chemistry laboratory通过热解胶淀粉、直链淀粉和纤维素来制备壳二孢吡喃酮P[Shafizadeh，F.，Fumeaux R.H.，Stevenson，T.T.和Cochran，T.G.，1，5-脱水-4-脱氧-D-甘油-己-1-烯-3-酮糖和纤维素的其它热解产物，Carbohydr.Res.67(1978)433-447；Stevenson，T.T.，Stenkmap，R.E.，Jensen，L.H.，Cochran，T.T.，Shafizadeh，F.和Fumeaux R.H.，1，5-脱水-4-脱氧-D-甘油-己-1-烯-3-酮糖的晶体结构，Carbohydr.Res.90(1981)319-325]。他们通过例如1H和13C NMR以及IR光谱学技术表征了壳二孢吡喃酮P。提供了壳二孢吡喃酮P的三维结构。通过热解获得的壳二孢吡喃酮P的收率低于3％且必须使用复杂的分离方法。
关于壳二孢吡喃酮P天然存在于得自Alps的非常少研究的真菌的某些种型中已有陈述[M.-A.Baute，G.Deffieux，J.Vercauteren，R.Baute和Badoc A.，盘菌目和块菌目酶活性降解1，4-α-葡聚糖为壳二孢吡喃酮P和壳二孢吡喃酮T(Enzymatic activity degrading 1，4-α-glucans toAscopyrones P and T in Pezizales ad Tuberales)，Phytochemistry，33(1993)41-45]。真菌中存在壳二孢吡喃酮P立刻使人提出壳二孢吡喃酮P可作为抗生素使用的假说。然而，在所公开的试验中壳二孢吡喃酮P作为抗生素使用并不令人满意。
许多本发明的化合物可以衍生自1，5-脱水果糖。1，5-脱水果糖是存在于细菌、红藻、真菌和哺乳动物中的单酮糖。在红藻和真菌中，通过α-1，4-葡聚糖裂合酶的作用[EC 4.2.2.13]分别从红藻淀粉和糖原产生1，5-脱水果糖。
当从1，5-脱水-D-果糖制备本发明化合物时，1，5-脱水-D-果糖最好是依照GB-A-2296717来制备。换句话说，1，5-脱水-D-果糖最好通过包括用所述酶α-1，4-葡聚糖裂合酶处理α-1，4-葡聚糖的方法来制备，其特征为使用基本纯形式的所述酶。
壳二孢吡喃酮P和壳二孢吡喃酮T可以采用从以下真菌制备的无细胞提取物从1，5-脱水-D-果糖酶法生产盘菌目(Pezizales)例如Plicaria leiocarpa和Anthracobia melaloma以及块菌目(Tuberales)例如黑孢块菌(Tuber melanosporum)。壳二孢吡喃酮T1是壳二孢吡喃酮T的二水合物形式，而壳二孢吡喃酮T2和壳二孢吡喃酮T3是壳二孢吡喃酮T的互变异构体一水合物形式。
壳二孢吡喃酮M可以通过从以下真菌分离的EDTA敏感的脱水酶从1，5-脱水-D-果糖来生产羊肚菌例如Morchella vulgaris、鹿花菌属(Gyromitres)、盘菌(pezizes)例如Peziza echinospora。
壳二孢吡喃酮M、P和T也可以在温和条件下通过用碱处理1，5-脱水-D-果糖来化学生产[对某些戊糖和1，5-脱水-D-果糖降解、淀粉降解酶a-1，4-葡聚糖裂合酶产物的研究(Studies on the degradation of somepentoses and of 1，5-anhydro-D-fructose，the product of the starch-degrading enzyme a-1，4-glucan lyase)；Ahmad，T.的论文，The SWedishUniversity of Agricultural Sciences，Sweden，1995]。
当通过化学方法制备本发明的化合物时，可以按照任一下述方法制备所述化合物(1)壳二孢吡喃酮P可以在温度升高的情况下例如在70℃下通过用非水酸处理1，5-脱水-D-果糖来生产。
(2)壳二孢吡喃酮(例如壳二孢吡喃酮P、T和M)可以通过依照Ahmad，T.，1995的碱处理法从1，5-脱水-D-果糖来生产。
所生产的所有壳二孢吡喃酮的结构都通过NMR技术加以证实。
本发明的化合物最好通过依照M.-A.Baute等，[Phytochemistry，33(1993)41-45)中公开的酶法来制备。例如可以采用M.-A.Baute等公开的酶法从1，5-脱水-D-果糖生产壳二孢吡喃酮(例如壳二孢吡喃酮P、T和M)。
在另一个优选的方面，本发明的环状化合物为式IV化合物或其衍生物， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和OR’，其中R’为H或-COR”，且R”为C1-10烷基；其中R3为包含-OH基团的取代基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中R6和R7各自独立选自H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键。
