专利名称：含有d-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂、其改进的生产方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有D-泛酸的动物饲料添加剂、其改进的生产方法及其应用。
作为辅酶A生物合成的原料，D-泛酸在植物界和动物界分布极为广泛。然而，与通过食物可以摄取足够量泛酸的人类相反，无论是植物还是动物，都常常表现出D-泛酸缺乏症状。因此，D-泛酸的可用性具有巨大的经济效益，特别是在动物饲料业。
传统的生产D-泛酸盐方法是通过D-泛内酯(D-Pantolactone)和-β-丙氨酸钙来化学合成(Ullmann`s Encyclopedia of Industrial Chemistry，6thedition，1999，electronic release，Kapitel“Vitamins”)。为制备D-泛内酯，要求对非对映异构盐进行复杂的传统的外消旋拆分。这种由化学合成产生的商品大部分是D-泛酸的钙盐，即D-泛酸钙。
与化学合成相比，采用微生物的生物技术生产方法的优点在于，可以选择性的(对映异构纯的)制备能够被高级的生物体利用的D型泛酸。因此，不需要化学合成中所需的复杂的外消旋拆分。
采用微生物生产D-泛酸的发酵法已有大量公开，特别是EP 0 590 857、WO 96/33283、US 6,013,492、WO 97/10340、DE 198 46 499、EP 1 001027、EP 1 006 189、EP 1 006 192和EP 1 006 193。
GB 598,177介绍了作为通过产气气杆菌生产2，3-丁二醇的副产品的泛酸制备方法，其产率为千分之几。然而，泛酸的浓缩仅能通过木炭吸附、随后洗提来进行。
EP 1 006 189介绍了一种生产泛酸盐的方法，其中，D-泛酸在发酵溶液中的含量最大达到1g/l。然而，发酵溶液中如此低的泛酸含量，也就是以固体含量计算小于10％(重量)的含量是不适合商业化生产含有D-泛酸的动物饲料添加剂的。到目前为止所介绍方法中的其他缺点是，从发酵介质中分离出来的产品需要许多复杂的二次加工步骤。用于工业规模生产的经济的方法尚没有公开。
US 6,013,492介绍了二次加工来自发酵溶液中的D-泛酸的方法，包括过滤出不溶解成分(例如像培养基中的细胞物质)，在活性炭上吸附滤液，随后采用有机溶剂(优选甲醇)洗脱D-泛酸，利用氢氧化钙中和，最后使D-泛酸钙结晶。这种复杂的二次加工步骤的主要缺点是损失了所需产品。此外，以工业规模生产时，需要额外增加用于回收所使用的溶剂的设备。另一缺点是，还产生大量的废水，该废水的处理甚或清除成本很高。
DE 100 16 321 A1公开了一种生产动物饲料添加剂的方法，它是通过发酵产生D-泛酸的微生物来生产的。然而，这种方法需要在发酵后添加碱金属或碱土金属的氢氧化物或者氧化物。
因此，本发明的目的在于，提供一种含有游离D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂以及通过不再具有上述缺点的改进的方法来生产该种添加剂的方法。
这一目的通过本发明以有利的方式得以实现。
因此，本发明涉及生产含有游离D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂的方法，该方法包括a)将产生D-泛酸的生物体在含有至少一种碳源和一种氮源而无其他前体的培养基中发酵，并且b)对含有D-泛酸和/或其盐的发酵溶液在不采用其他加工步骤情况下进行干燥和/或配成制剂。
此外，本发明方法的特征还在于，发酵持续进行直至固体含量达到至少6％(重量)，优选7-25％(重量)和/或D-泛酸含量达到至少2-15％(重量)，优选4-15％(重量)。
为此，发酵可以按照本身公知的方法以分批-、分批供料-或者重复分批供料-或者以连续方式进行。本发明中，固体含量指干燥的发酵溶液，其中含有干燥的生物质、矿物质和D-泛酸和/或其盐。为确定固体含量，无菌采集发酵溶液样品并干燥，例如在真空炉中于120℃下干燥12小时。
与现有技术相比，本发明的方法的一个特别的优点是，为了提供符合所需要类型动物饲料要求的产品，得到的发酵溶液不必进行其他的复杂的处理，例如像通过活性炭吸附法。这些要求是例如相当高的D-泛酸含量和对目标生物良好的耐受性，以及本发明产品的“维生素-作用”意义上的生物学上的价值，它相当于化学合成的D-泛酸的价值。
在此，D-泛酸本身的纯度应视为是次要的，因为对于动物饲料来说，在大多数情况下是将其加入到复合饲料中。与其相反，更确切地说，本发明产品的另一优点，恰恰在于根据前述的生产方法，除了D-泛酸外，所获得的产品还含有有益于动物健康的其他发酵溶液成分，例如像相当高含量的蛋白和(可能是必要的)氨基酸、矿物质、维生素和其他在发酵期间(适当时)分泌到培养基中的成分。
