专利名称：蛋白质含量增加的马铃薯的制作方法
技术领域：
本发明涉及马铃薯的育种和选择。
除了为重要的主食之外，马铃薯通常是由马铃薯块茎工业加工淀粉的原料。而且近来鉴于植物蛋白源的增加的价值(例如作为动物食品)，由马铃薯块茎工业获得马铃薯蛋白质(以前认为其量是可以忽略不计的)吸引了更多的注意力，即使其仅仅作为淀粉生产时的副产物。化学上马铃薯块茎中的马铃薯淀粉主要由两种组分组成支链淀粉和直链淀粉，比例为约80％-20％，块茎中的马铃薯蛋白质主要由蛋白酶抑制剂组成，其有助于块茎预防疾病，例如寄生虫侵袭或真菌或细菌腐败并贮藏蛋白质例如patatin，比例为约60％-40％。
由于多种原因，淀粉生产者偏爱具有不同比例的支链淀粉和直链淀粉的马铃薯。马铃薯内早期诱导的基因突变，其影响酶颗粒结合淀粉合酶(GBSS)的合成，然后分子克隆该基因(Hovenkamp-Hermelink等，1987，Theor.Appl.Genet.75217-221；Visser等，1989，Plant Science64185-192)使得可以改变马铃薯的淀粉组成-这或者通过建立的育种方法或者通过现代遗传操纵技术实现。
马铃薯内的GBSS突变类似于玉米的所谓糯性(waxy)(wx)突变，并当没有该GBSS蛋白质的表达或特定功能时防止产生直链淀粉。因此，该突变已特指无直链淀粉(amf)的马铃薯突变体。这里，amf-基因突变代表导致GBSS-活性的全部功能损失的GBSS-基因修饰，尽管由该讨论的基因转录物仍然可以表达GBSS样基因产物，但是没有特定活性，由此该Amf-基因代表从中仍然可以获得具有GBSS-活性的基因产物的基因。该amf-基因特性是由单基因孟德尔隐性基因决定的，其表型可以在不同植物部分例如根尖的柱细胞、块茎、气孔保卫细胞和小孢子中的质体中检测到(Jacobsen等，1989，Euphytica4443-48)。当这些部分用碘化钾溶液(Lugol)染色时，突变体中的淀粉染成红色，野生型中的染成深蓝色。
与许多其它表型遗传标记不同，该突变或功能缺失的GBBS-或amf-基因对于遗传分析以及育种提供了某些特定益处。例如，子代在非常早期幼苗阶段以及在成熟植物中可以通过花粉染色分类，可以清楚地区分纯合和杂合体2-4剂量的四倍体突变体等位基因通过染色花粉样品中的比例5∶1、1∶1和0∶1可以容易地检测；可以检测二倍体克隆中不同类型的2n-配子，可以预测到其对得自4x*2x杂交的四倍体的表型和遗传型的影响。
由于公开了Hovenkamp-Hermelink的amf-基因马铃薯突变体，因此使用传统材料以及马铃薯的分析育种具有前途。育种的缺陷是amf的隐性性质，使得这一特性与其它农学特性在四倍体水平的组合复杂化。
因此，Chase提出的分析育种法(1963，J.Genet.Cytol.5359-364)，包括在二倍体水平育种马铃薯并通过使用2n-配子回到四倍体条件，对育种amf-变体可能具有相当大的价值。这些研究的目的至少是双重的a.将amfamf和Amfamf遗传型组合用其形成2n-配子，和b.产生能育的、无显性组合克隆作为育种无直链淀粉的马铃薯基材(basicmaterial)。另一方面，开发产生高频率2n-花粉和2n-卵的合适二倍体材料也将打开单系(unilateral)和双系(bilateral)性多倍体化的方法(Mendiburu和Peloquin，1976，Theor.Appl.Genet.48137-143)。这种二倍体育种材料可以是纯合(amfamf)或杂合的(Amfamf)，因为在这两种情况下都可以基于花粉表型进行选择。