在一个更优选的方面，本发明的环状化合物为式V化合物或其衍生物， 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7如上定义。
甚至更优选本发明的环状化合物选自一种或多种下述化合物 在本发明一个特别优选的方面，R3为CH2OH基团或者包含CH2OH基团。
本发明的环状化合物最好包含五元环或六元环。
在本发明一个特别优选的实施方案中，式I环状化合物具有针对选自以下的微生物的抗微生物效应单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、酿酒酵母奇异变种(Saccharomyces cerevisiae var.paradoxus)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)。
本发明的环状化合物可以单独使用或与其它组分联合使用，所述其它组分例如一种或多种螯合剂(例如EDTA钠盐、多磷酸盐或柠檬酸盐)和/或一种或多种抗氧化剂(例如抗坏血酸、异抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、BHA或BHT)。
试验指出，APP在水中于24℃可稳定2周，但在2个月后完全消失。已经报道，APP在pH1.5-5.5时是稳定的，而在逐渐增加的pH下稳定性降低。在pH11-12.5时，APP的半寿期为5小时。由于大多数食品为酸性或中性的，因此通过使用APP以及诸如上文所列的抗氧化剂可以提高稳定性。
在一个优选的实施方案中，所述化合物与一种或多种防腐剂联合使用。作为定义，在广义上，术语“防腐剂”意指包括所有抑制微生物生长或杀死所述微生物的物质。在狭义上，一般理解的是防腐剂以浓度为0.5％或更低浓度使用。有关除着色剂和甜味剂以外的食品添加剂，在1995年2月20日的European Parliament and Council的RegulationNo.95/2/EG中列出了允许用作防腐剂的食品添加剂。
EU许可的适合与本发明化合物联用的典型食品防腐剂包括山梨酸、苯甲酸、PHB酯(对羟基苯甲酸酯)和二氧化硫。这些防腐剂的作用模式以及它们的有效范围如下所述。山梨酸(E200-203)作用模式抑制所述微生物细胞内的各种酶。
有效范围主要抗酵母和霉菌以及过氧化氢酶阳性细菌。不抑制过氧化氢酶阴性细菌以及乳酸细菌和梭菌。
有效浓度500-3000ppm。
食品中的最大许可量马铃薯面团(potato dough)、加工干酪、包装面包、精加工焙烤产品、乳化调味汁等中至多2000ppm。苯甲酸(E210-213)作用模式抑制通过细胞膜的氧交换且影响酶结构。
有效范围仅对于酸性产品，至多约pH4.5；抑制酵母和霉菌，有限抑制细菌(没有或仅非常微弱地抑制乳酸细菌和梭菌)。
食品中的最大许可量肉冻、果品、果酱等中至多500ppm。PHB酯(对羟基苯甲酸酯)(E214-219)作用模式由于表面活性而损伤细菌膜，由于蛋白质变性而对原生质有毒性作用。
有效范围主要抑制酵母和真菌，但在pH范围3.0-8.0之间也抑制革兰氏阳性细菌。
有效浓度在浓度超过约0.08％时有感官影响。二氧化硫(E220-224；E226-227)作用模式在很大程度上取决于pH，事实上二氧化硫仅在酸性pH值(＜4，0)时有效。机制非常复杂。
有效范围主要抗细菌，尤其抗革兰氏阴性需氧细菌。
有效浓度250-500ppm可抑制需氧革兰氏阴性细菌，800-2000ppm可抗革兰氏阳性细菌、酵母和霉菌。
食品中的最大许可量用于家庭葡萄酒酿造的干果、葡萄汁浓缩物中最大2000ppm，在某些情况下，最大许可量仅为20-30ppm。
对于更为特殊的应用，本发明化合物也可以与以下防腐剂联合使用联苯、二苯、邻苯基苯酚、噻苯哒唑、乳链菌肽、那他霉素、六亚甲基四胺、二碳酸二甲酯、硼酸、四硼酸钠、亚硝酸盐、丙酸和丙酸盐以及溶菌酶。这些防腐剂的作用模式以及它们的有效范围和具体应用如下所述。联苯、二苯(E230)有效范围抑制霉菌。
用于处理水果的物质表面处理柑桔类水果。
最大许可量70ppm邻苯基苯酚(E231/E232)与E230一样，限于处理水果，如表面处理柑桔类水果。噻苯哒唑(E233)表面处理柑桔类水果和香蕉。乳链菌肽(E234)作用模式扰乱膜功能。
有效范围革兰氏阳性细菌，对革兰氏阴性细菌无影响。
食品中的最大许可量(EU)粗面粉布丁和类似产品3ppm，成熟干酪和加工干酪12.5ppm(＝12.5IU/g)，凝结奶油10ppm，马斯卡朋10ppm。那他霉素(海松素)(E235)作用模式特异性地攻击细胞膜，其中一般而言与甾醇相互作用，从而增加膜的通透性。