本发明方法的另一优点是，省去了为生产具有优良生物学价值的产品而对发酵溶液进行复杂的加工步骤。具体而言，本发明方法的特征在于，制备所需的材料完全无需使用有机溶剂。此外，依据本发明，大大减少了排放的废水量，由此进一步省去了复杂的加工设备和处理设备。因此，本发明方法以有利的方式表明其特征，即它比传统的方法更简单、更环保、更省时、成本明显降低，因此也更为经济。
依据本发明，术语“产生”指生物可以合成比本身代谢作用所需更大量的D-泛酸和/或其盐。在一个依据本发明方法的有利的变体中，合成的D-泛酸和/或其盐不是存在于细胞内，而最好是完全从生物释放入培养基中。这种排放可以按照公知的机理主动或者被动地进行。
依据本发明，微生物可以作为产生D-泛酸的生物体使用。依据本发明，这些微生物包括真菌、酵母和/或细菌。依据本发明，优选采用真菌，例如毛霉属或者酵母例如酵母属或者Debaromyces，在这种情况下，优选酿酒酵母。依据本发明，有利地是使用棒状杆菌或者芽孢杆菌。依据本发明，优选包括例如棒状杆菌属、埃希氏菌属、芽孢杆菌属、节细菌属、Bevibacterium、假单胞菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属、变形杆菌属、不动杆菌属或者根瘤属的细菌。特别优选的示例为CorynebacteriumGlutamicum、Brevibacterium breve或者枯草孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、缓病芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、泛酸芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、B.brevis、嗜热脂肪芽孢杆菌和1组其他的杆菌类，它们的特点是16sRNA，或者为Actinum mycetalis。上述列举用于说明，对本发明绝无限定。
此外，本发明还包括使用基因修饰的生物体，用于依据本发明生产含有D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂。这些基因修饰的生物体可以例如通过化学突变，随后通过适当的“筛选法”选择进行分离。依据本发明，还包括所谓的生产菌株，它们适合于产生本发明的产品，并在D-泛酸方向的代谢通量方面具有基因修饰，也包括在D-泛酸和/或其盐通过细胞膜排放方面的修饰。
也可以考虑采用转基因的生物体，它们由同源的和/或异源的核苷酸序列的转移产生，这些序列是合成所要求的产品所必需的或者是有促进作用的。就该方面而言，可以考虑将对位于基因组和/或载体上的一个或多个基因(单独和/或结合)进行超表达和/或去调节。
这种转基因的生物体还可以合适的方式含有额外的拷贝和/或遗传修饰的基因，所述基因选自于panB、panC、panD、panE和/或其组合和/或甚至像含有panBCD-操纵子的单元的组。此外，另外的可能性是对生物体的其他代谢途径，例如异亮氨酸-缬氨酸-生物合成途径进行有利的处理，例如像EP 1 006 189、EP 1 006 192、EP 1 006 193或者EP 1 001 027中描述的。由此增加了泛酸-生物合成的支链前体物质的可利用性。最好是在适当的时候，使该生物合成途径中的基因，即ilvB、ilvN、ilvC和/或ilvD超表达。
此外，依据本发明，还包括对在生产D-泛酸所使用的生物的天冬氨酸-α-脱羧酶(panD)进行基因修饰，例如通过超表达和/或减量调节。所以，在优选的方式中，与相应的非基因修饰的生物体相比，细胞中β-丙氨酸含量升高，因此，不必再作为前体添加到培养基中，例如EP-A-0 590 857描述的。优选的微生物是那些其泛酸-(pan)-和/或异亮氨酸-缬氨酸(iev)-生物合成和/或天冬氨酸-α-脱羧酶(panD)已去调节的微生物。
此外，微生物中酮泛酸(Ketopanthoat)-还原酶(panE)的额外超表达是优选。
此外还优选的是，在适当的时候，降低对于合成辅酶A所需的coaA-基因的活性或者(例如在芽孢杆菌属-中)完全消除。这是因为芽孢杆菌属除了coaA外还含有用于这种酶催化功能的另一种基因(＝coaX)。也可以改变这种coaX基因或者其相应酶的活性，优选降低，甚至消除，只要coaA本身还有足够的(尽管是降低的)酶活性，即coaA的酶活性没有完全丧失的话。除了各种基因的超表达外，也可以合适的方式对这些基因的启动区进行遗传操作，如果这种操作可以导致基因产物的超表达。
在本发明的一个实施方案中，使用依据附件(PCT/US申请0025993)介绍的细菌菌株，例如PA 668和/或其衍生物。在一个优选的实施方案中，依据本发明，在本发明的方法中使用PCT/US申请0025993附件介绍的微生物，枯草芽孢杆菌PA 377。这种枯草芽孢杆菌菌株PA 377按如下方法生产采用具有基因型trpC2(Trp)的枯草芽孢杆菌菌株168(Marburg菌株ATCC 6051)，通过Trp+标记(从枯草杆菌野生型W23产生)的转导产生菌株PY79。在菌株PY79中，通过传统的基因操作方法(例如在Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(编者)，Molecular Biological Methods for Bacillis(1990)John Wiley&Sons，Ltd.，Chichester，England中所介绍的)导入ΔpanB和ΔpanE1突变。