有效范围霉菌和酵母，对细菌无效。有效剂量率低于约50mg/l。表面最大浓度为1mg/dm2，最大穿透5mm。
应用表面处理硬质干酪、半硬质干酪和半软干酪以及干腊肠。六亚甲基四胺(E239)六亚甲基四胺通过将氨加入至甲醛水溶液中而形成。杀微生物作用由于甲醛所致。
仅许可用于意大利波罗伏洛干酪(25ppm残留量)。二碳酸二甲酯(E242)仅许可用于非酒精饮料、无醇果汁酒和液体浓缩物。硼酸、四硼酸钠(E284/E285)仅许可用于鱼子酱。亚硝酸盐(E249和E250)许可以亚硝酸腌制用盐形式用于处理肉制品(“红色制品”)。用于腌制的不能加热处理的干燥肉制品以及用于其它腌制的肉制品，按照指南固定添加150ppm。这些浓度显示起不到防腐作用。主要由于它们的技术特性(构成颜色、味道)以及由于它们的抗氧化作用而将其加入。丙酸和丙酸盐(E280、E281、E282和E283)作用模式与山梨酸相似，最适pH＜4.5。
在细胞内积累导致抑制各种酶。
抑制范围在pH5.5、浓度125-12500ppm时抑制霉菌，为了抑制细菌，必需更高的浓度(＞16000ppm)。
应用切片包装面包。
最大许可量3000ppm。溶菌酶(E1105)仅许可用于成熟干酪。
最大许可量适量。
申请人通过对本发明化合物抑制效应进行研究，在近中性pH(pH6.8)的培养基(Elliker肉汤)中进行了测试，已显示可有效抵抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。上述多种防腐剂显示，抑制效应主要在低pH，显然应用本发明化合物扩大了潜在的应用范围。
原则上，化学防腐物质的应用取决于下列因素(a)毒理学上无害●所述物质当短期、中期和长期应用时的效应。
●测试急性毒性(LD50)、动力学和代谢、药理学作用、生殖毒性等。
(b)技术/食品化学方面●水溶解性因为微生物在水相中生长，所以防腐剂必须为水溶性的●与食品成分的反应，异味问题(感官接受性)●干扰食品成分(例如硫酸破坏维生素B1)因此，一系列不同因素决定化学物质在食品和饲料中的抗微生物效应。其中，微生物群体组成、食品组成(成分、pH、水活度、含盐量等)、包装、时间-温度-条件等都是影响抗微生物剂的抑制活性的关键因素。
现在仅通过实施例并参考附图来描述本发明，附图中
图1显示壳二孢吡喃酮P(APP)对鼠伤寒沙门氏菌DSMZ 554(10e3cfu/ml)的抗微生物活性。
图2显示壳二孢吡喃酮P(APP)对鼠伤寒沙门氏菌DSMZ 554(10e5cfu/ml)的抗微生物活性。
图3显示在30℃24小时内APP对鼠伤寒沙门氏菌S29的影响。
图4显示在72小时内APP对热杀索丝菌(Br.thermosphacta)CRA7883生长的影响。
图5显示在30℃24小时内APP对单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)272生长的影响。
图6显示在30℃24小时内APP对蜡状芽孢杆菌(B.cereus)204生长的影响。
图7显示在30℃24小时内APP对荧光假单胞菌(Ps.fluorescens)3756生长的影响。
图8显示在60天内APP对8℃鸡汤中的单核细胞增生李斯特氏菌272的影响(检出限102cfu/g)。
图9显示在49天内APP对8℃鸡汤中的荧光假单胞菌3756的影响(检出限102cfu/g)。
图10显示APP对8℃鸡汤中的鼠伤寒沙门氏菌S29的影响。检出限102cfu/ml。试验在第49天完成。
图11显示APP对8℃鸡汤中的蜡状芽孢杆菌204孢子的影响。检出限102cfu/ml。试验在第49天完成。
图12显示APP对8℃熟的绞碎牛肉匀浆系统中的鼠伤寒沙门氏菌S29的影响。
图13显示APP对8℃绞碎鸡肉匀浆中的鼠伤寒沙门氏菌S29的影响。
实施例1.初步研究革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的抑制利用鼠伤寒沙门氏菌和无害李斯特氏菌研究抗微生物活性。
细菌生长对于鼠伤寒沙门氏菌于37℃进行24小时，而对于无害李斯特氏菌于37℃进行20小时，这两种细菌的接种量为10e3或10e5cfu/ml(103或105菌落形成单位/ml)。
在两种情况下，APP均显示令人满意的抑制效应。鼠伤寒沙门氏菌对于10e3和10e5的鼠伤寒沙门氏菌，在2000μg/ml和4000μg/ml时观察到完全抑制(参见
图1和图2)。在500μg/ml时观察到中等抑制，而在1000μg/ml时观察到强抑制。无害李斯特氏菌(L.innocua)对于10e3的无害李斯特氏菌，在2000μg/ml时观察到几乎完全抑制，在1000μg/ml时观察到中等抑制，在500μg/mL时观察到轻微抑制。在10e5时，在2000μg/ml时观察到中等抑制，在1000μg/ml时观察到轻微抑制，而在500μg/mL时几乎不抑制。
上述试验全部在所述细菌的最适生长条件下、以高接种水平进行。在食品中，这些细菌的生长条件不太理想，接种水平也较低，因此，仅需要较低剂量抑制其生长。换句话说，食品中仅需要较低浓度的本发明化合物，就足以抑制食物中毒或食物腐败微生物。
上述结果清楚地表明，APP既抑制肠杆菌科类型中的革兰氏阴性细菌(鼠伤寒沙门氏菌)又抑制革兰氏阳性细菌(无害李斯特氏菌)。
进行进一步的试验，研究壳二孢吡喃酮P(APP)在实验室培养基中、在食物系统范围内的抗微生物功效。2.材料和方法2.1试验菌株所有微生物取自-80℃的贮藏物。大多数生物用得自过夜肉汤培养物的营养细胞悬液进行测试。芽孢杆菌和梭菌用较早制备且贮藏于4℃的内生孢子悬液进行测试。
对于肉汤培养物和Bioscreen试验，让大多数细菌在脑心浸液(BHI，Oxoid，pH7.4)中生长。让清酒乳杆菌A10在de Man，Rogosa，Sharpe培养基(MRS，Oxoid)中生长。让酵母在沙氏液体培养液(SabouraudLiquid medium)(SLM，Oxoid)中生长。大多数细菌于30℃培养。让乳酸细菌在富含CO2的环境下在固体培养基上生长。让梭菌在强化梭菌培养基(RCM)中在无氧条件下于37℃生长。让热杀索丝菌、真菌和酵母于25℃生长。将真菌在麦芽汁琼脂(MEA，Oxoid)上培养。2.2壳二孢吡喃酮P(APP)样品样品E002012是可溶于无菌去离子水的干粉。所述样品无需过滤进行测试并且可用于微孔扩散试验、初步Bioscreen试验(BS1211200；BS131200)和微型杀菌实验(mini cidal experimeut)。该样品浓度为49.3mg/ml。其它APP样品如下制备3.84g批号APP20010213，5×4ml，配制成浓度169mg APP/ml和5.5g批号APP20010215，4×10ml，配制成浓度138mg APP/ml。所有样品贮存于-20℃待用。母液用去离子水配制并过滤除菌。将这些样品用于BS010411和BS010420的Bioscreen试验中。将APP20010213用于以下试验鸡汤(8℃)(TCS010412；TCS010430)；生肉(TRM010521)。将APP20010215用于BS010510 Bioscreen试验、梭菌属敏感性试验和以下试验鸡汤(8℃)(TCS010521)；苹果汁(25℃)(TAJ010530)；牛奶(TMBG010605)；香肠肉馅匀浆试验(TSM010605)；其它生肉试验(TRM010620)和熟牛肉和鸡肉匀浆试验(TCM010619；TCC010704)。2.3体外生长抑制试验方法测试2.3.1孔扩散试验制备10ml接种各种试验生物的琼脂平板，该平板接种20μl孢子悬液或过夜肉汤。这得到的接种物水平约105-106cfu/ml。平板制成后，钻多个小孔，加入20μl APP样品。将平板在适宜温度下保温过夜，1-2天后(在微生物生长清晰可见后)检查抑菌区。2.3.2 Bioscreen试验采用自动化微生物读数仪Bioscreen C测量在有和无APP的情况下所述菌株的生长曲线。Bioscreen C可通过纵向光度测定法同时测量200孔蜂窝状微量滴定板中的动力学浊度(即生长)。所述系统由Bioscreen C分析仪(它有一个培养箱和测量装置)、集成PC、软件(BioLink v 5.30)、打印机和‘Honeycomb 2’比色杯式多孔板组成。可以用BioLink软件分析生长曲线数据或将所述数据输出到诸如Excel的程序中。
将肉汤培养基以270μl体积按照指定方向分配到各孔中。然后将连续稀释的经过滤除菌的APP母液适当分配到相同孔中。各孔接种30μl适当稀释的过夜肉汤培养物或孢子悬液，得到终接种物水平约103cfu/ml。将试验样品在Bioscreen C中于30℃保温24小时或者于25℃保温72小时(取决于所研究的微生物)，振摇托盘后每20分钟读取数据。保温完成后，将数据输出到Excel中，以供分析用。2.3.3.梭菌的敏感性试验制备APP215母液(0.5％、1％和2％)并过滤除菌。庖肉培养基(CMM，Oxoid)如下制备通过将1g所述培养基分配到各试管中，然后向各试管中加入8.9ml水。高压灭菌后，加入100μl APP母液，得到终浓度0、500、1000和2000ppm APP。给试验样品接种100μl梭菌属孢子，得到接种物水平约103cfu/ml。向试管中加入3ml 2％琼脂，以保持无氧状态。将试验样品于37℃保温，每天检查生长征兆(浊度、产气)。2.4.体外杀菌实验向890μl 10mM HEPES缓冲液(pH7)中加入100μl SDW(无菌去离子水)或APP样品E002012。向试验样品中加入10μl单核细胞增生李斯特氏菌S23过夜培养物，然后在环境温度下保温2小时。此后，通过活菌计数，对所述细菌计数。APP样品浓度为24.7μg/ml。2.5体内(食物)生长抑制试验2.5.1鸡汤食物试验将本地超级市场商标的奶油鸡汤作为模型食物系统使用。600g包装食品购自本地超级市场。这是一种贮藏于冷藏柜中有效保质期短的“新鲜家庭自制型”汤。挑选它是因为它为营养丰富的食物系统，含有各种各样的食物成分包括肉、乳制品和蔬菜。