产生的菌株利用枯草杆菌菌株PA221(基因型基因P26panBCD，trpC2(Trp-))的基因组DNA和枯草杆菌菌株PA303(基因型P26panE1)的基因组DNA转化。产生的菌株PA327具有基因型P26panBCD，P26panE1，是色氨酸营养缺陷型的(Trp-)。
利用枯草杆菌菌株PA327，在10ml含SVY的培养基(25g/l Difco小牛肉浸汁，5g/l Difco酵母提取物，5g/l谷氨酸钠，2.7g/l硫酸铵加740MI水，高压消毒，随后添加200mL 1M磷酸钾，pH7.0和60mL 50％无菌的葡萄糖溶液)，补充5g/L β-丙氨酸和5g/L α-酮异戊酸中培养，直至泛酸滴度达到3.0g/L(24小时)。
下面介绍枯草杆菌菌株PA221(基因型P26panBCD，trpC2(Trp-))的生产通过传统的基因操作方法，借助大肠埃希氏杆菌panBCD操纵子的序列信息(参见Merkel等，FEMS Microbiol，Lett.，143，1996247-252)，采用枯草杆菌GP275质粒文库，克隆杆菌属的操纵子panBCD。为进行克隆，使用大肠埃希氏杆菌菌株BM4062(birts)和处于birA基因附近的杆菌属操纵子的信息。将panBCD操纵子导入可在大肠埃希氏杆菌中复制的质粒内。为改善panBCD操纵子的表达，使用枯草杆菌噬菌体SP01(P26)的强组成型启动子，并将panB-基因前面的核糖体结合位(＝RBS)用人工RBS替换。在质粒上P26panBCD盒的前面连接一个紧接于枯草杆菌的天然panB基因上游的DNA片段。该粒体转化到枯草杆菌菌株RL-1(通过传统的突变形成的枯草杆菌168的衍生物(Marburg菌株ATCC6051)，基因型trpC2(Trp-))，并通过同源重组将天然panBCD操纵子用P26panBCD操纵子替换。产生的菌株称为PA221并具有基因型P26panBCD，trpC2(Trp-)。
利用枯草杆菌菌株PA221，在10ml含SVY培养基(补充5g/L β-丙氨酸和5g/Lα-酮异戊酸)的培养液中培养直至泛酸滴度达到0.92g/L(24小时)。
下面介绍枯草杆菌菌株PA303(基因型P26panE1)的生产以类似的方法，利用大肠埃希氏杆菌panE基因序列克隆芽孢杆菌panE序列。事实证明，在枯草杆菌中存在两个同源的大肠埃希氏杆菌的panE基因，被称为panE1和panE2。通过缺失分析证明，panE1基因负责90％的泛酸产生，而panE2基因的缺失对泛酸的产生没有显著影响。在这里，以类似于克隆panBCD操纵子的方法，将启动子也用强组成型启动子P26替换，并将panE1基因前面的核糖体结合位用人工结合位替换。将P26panE1片段克隆到一个设计的载体中，使P26panE1片段能够整合至枯草杆菌基因组中的原始panEl基因座。在转化和同源重组后产生的菌株称为PA303并具有基因型P26panE1。
利用枯草菌杆菌株PA303，在10ml含SVY培养基(补充5g/L β-丙氨酸和5g/L α-酮异戊酸)的培养液中培养，直至泛酸滴度达到1.66g/L(24小时)其他的菌株构建通过利用含有P26ilvBNC操纵子和壮观霉素标记基因的质粒转化PA327完成。P26ilvBNC操纵子整合至amyE基因座，这可以通过PCR证明。转化体被称为PA340(基因型P26panBCD，P26panE1，P26ilvBNC，specR，trpC2(Trp-))。
利用枯草菌杆菌株PA340，在10ml含SVY培养基(只补充5g/L β-丙氨酸)的培养液中培养，直至泛酸滴度达到3.6g/L(24小时)，在10ml含SVY培养基(补充5g/L β-丙氨酸和5g/L α-酮异戊酸)的培养液中培养，直至泛酸滴度达到4.1g/L(24小时)。
此外，在菌株PA340中导入去调节的ilvD盒。将含有具有人工RBS2的启动子P26控制下的ilvD基因的质粒转化入PA340。在此方面，将P26ilvD基因通过同源重组至原始ilvD基因座中进行整合。产生的菌株PA374具有基因型P26panBCD，P26panE1，P26ilvBNC，P26ilvD，specR和trpC2(Trp-)。
利用枯草杆菌菌株PA374，在10ml含SVY培养基(只补充5g/L β-丙氨酸)的培养液中培养，直至泛酸滴度达到2.99g/L(24小时)。
为利用菌株PA374而不提供β-丙氨酸来生产泛酸，将编码天冬氨酸α-脱羧酸的基因panD的附加拷贝导入菌株PA374中。这可以通过将菌株PA401的染色体DNA转化至PA374中完成，其转化过程将在下面描述。通过四环素选择得到菌株PA377。