标记成分如下鸡原汤(水、鸭油、鸡肉、盐、调味品、酵母膏、猪明胶、葡萄糖浆、蔬菜浓缩物、乳蛋白、糖、麦芽糖糊精、植物油、柠檬酸、乳糖、鸡油)、牛奶、鸡肉(9％)、奶油(8％)、洋葱、马铃薯、植物油、改性玉米淀粉、小麦粉、柠檬汁、盐、白胡椒，pH5.912。蛋白质3.3％；碳水化合物4.7％；脂肪7.2％；纤维0.2％；钠0.1％。
对于所述试验，将所述汤以2∶1与水混合(便于取样和混合)，然后通过高压灭菌于121℃15分钟进行灭菌。对于每个实验，记录汤的pH；其pH为5.79-5.88。
对于TCS010412/8(8℃保温)，用APP批号APP20010213(浓度169mg APP/ml)制备含有0、2000或4000ppm APP的试验样品。向94g汤中加入5g过滤除菌的APP母液，混合，然后加入1ml经稀释的接种物悬液(适当时为细胞或孢子)，得到试验接种物水平103cfu/g。剧烈振荡汤混合物，确保APP和微生物的均匀分布。通过活菌计数测试试验样品，然后于8℃保温，每周试验两次。
对于TCS010430/20(20℃保温)，以18.8g数量制备样品，向所述样品中加入1g适当过滤除菌的APP母液和适当稀释的0.2ml接种物。再次十分小心地进行，确保APP和微生物的均匀分布。每天通过活菌计数试验测试该试验样品。
对于TCS010521/8(8℃保温)，以27.8g数量制备样品。加入1.5gAPP母液，给试验样品接种0.3ml适当稀释的细胞或孢子悬液，得到终接种物约103cfu/g。在0ppm、500ppm和1000ppm时测试APP，使用批号APP20010213(169mg/ml)。通过活菌计数测试试验样品，然后于8℃保温，每周试验两次。2.5.2苹果汁试验[TAJ010530/25]制备8.9ml苹果汁样品(pH3.42)并进行高压灭菌。用批号APP20010215(138mg/ml)制备过滤除菌的母液，另外向所述苹果汁中加入1ml，以达到0、1000、2000ppm APP。给试验样品接种100μl适当稀释的酵母培养物过夜SLM肉汤或较早制备的丝衣霉属(Byssochlamys)孢子的子囊孢子悬液。试验样品于25℃保温，每天检查其生长征兆(例如浊度、菌丝体生长)。2.5.3牛奶试验[TMGB010605]制备8.9ml含0.5％葡萄糖和指示剂溴甲酚紫(0.01％)的UHT牛奶样品并且通过高压灭菌进行灭菌。加入APP前的pH为pH6.65。制备APP批号APP20010215(138mg/ml)的合适母液并过滤除菌。向所述牛奶中加入各1ml，制备含0、1000和2000ppm APP的试验样品。然后给试验样品接种100μl经稀释的过夜肉汤培养物或孢子悬液，得到接种物水平约103cfu/ml。这些试验样品和未接种的试验样品于20℃和8℃保温，每天检查其与未接种对照相比的可见变化。2.5.4.熟的香肠肉馅匀浆试验[TSM010605]将500g波洛尼亚(bologna)香肠肉馅配料与500g脑心浸液肉汤(BHIB)混合，以制备均一匀浆。所述波洛尼亚香肠肉馅配料包含(g/kg)瘦牛肉(320)、瘦猪肉(202)、猪油(250)、水(40)、葡萄糖(5)、淀粉(155)、混合香料(3.75)、谷氨酸钠(0.5)、赤藻酸钠(0.545)、二磷酸钠(3)、NaCl(20)、亚硝酸钠(0.15)。将200g肉匀浆样品高压灭菌。当肉仍然温热时，将其充分再混合。当肉冷却时，给其接种2ml 105cfu/ml孢子或细胞悬液，再次重新混合。将每个接种的肉样品分成3×50g样品，加入1ml SDW、2.5％或5％APP溶液(批号APP 20010215)，以制备含0、500和1000ppm APP的肉样品。将所述肉匀浆再次充分振荡，确保充分混合，进行初次活菌计数，样品于8℃保温。每周两次间隔取样。香肠肉馅匀浆的pH为6.2。2.5.5.熟的绞碎牛肉匀浆试验[TCM010619]将购自本地肉商的1kg绞碎牛肉与1升BHI混合。将每份200g所述肉匀浆进行高压灭菌。当肉冷却时，记录pH(pH6.24)，每壶接种2.0ml 105孢子或细胞，再次充分混合该肉。以3×50g分配到每个接种200g的壶。向每只壶加入1ml SDW、5％或10％APP(批号APP20010215)，再次充分混合该肉。进行初次活菌计数，该肉于8℃保温。每周取样两次。熟的绞碎牛肉匀浆的pH为6.24。2.5.6.熟的绞碎鸡肉匀浆[TCC010704]1kg绞碎鸡肉(主要是瘦肉)购自本地肉商。将其与1升BHI混合，高压灭菌前以100g样品进行混合和分配。当仍然温热时，再次充分混合该肉。煮熟时，给肉接种1ml 105孢子或细胞(得自过夜肉汤)，再次混合。然后将样品分成3×25g，向样品中加入0.5ml过滤除菌的APP20010215(作为5％或10％母液)或水。进行初次活菌计数，然后样品于8℃保温，每周试验两次。鸡肉匀浆的pH为6.24。2.5.7.生肉未接种试验[TRM0105211]300g绞碎生牛肉购自本地肉商。加入10g 2％(20,000ppm)APP2001213母液或水，充分混合该肉。进行初次计数，然后该肉于8℃保温并且连续3天取样。生肉的pH为5.3。2.5.8.生肉试验样品接种试验[TRM010620]新鲜牛排购自本地肉商，在清洁的机器上绞碎。将生肉(约pH6.2)分成8×90个样品，然后接种103cfu/ml试验生物。用细菌分离器充分混合该肉。加入10g SDW或2％APP(批号APP20010215)，再次充分混合该肉。进行初次活菌计数，然后该肉于8℃保温并且此后用非选择性琼脂(MPCA)和选择性琼脂取样沙门氏菌XLD、Oxford选择性琼脂(单核细胞增生李斯特氏菌)和STAA琼脂(热杀索丝菌)。生肉的pH为5.3。3.结果3.1.体外生长抑制结果3.1.1.孔扩散结果试验溶液浓度(未知试验时间)为49.3mg/ml(4.9％)。所有被测菌株对该水平都敏感。它们包括蜡状芽孢杆菌204、生孢梭菌Campden、单核细胞增生李斯特氏菌S23、藤黄微球菌、清酒乳杆菌A10、热杀索丝菌CRA7883、荧光假单胞菌327、卡尔酵母CRA6413、酿酒酵母ATCC9763。3.1.2.Bioscreen试验结果细菌和酵母的体外敏感性Bioscreen试验结果概述于表1-4和图3-7中。BS010510 Bioscreen试验由于电暴过夜所致的供电事故而被中断。3.1.3.梭菌对APP的敏感性在所测试的最高水平(2000ppm APP20010215)，没有观察到针对庖肉培养基中无氧条件下于37℃生长的4种生孢梭菌菌株(菌株1.221；Campden；ABC20；4.440)和1种酪丁酸梭菌(Cl.tyrobutyricum)菌株2753的生长抑制。3.2.体外杀菌试验结果在含有24.7μg/ml APP的缓冲液中、在环境温度下保温2小时后，李斯特氏菌属的计数保持稳定(表5)。3.3.体内(食物)生长抑制试验结果3.3.1.鸡汤试验结果于8℃保温的[TCS010412，TCS010521]和20℃保温的[TCS010430]的鸡汤实验结果示于表6-8和图8-11中。APP对该食物的颜色无影响。3.3.2环境温度下保温的苹果汁试验结果[TAJ010530]1000和2000ppm APP控制拜耳接合酵母CRA229生长达3-4天。2000ppm控制酿酒酵母ATCC9763生长达1天。1000或2000ppmAPP对以下微生物没有达到生长抑制近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)458、Hanseniaspora uvarum CBS5074、胶红酵母胶变种(Rhodotorulamucilaginosa var mucilaginosa)CBS8161和耐热真菌Byssochlamys fulva040021和B.nivea 163642。3.3.3 8℃和20℃保温的牛奶试验结果[TMGB010605]20℃结果如下在2000ppm时没有观察到控制单核细胞增生李斯特氏菌、热杀索丝菌和清酒乳杆菌。
在2000ppm时控制荧光假单胞菌2-3天在1000ppm时控制蜡状芽孢杆菌4天，而在2000ppm时控制蜡状芽孢杆菌达6天8℃结果如下在2000ppm时没有观察到控制单核细胞增生李斯特氏菌、清酒乳杆菌和蜡状芽孢杆菌在2000ppm时控制热杀索丝菌1天在2000ppm时控制荧光假单胞菌7天以上3.3.4.熟的香肠肉馅匀浆试验结果(8℃)[TSM010605](pH6.2)结果概述于表9中。3.3.5.熟的绞碎牛肉匀浆试验结果[TCM010619]生长曲线图示于
图12且概述于表10中。3.3.6.熟的绞碎鸡肉匀浆试验结果(8℃)[TCC010704]生长曲线示于