产生的菌株PA377具有基因型P26panBCD，P26panE1，P26ilvBNC，P26ilvD，tetR，specR和trpC2(Trp-)。
利用枯草杆菌菌株PA377，在10ml含SVY培养基(没有提供前体)中培养，直至泛酸滴度达到1.31g/L(24小时)。
下面介绍枯草杆菌菌株PA401(基因型P26panD)的生产将枯草杆菌panD基因从panBCD操纵子中克隆到携带四环素标记基因的载体上。在panD基因前面克隆启动子P26和上述的人工RBS。通过限制酶切消化，产生含有四环素标记基因和P26panD基因的片段。将该片段重新连接并转化到上述的菌株PA221。将该片段整合到菌株PA211的基因组中。产生的菌株PA401具有基因型P26panBCD，P26panD，tetR和trpC2(Trp-)。
利用枯草杆菌菌株PA401，在10ml含SVY培养基(补充5g/Lβ-5g/Lα-酮异戊酸)的培养液中培养，直至泛酸滴度达到0.3g/L(24小时)。在10ml含SVY培养基(补充5g/L D-泛解酸和10g/L L-天冬氨酸)的培养液中培养，直至泛酸滴度达到2.2g/L(24小时)。
菌株的具体构建方法可见于附件PCT/US申请0025993中。
利用上述的菌株PA377，在葡糖限制型发酵时，在SVY-培养基(25g/lDifco小牛肉浸汁、5g/l Difco酵母提取物、5g/l色氨酸、5g/l谷氨酸钠、2g/l(NH4)2SO4、10g/l KH2PO4、20g/l K2HPO4、0.1g/l CaCl2、1g/l MgSO4、1g/l柠檬酸钠、0.01g/l FeSO4×7H2O和1ml/l下列成分的微量盐溶液0.15g Na2MoO4×2H2O、2.5g H3BO3、0.7g CoCl2×6H2O、0.25gCuSO4×5H2O、1.6g MnCl2×4H2O、0.3g ZnSO4×7H2O，加水至1升)中，以10L的规模连续给料葡糖溶液，36小时(48小时)后，发酵液中达到18-19g/l(22-25g/L)的泛酸浓度。
通过对培养基-、菌株和发酵方法的发展，也可能将发酵液中的泛酸滴度提高到高于40，45，50，55，60，65，70，75，80，85和高于90g/L依据本发明方法的一个主要优点是，发酵在培养基中进行，它除了至少含有一种碳源和氮源外，不含有其他前体作为原料。就是说，D-泛酸的生物合成不依赖于其他前体的给料。依据本发明，这些前体应理解为例如像β-丙氨酸和/或L-天冬氨酸和/或L-缬氨酸和/或α-酮异戊酸和/或及其组合之类的物质。
在依据本发明方法的一个优选的变体中，产生D-泛酸的生物体在培养基中进行发酵，该培养基至少含有一种碳源和氮源作为前体，但是该培养基中不添加β-丙氨酸。与公知的方法相比，不依赖于前体的供料，是本发明方法的一个特殊的具有显著的经济意义的优点，这是因为许多前体是非常昂贵的。
依据本发明，适合于在培养基中发酵前述生物体的碳源的示例是糖，如淀粉水解产物(单-、双-、低聚糖)，优选葡糖或者蔗糖以及甜菜或者甘蔗糖蜜，蛋白质，水解蛋白，大豆粉，玉米浆，脂肪，游离脂肪酸，从已经发酵或者水解产物中回收的细胞以及酵母浸膏。上述列举并非限定本发明，下面的有关氮源的示例也是如此，适用的氮源如氨、硫酸铵、尿素、蛋白质、水解蛋白或者酵母浸膏。此外，发酵培养基还可含有无机盐和/或微量元素，如氨基酸和维生素。多种适合的发酵培养基的具体成分对于所属领域技术人员而言是已知的并且是可得到的。
在采用技术人员公知的细胞密度将适合的产生D-泛酸的生物体在发酵培养液中接种后，进行所述生物体的培养，适当时，加入消泡剂。依据本发明，发酵以这样的方式进行，即使得在发酵结束时，干燥发酵溶液的固体含量至少为6％(重量)，并且游离D-泛酸的含量至少为2％(重量)，优选至少4％(重量)。为此，可以进行分批发酵、分批供料或重复分批供料(此时对碳源供料进行计量)，或者进行连续发酵。发酵温度为10-70℃，优选20-50℃。发酵罐内通入氧气、空气或者含氨或其他惰性气体的混合体。pH值调整到4-8，优选5-7范围内，并且在适当的时候加入适用的碱和/或酸进行调节。
此外，本方法的另外的优点还在于，将总糖含量在发酵结束时降到最低水平，这是因为如果不如此的话，会由于粘结而给发酵溶液后面的干燥和/或配制制剂过程增加困难。依据本发明，这一点可以以如下方式实现，即在碳源消耗后(在分批操作培养时)或者在碳源供料(分批供料或者重复分批供料操作过程进行时)停止后和/或调整碳源的浓度实际为零(在分批供料、重复分批供料发酵或者连续发酵进行的情况下)，发酵继续进行一段时间。
依据本发明，这一点由此进行，即在中断碳源(例如糖溶液)供料后，继续进行发酵，直至发酵溶液中溶解氧浓度(pO2)达到饱和值的至少80％，优选90％并特别优选95％。
此外，依据本发明方法，重要性在于，发酵溶液无需进行进一步的加工步骤便可以进行干燥和/或配成制剂。也就是说，不需要将含有所需的D-泛酸的产品从发酵溶液中分离出来进行复杂的加工步骤，例如像通过活性炭吸附增加纯度。同样，也不需要将生物质从发酵溶液中分离出去，所以本发明的产品的蛋白含量，即含有D-泛酸的动物饲料添加剂的蛋白含量可以最多为50％(重量)。