图13且概述于表11中。3.3.7.生肉未接种试验结果(8℃)[TRM010521](pH5.31)结果示于表12中在对照和APP样品中计数相同。没有观察到APP对该肉颜色的负面效应。3.3.8生肉接种试验结果(8℃)[TRM010620]尽管十分小心，但是肉的TAVC仍很高；试验结束时，106cfu/g上升至＞107cfu/g。没有观察到APP的显著效应。没有观察到对该肉颜色的负面效应。4.0结论上述试验结果概述于表13中。试验表明，2000ppm APP对以下微生物是有效的蜡状芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、荧光假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、清酒乳杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yenterocolitica)、热杀索丝菌、拜耳接合酵母(Z.bailii)和酿酒酵母(S.cerevisiae)。
所观察到的抑制活性可能是抑菌性的，但是在其它防腐条件的存在下(特别是低温)，可能随时间达到杀菌效应。针对某些细菌，与在实验室培养基中相比，食物系统中的APP的效力要好，可能是因为所述生物在所述食物生长不太好所致。APP的效力可以随不同食物而变，这是由于食物化学组成差异所致。例如，APP在香肠中的效力低于在鸡汤中的效力。5.0数据列表表1Bioscreen结果APP对革兰氏阳性细菌的有效水平
表2Bioscreen结果APP对热杀索丝菌的有效水平
表3Bioscreen结果APP对革兰氏阴性细菌的有效水平
表4Bioscreen结果APP对酵母的有效水平
表5APP E002012杀菌实验结果
表68℃保温鸡汤。试验0ppm、2000ppm、4000ppm APP20010213[TCS010412]
表7鸡汤(8℃)[TCSM010521]。试验0ppm、500ppm、1000ppmAPP215
表820℃保温鸡汤[TCSM010430]。试验0ppm、200ppm、500ppm、1000ppm、2000ppm APP20010213
表9熟的香肠肉馅匀浆结果总结(8℃)[TSM010605]
表10绞碎牛肉匀浆试验结果总结(8℃)[TCM010619]
表11绞碎鸡肉匀浆试验结果总结(8℃)[TCC010704]
表12加入后生肉结果(8℃)[TRM010521]
表132000ppm APP在食物系统中的活性试验结果总结
本发明的所述方法和系统在不偏离本发明的范围和精神的情况下的各种修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此对实施本发明的所述方式进行相关领域的技术人员显而易见的修改属于下列权利要求书范围。
权利要求
1.一种抗微生物组合物，所述组合物用于针对选自以下的微生物李斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母属(Saccharomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、索丝菌属(Brochothrix)、微球菌属(Micrococcus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、肠杆菌属(Enterobacter)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)，所述组合物包含式I环状化合物或其衍生物， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和OR’，其中R’为H或-COR”，且R”为C1-10烷基；其中R3为包含-OH基团的取代基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键。
2.一种防止和/或抑制某种物质中微生物生长和/或杀死所述微生物的方法，所述方法包括将所述物质与式I环状化合物或其衍生物接触的步骤， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和OR’，其中R’为H或-COR”，且R”为C1-10烷基；其中R3为包含-OH基团的取代基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述微生物选自李斯特氏菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、酵母属、假单胞菌属、梭菌属、乳杆菌属、索丝菌属、微球菌属、耶尔森氏菌属、肠杆菌属和接合酵母属。
3.式I化合物或其衍生物在防止和/或抑制某种物质中微生物生长和/或杀死所述微生物中的应用， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和OR’，其中R’为H或-COR”，且R”为C1-10烷基；其中R3为包含-OH基团的取代基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中所述微生物选自李斯特氏菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、酵母属、假单胞菌属、梭菌属、乳杆菌属、索丝菌属、微球菌属、耶尔森氏菌属、肠杆菌属和接合酵母属。
4.任一前述权利要求的本发明，其中所述物质是食品或饲料。
5.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物是式I化合物或其衍生物，其中R1和R2独立选自-OH、＝O；其中R3为包含-OH基团的取状基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键。
6.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物是式II化合物或其衍生物， 其中R1、R2、R3、R4和R5同前述权利要求定义。
7.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物是式III化合物或其衍生物， 其中R1、R2、R3、R4和R5同前述权利要求定义。
8.任一前述权利要求的本发明，其中所述化合物选自壳二孢吡喃酮P、壳二孢吡喃酮M、壳二孢吡喃酮T、壳二孢吡喃酮T1、壳二孢吡喃酮T2、壳二孢吡喃酮T3及其混合物。
9.权利要求1-3中任一项的本发明，其中所述环状化合物为式IV化合物或其衍生物， 其中R1和R2独立选自-OH、＝O和OR’，其中R’为H或-COR”，且R”为C1-10烷基；其中R3为包含-OH基团的取代基；其中R4和R5各自独立选自烃基、H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键；其中R6和R7各自独立选自H、OH或＝O，或者为与所述环状化合物环上相邻原子的化学键。
10.权利要求1-9中任一项的本发明，其中所述环状化合物为式V化合物或其衍生物， 其中R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7同权利要求9定义。
11.任一前述权利要求的本发明，其中所述式I化合物的衍生物为酯。
12.权利要求11的本发明，其中所述酯由所述环状化合物上的-OH取代基形成，并且其中所述酯为式-(CH2)n-OC(O)-(CH2)pCH3，其中n和p各自独立为1-24。
13.权利要求9-12中任一项的本发明，其中所述环状化合物选自一种或多种下述化合物
14.任一前述权利要求的本发明，其中R3为CH2OH基团或者包含CH2OH基团。
15.任一前述权利要求的本发明，其中所述环状化合物包含五元环或六元环。
16.任一前述权利要求的本发明，其中所述式I环状化合物具有针对选自以下的微生物的抗微生物效应单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酿酒酵母奇异变种(Saccharomycescerevisiae var.paradoxus)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、热杀索丝菌(Brochothrixthermosphacta)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)。
17.任一前述权利要求的本发明，其中将所述式I化合物与一种或多种抗氧化剂、防腐剂和/或螯合剂联合使用。
全文摘要
本发明提供一种用于针对选自以下的微生物的抗微生物组合物李斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母属(Saccharomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、索丝菌属(Brochothrix)、微球菌属(Micrococcus)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、肠杆菌属(Enterobacter)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)，所述组合物包含式(I)环状化合物或其衍生物，其中R
文档编号A23K1/16GK1466422SQ01816288
公开日2004年1月7日 申请日期2001年9月27日 优先权日2000年9月27日
发明者D·埃尔泽, A·J·莫甘, L·V·托马斯, 于书坤, D 埃尔泽, 托马斯, 莫甘 申请人:丹尼斯科有限公司