发酵溶液的干燥和/或配成制剂的过程可以按照公知的方法进行，例如像雾化干燥、雾化粒化、流化床干燥、流化床粒化、鼓式干燥或者快速旋转干燥(spin-flash trocknung)(Ullmann`s Encyclopedia of IndustrialChemistry，6th edition，1999，electronic release，Kapitel“Drying of SolidMaterials”)。在对流空气干燥时，进气口温度处于100-280℃，优选120-210℃。排气口温度为50-180℃，优选60-150℃。为调整所需的颗粒大小分布和与此相关的产品特性，可以将细颗粒回收并再加工。也可以将粗料在研磨机中研磨，并同样随后回收。依据本发明的产品为例如米色至褐色。此外，残余水分含量小于5％(重量)，优选1-3％(重量)，并特别优选0.5-2％(重量)。为了避免产品结块，水含量不应超过5％(重量)。上述方法的方框流程示意图在图1中概述。
在上述依据本发明方法的一个变体中，发酵溶液干燥前和/或配成制剂前，适当时，将生物质与发酵溶液分离。这种分离可以是几乎全部分离或者只部分进行。优选部分分离生物质，由此可将蛋白含量降到10％(重量)以下。为取得生物质的几乎完全分离，可以通过例如离心将固体成分与含水液体进行分离。基于干燥的最终产品，在本发明的另一个变体中，甚至可以将蛋白含量调整到小于5％(重量)。分离的生物质可以有利的方式加以利用，以便补偿不同生产批次之间的发酵溶液中D-泛酸含量的自然改变，这些改变在一定的耐受范围内。例如，在从多个批次中分离生物质后，可以通过重新添加此前分离的生物体，以提供具有恒定的D-泛酸和/或其盐含量的产品。它保证产品具有可再现的恒定的质量。
在依据本发明方法的另一实施方案中，在发酵溶液干燥前和/或配成制剂前，并且适当时，在生物质分离后，将发酵溶液进行浓缩，以提高含有D-泛酸和/或其盐的固体含量。例如可以通过蒸发脱水达到这一点，出于成本原因，适当时，可以多级进行，并且为了保护产品，除了正常压力外，也可以在真空下进行。另一种可行办法是利用薄膜法。在这里例如可以使用如毫微级过滤法和/或反向渗透的方法。浓缩至D-泛酸含量为20-50％(重量)。适当时，可以同时将水循环回发酵过程。由此可以有利地减少产生的废水量，由此废水处理的费用也大大降低。这一点在图2中示出在本发明的一个优选的实施方案中，将生物质的分离与残留发酵溶液的浓缩组合进行，适当时还可将水同时循环。图3中的方框流程图中有所说明。
为此，为调整产品中物质的含量保持恒定，在依据本发明的方法中，在发酵结束后，将生物质或者其中部分，例如借助于分离、离心、超滤、微滤或者深层过滤(tiefenfiltration)或者组合进行分离。这样得到的生物质又可以再次借助于滗析机进一步脱水。然后将滗析机的滗析流循环回分离器的进水口。通过细胞分离，可以提高产品中D-泛酸的含量或将该含量调整到一恒定值，其中各种组分相互混合，以使即使发酵中含量发生变化也能毫无问题地进行处理。随后，可以进行发酵溶液的再浓缩。基于游离D-泛酸和/或其盐计，其含量为20-95％(重量)，优选30-90％(重量)。特别优选得到的产品具有60-80％(重量)和特别是大于80％(重量)的游离D-泛酸和/或其盐的高含量。
在依据本发明方法的进一步变体中，在发酵溶液干燥和/或配成制剂前至少包括下列步骤之一1)裂解和/或杀死生物质，和/或2)分离生物质与发酵溶液，和/或3)添加其他附加物质，和/或4)浓缩发酵溶液，优选通过脱水，并且适当时同时将水循环回发酵过程，和/或5)步骤1)至4)组合进行。
因此，本发明还涉及一种方法，其中，裂解和/或杀死生物质在发酵溶液中就进行，或者在将生物质与发酵溶液分离后才进行。这一点例如可以通过热处理(优选80-200℃)，和/或酸处理(优选采用硫酸或者盐酸)和/或酶催(优选采用溶菌酶)进行。用于说明的方框流程图在图4中示出。
依据本发明方法的另一实施方案涉及一种方法，其中，在浓缩前和/或干燥前和/或配成制剂前，向发酵溶液中添加其他附加物质和/或它们的混合物，用于调整D-泛酸的含量和/或用于改进产品性能，如防尘性、流动性、吸水性和贮藏稳定性。这些附加物质和/或它们的混合物的示例可以是糖类，例如乳糖或者麦芽糖糊精，也可以是谷物产品或者豆科植物产品，例如玉米棒芯粉，麦麸和大豆粉，可以是无机盐类，包括钙-、镁-、钠-、钾盐，还可以是D-泛酸或其盐本身(化学或者发酵生产的D-泛酸盐)。添加可以在干燥前和/或粒化或制剂期间进行。这一点在图5中概括介绍。
在本发明的另一变体中，生产D-泛酸钙，方法是在依据本发明方法的尽可能靠后的步骤中，也就是优选在发酵溶液的加工前和/或期间，即在发酵溶液的浓缩和/或干燥和/或配成制剂前和/或期间，添加钙盐(参见图5)。在这种情况下，钙离子的含量通过添加钙盐进行调整，使配制的最终产品中每2mol D-泛酸含有约1mol的钙盐。在此方面，对在发酵溶液中就已经含有的钙离子的含量加以考虑也是可能的并且是有利的。作为钙盐，可以使用例如氧化钙、氢氧化钙、磷酸氢钙、碳酸钙、氯化钙、硫酸钙和/或其他钙盐。
因此，本发明也涉及一方法，其中，在浓缩、干燥和/或配成制剂前和/或期间，基于配制的产品中D-泛酸的含量计，以钙盐的形式每2mol D-泛酸添加1mol钙离子附加物质。
此外，依据本发明的另一个可能变体，是通过发酵介质的成分、并且在此特别是选择带有特殊阳离子的无机盐来生产一种产品，该产品含有更多的D-泛酸的所选择的盐。例如，可以通过在发酵过程中就使用磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲剂来生产主要含有D-泛酸钾的产品。可能的盐的示例是D-泛酸的钙、钾、镁、钠或铵盐和/或它们的任意混合物。方框流程图在图6中示出。
依据本发明，前述所有变体以及图1至6中示出的方法可以自由组合。
此外，本发明还涉及按照前述任何一种方法由通过使含有至少一种产生D-泛酸的生物体发酵获得的发酵溶液生产的动物饲料添加剂，基于干物质计，该添加剂含有至少一种游离D-泛酸和/或其盐，浓度至少为30-95％(重量)，总糖份为0.1-15％(重量)，且蛋白质含量少于5至50％(重量)。
依据本发明的动物饲料添加剂的特征在于，含有50-95％(重量)，优选70-95％(重量)，特别优选60-80％(重量)和特别是多于80％(重量)的游离D-泛酸和/或其盐。
依据本发明，作为依据本发明动物饲料添加剂基的未处理的发酵溶液含有至少10g/l，优选至少20g/l并特别优选至少40g/l的D-泛酸和/或其盐。
此外，本发明的动物饲料添加剂还可以含有D-泛酸的钙、钾、镁、钠和/或铵盐和/或它们的混合物。
依据本发明动物饲料添加剂的一种特定变体，其特征在于干物质的组合物至少含有下列成分a)游离D-泛酸和/或其盐 至少30-95％(重量)b)蛋白质 最多50％(重量)c)总糖分 最多15％(重量)d)矿物质 最多20％(重量)依据本发明，动物饲料添加剂可以含有蛋白质，其上限最高为50％(重量)，下限小于10％(重量)，优选小于7％(重量)，特别优选小于5％(重量)。动物饲料添加剂的总糖分最大约为15％(重量)，作为下限可以小于约0.1％(重量)，包括所有中间值。在其水分方面，依据本发明的含有D-泛酸产品的特征是残余水含量小于5％(重量)，优选1-3％(重量)，特别优选0.5-2％(重量)。
此外，本发明还涉及动物饲料添加剂，该添加剂含有无生命的、有生命的和/或有繁殖能力的产生D-泛酸的生物体。在此方面，优选微生物，优选真菌、酵母和/或细菌。特别优选依据本发明的动物饲料添加剂含有无生命的、有生命的和/或有繁殖能力的毛霉菌属真菌、酵母属酵母和/或肠杆菌属，如大肠埃希氏菌、沙门氏杆菌属，如鼠伤寒沙门氏菌、普通变形杆菌、假单胞菌属，如Pseudomonas matophila、杆菌属，如枯草杆菌或者蜡质芽孢杆菌、棒状杆菌细菌，如Corynebacterium Glutamicum或者Brevibacterium breve和/或Actinum属的细菌和/或它们的混合物。特别优选芽孢杆菌属的细菌，在这种情况下为枯草杆菌属。同样，依据本发明，还包括遗传修饰的和/或转基因生物体和/或适合生产动物饲料添加剂的生产菌株。上述列举在此方面对本发明并无限定。
此外，依据本发明还包括动物饲料添加剂，该添加剂含有其他附加物质，优选为糖类和/或谷物产品和/或豆科植物产品和/或无机盐和/或(单独化学生产的和/或发酵生产的)D-泛酸和/或其盐和/或它们的混合物。
此外，依据本发明的动物饲料添加剂的特征还在于，该添加剂为表观密度为0.35至0.7kg/l，优选0.4至0.8kg/l的制剂。并且，依据本发明，其平均粒径为10-2000μm范围内，优选20-1500μm，特别优选25-1000μm和最优选30-800μm。该制剂具有米色至褐色的颜色。依据本发明的动物饲料添加剂还可以是含有包衣的粉末、颗粒剂、粒状物和/或它们的组合。依据本发明的动物饲料添加剂的制剂(例如通过包装化合物将其配成制剂)的作用在于例如改进产品性能，如防尘性、流动性、吸水性和贮藏稳定性。
此外，本发明还涉及将具有上述性能的动物饲料添加剂作为动物饲料和/或动物饲料添加剂的应用。
下面的实施例仅用于说明本发明，而对本发明绝无限定作用实施例1采用枯草杆菌生产含有D-泛酸的发酵液在带有搅拌器和通气装置的14升容量的实验发酵罐中，放入含有下列成分的含水发酵培养基酵母浸膏 20g/l色氨酸 5g/l硫酸铵 2g/l谷氨酸钠 5g/l在灭菌后再添加下列培养基成分KH2PO410g/lK2HPO4×3H2O 20g/l葡糖 10g/lMgCl2×6H2O 1g/lCaCl2×2H2O 0.1g/l柠檬酸钠 1g/lFeSO4×7H2O 0.01g/l
微量盐溶液 6ml/l微量盐溶液成分如下0.15g Na2MoO4×2H2O，2.5g H3BO3，0.7g CoCl2×6H2O，0.25gCuSO4×5H2O，1.6g MnCl2×4H2O，0.3g ZnSO4×7H2O加水到1升。
添加微量盐溶液通过除菌过滤进行。起始液体容量为6升。上面所列含量基于该值。
向该溶液添加60ml枯草杆菌PA377接种培养物(OD600＝9.5)，并在37℃、200U/min(200rpm)、通气速率12l/min下发酵。这一菌株在附件PCT/US申请0025993中介绍。
在72小时内，计量加入4.5升含有下列物质的无菌水溶液葡糖 400g/lCaCl2×2H2O 0.4g/l酵母浸膏 25g/l在发酵期间，通过发酵罐通风口加入氮或磷酸将pH值保持在7.2。氨同时还起到发酵氮源的作用。通过控制搅拌速度将容解氧保持在饱和值的30％。在中断加入碳源后，继续进行发酵直至溶解氧含量(pO2)达到饱和值的95％。此后结束发酵，并将生物体经热处理杀死。为此将发酵溶液在100℃保持1小时。通过涂片验证杀死情况。在72小时后中断时，D-泛酸的浓度为28g/l。
以类似方法，也可以制造不同发酵液，其泛酸滴度高于20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85和高于90g/L，无需加入β-丙氨酸。
在这种发酵中，D-泛酸的对抗离子通过在发酵中使用磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液进行调整，从而主要获得D-泛酸的钾盐，也就是D-泛酸钾。
实施例2从含D-泛酸的大肠埃希氏杆菌的发酵溶液中分离细胞并干燥按照US 6,013,492实施例1，利用大肠杆菌IFO 814/pFV31生产含D-泛酸的发酵溶液。随后，向发酵液中通气到完全消耗碳源，溶解氧含量(pO2)上升到高于80％。
随后，用分离机将细胞分离。此时，D-泛酸的含量为38.5g/l。在利用旋转蒸发仪在真空下(＜100mbar)蒸发到固体含量约为45％(重量)后，在下列条件下采用实验室雾化干燥器干燥浓缩物进气口温度 100-250℃排气口温度 60-150℃得到平均粒径为20-300μm的可自由流动的产品。
实施例3在从含D-泛酸的枯草杆菌发酵液中分离出生物质进行干燥实施例1的发酵溶液(1升)在实验室雾化干燥器中在下列条件下干燥进气口温度 100-250℃排气口温度 60-150℃得到平均粒径为20-300μm的可自由流动的产品。
实施例4分离细胞和干燥采用乳糖作为添加物质的含D-泛酸的发酵溶液将得自实施例1的发酵溶液(1升)的生物质在离心机中离心。将上清夜与30g乳糖混和，并在实验室雾化干燥器内在下列条件下干燥进气口温度 100-250℃排气口温度 60-150℃得到平均粒径为40-500μm并且游离D-泛酸含量＞30％(重量)的可自由流动的产品。
实施例5含D-泛酸发酵液的干燥，其中采用化学生产的D-泛酸钙作为添加物质，例如，用于调整最终产品中D-泛酸至一定的浓度，将得自实施例1的发酵溶液(1升)的生物质在离心机中离心。将上清夜与100g化学生产的D-泛酸钙混和，并在实验室雾化干燥器内在下列条件下干燥，干燥含有D-泛酸发酵溶液
进气口温度 100-250℃排气口温度 60-150℃得到平均粒径为40-500μm并且游离D-泛酸含量＞60％(重量)的可自由流动的产品。
实施例6由发酵溶液配制的D-泛酸制剂中钙含量的调整在生物质分离后，含有D-泛酸的发酵溶液含有95g/l的固体含量，其中70g/l D-泛酸和25g/l其他固体(盐、生物质的残余物、发酵培养液的其他固体组分，无钙离子)。
下面列出的是在添加不同钙盐情况下，制剂产品中的D-泛酸含量。在此方面，对钙含量进行这样的调整，即使每2mol D-泛酸含有1mol的钙离子。
图1示出通过对发酵溶液进行干燥和/或配成制剂而生产D-泛酸盐的方法的方框流程图。
图2示出通过对发酵溶液进行干燥和/或配成制剂而生产D-泛酸盐方法的方框流程图，包括浓缩步骤并将分离的水再循环回发酵步骤。
图3示出通过对发酵溶液进行干燥和/或配成制剂中生产D-泛酸盐的方法的方框流程图，包括细胞分离步骤。
图4示出用于生产D-泛酸盐的方法的方框流程图，其中，在发酵(在A方法中)后和/或在细胞分离(在B方法中)后进行细胞裂解和/或生物体杀死。
图5示出用于生产D-泛酸盐的方法的方框流程图，其中，为进行干燥添加附加物质。
图6示出用于生产D-泛酸盐的方法的方框流程图，其中，通过选择在发酵培养液中使用的盐获得所需的阳离子。
权利要求
1.用于生产含有游离D-泛酸和/或其盐的动物饲料添加剂的方法，该方法包括a)将产生D-泛酸的生物体在含有至少一种碳源和一种氮源而不添加其他前体的培养基中发酵，并且b)将含有D-泛酸和/或其盐的发酵液在不采用其他加工步骤情况下进行干燥和/或配成制剂。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵持续进行直至固体含量达到至少6重量％，优选7-25重量％和/或D-泛酸含量达到至少2-15重量％，优选4-15重量％。
3.按权利要求1或2所述的方法，其特征在于，中断碳源供料，和/或调整其浓度实际为零，和/或继续进行发酵直至发酵溶液中溶氧浓度达到饱和值的至少80％，优选90％并特别优选95％。
4.按权利要求1至3之任一项所述的方法，其特征在于，使用产生D-泛酸的生物体，其泛酸-(pan)-和/或异亮氨酸-缬氨酸-(ilv)-生物合成和/或天冬氨酸-α-脱羧酶已去调节。
5.按权利要求1至4之任一项所述的方法，其特征在于，在干燥和/或配成制剂前，适当时从发酵溶液中分离生物质。
6.按权利要求1至5之任一项所述的方法，其特征在于，在干燥和/或配成制剂前和适当时在分离生物质后，通过脱水、适当时同时将水循环回发酵过程来浓缩发酵溶液。
7.按权利要求1至6之任一项所述的方法，其特征在于，在干燥和/或配成制剂前至少包括下列步骤之一1)裂解和/或杀死生物质，和/或2)分离生物质与发酵液，和/或3)添加其他附加物质，和/或4)浓缩发酵液，优选通过脱水、适当时同时将水循环回发酵过程，和/或5)步骤1)至4)结合进行。
8.按权利要求1至7之任一项所述的方法，其特征在于，裂解和/或杀死生物质在发酵液中进行，或者在将生物质与发酵溶液分离后进行。
9.按权利要求1至8之任一项所述的方法，其特征在于，在浓缩、干燥和/或配成制剂前和/或期间，向发酵液中添加其他的附加物质和/或附加物质的混合物。
10.按权利要求1至9之任一项所述的方法，其特征在于，在浓缩、干燥和/或成剂前和/或期间，基于制剂产品中D-泛酸的含量计，以钙盐的形式每2mol D-泛酸添加1mol钙离子附加物质。
11.由含有至少一种产生D-泛酸的生物体发酵的发酵溶液获得的动物饲料添加剂，基于干物质计，该添加剂含有游离的D-泛酸和/或其盐，含量至少为30-95重量％，总糖份为0.1-15重量％，且蛋白质含量少于5-50重量％的。
12.按权利要求11所述的动物饲料添加剂，其特征在于，该添加剂含有50-95重量％，优选70-95重量％，特别优选60-80重量％并还特别优选多于80重量％的游离的D-泛酸和/或其盐。
13.按权利要求11或12所述的动物饲料添加剂，其特征在于，未处理的发酵溶液含有至少10g/l，优选至少20g/l并特别优选至少40g/l的D-泛酸和/或其盐。
14.按权利要求11至13之任一项所述的动物饲料添加剂，其特征在于，该添加剂含有D-泛酸的钙-、钾-、镁-、钠-和/或铵盐和/或它们的混合物。
15.按权利要求11至14之任一项所述的动物饲料添加剂，其特征在于，干物质组合物至少含有下列成分a)游离D-泛酸和/或其盐至少30-95重量％b)蛋白质 最多50重量％c)总糖分 最多15重量％d)矿物质 最多20重量％。
16.按权利要求11至15之任一项所述的动物饲料添加剂，该添加剂含有的蛋白质的量少于10重量％，优选少于7重量％，并特别优选少于5重量％。
17.按权利要求11至16之任一项所述的动物饲料添加剂，该添加剂含有的总糖份的量少于10重量％，优选约0.5重量％，并特别优选约0.1重量％。
18.按权利要求11至17之任一项所述的动物饲料添加剂，其特征在于，该添加剂含有的残余水分含量少于5重量％，优选1-3重量％，并特别优选0.5-2重量％。
19.按权利要求11至18之任一项所述的动物饲料添加剂，其特征在于，该添加剂含有无生命的、有生命的和/或有繁殖能力的产生D-泛酸的生物体。
20.按权利要求11至19之任一项所述的动物饲料添加剂，其特征在于，该添加剂含有无生命的、有生命的和/或有繁殖能力的微生物，优选真菌、酵母和/或细菌。
21.按权利要求11至20之任一项所述的动物饲料添加剂，其特征在于，该添加剂含有无生命的、有生命的和/或有繁殖能力的毛霉菌属真菌、酵母属酵母和/或肠杆菌科、沙门氏菌、假单胞菌属、杆菌属、棒状杆菌细菌和/或变形杆菌属和/或Actinum属的细菌和/或它们的混合物。
22.按权利要求11至21之任一项所述的动物饲料添加剂，其特征在于，该添加剂还含有其他附加物质，优选为糖类和/或谷物产品和/或豆科植物产品和/或无机盐和/或D-泛酸及其盐和/或它们的混合物。
23.按权利要求11至22之任一项所述的动物饲料添加剂，其特征在于，该添加剂是表观密度为0.35至0.7kg/l，优选0.4至0.6kg/l的制剂。
24.按权利要求11至23之任一项所述的动物饲料添加剂，其特征在于，该添加剂具有10-2000μm，优选20-1500μm，特别优选25-1000μm并最优选30-800μm范围内的平均粒径。
25.按权利要求11至24之任一项所述的动物饲料添加剂，其特征在于，该添加剂以包衣粉末、颗粒剂、片状物和/或它们的组合的形式存在。
26.权利要求11至25之任一项所述的动物饲料添加剂作为动物饲料和/或动物饲料添加剂的用途。
全文摘要
本发明涉及动物饲料添加剂，该添加剂含有游离的D－泛酸和/或其盐，并且还涉及其改进的生产方法。此外，本发明还涉及动物饲料添加剂在动物饲料领域中的应用。
文档编号A23K1/20GK1531398SQ01815276
公开日2004年9月22日 申请日期2001年9月8日 优先权日2000年9月20日
发明者J·米勒, K·艾克勒, J 米勒, 死 申请人:巴斯福股份公司