本发明涉及马铃薯的育种和选择。本文出人意料地发现，当与具有类似遗传背景但是缺少amf-基因的马铃薯相比，具有至少一个amf-等位基因背景的马铃薯具有明显的表型益处。一种这样的益处涉及蛋白质含量。对Amf-等位基因无显性组合的遗传型，即对二倍体植物amfamf(aa)和四倍体植物amfamfamfamf(aaaa)遗传型显示甚至更强的所述益处。
本发明提供了一种具有至少一个amf-基因的马铃薯植物或其衍生部分(例如细胞、原生质体、块茎、胚、种子或外植体)，所述马铃薯植物或部分还具有增加的贮藏蛋白质的能力(本文也鉴定为高蛋白马铃薯)，特征为其块茎的总生蛋白质(total raw protein)含量(优选在其衍生的马铃薯汁中测定)为至少1.9％m/m，更优选至少2.3％m/m，最优选至少2.7％m/m。本文提供的对amf-等位基因纯合的马铃薯内，即没有直链淀粉的高蛋白质马铃薯内，这种增加的贮藏蛋白质的能力几乎完全开发。本发明人们已出人意料地发现，除去马铃薯的GBSS-活性能够增加所述马铃薯中的蛋白质贮藏，前提是它具有产生增加、或者至少足够的量的所述蛋白质的遗传能力。包括amf-等位基因的马铃薯具有比其它类似遗传背景但是没有amf-基因的马铃薯高得多的蛋白质贮藏能力。从蛋白质贮藏的角度来说，优选纯合amf-等位基因的马铃薯。
最初，amf-突变在仅对开花但是未对生育和农学特性选择的单元单倍体中诱导(Hovenkamp-Hermelink等，1987，出处同上)。因此，为了在其它马铃薯中掺入该隐性突变，本发明人将衍生自单倍体突变克隆的二倍体遗传型与农学上更需要的、然而具有野生型amf基因的克隆杂交。作为该方法的第一步，产生了对突变体特性(amfamf)纯合的能育二倍体。当这些二倍体通过体外不定枝再生而体细胞加倍时，所得四倍体证实生育力低(雄性和雌性都是)。然而通过使用4x x 2x杂交通过减数分裂加倍获得的4x植物产生能育的无显性组合四倍体。因此，尽管在最初阶段高水平的生育力和致死因子的表达，然而产生具有所需amf-遗传型的更能育的和健壮的二倍体和四倍体育种材料。利用健壮、能育和农学上有用的四倍体遗传型，而不是导致马铃薯的amf-突变体的传统育种。出人意料地发现amf-突变体，通过与野生型马铃薯杂交获得在其块茎中增加了蛋白质的贮藏能力，如今认为是经济上所需的特性。
优选所述高总生蛋白质含量也反应在可以收获的蛋白质，例如得自块茎的蛋白质的量上。这种测定是通过鉴定收获时可以利用的凝固蛋白质级分给出的，在下面的详细描述中将进一步解释。本发明还提供了一种具有至少一个amf-基因的马铃薯植物或其衍生部分(例如细胞、原生质体、块茎、胚、种子或外植体)，所述马铃薯植物或部分还具有增加的产生可以收获的蛋白质的能力，特征是其块茎的总凝固蛋白质含量(优选在其衍生的马铃薯汁中测定)至少0.9％，更优选至少1.2％，最优选至少1.5％。考虑到高蛋白质水平如今经常比高淀粉水平更有利润，本发明还提供了一种高蛋白质马铃薯(即在其块茎中大于1.2％，优选大于1.5％凝固蛋白质)，特征在于其块茎主要显示凝固蛋白质与淀粉之比为至少45kg/吨，更优选至少90kg/吨。
而且根据本发明，本发明提供了一种高蛋白质马铃薯，其特征在于它是转基因马铃薯，例如具有编码异源蛋白质的基因，例如为了提供本发明的高蛋白质马铃薯的目的，另外还具有增加的必需氨基酸水平。优选这种异源蛋白质包括富含必需氨基酸的异源蛋白质。脊椎动物可以产生在蛋白质找到的20种氨基酸的约一半；其它必需在膳食中提供。为此，后者称之为必需氨基酸。它们包括严格的必需氨基酸，有赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和色氨酸。此外，酪氨酸和半胱氨酸，尽管它们严格上不是必需的，但是认为是必需的，因为它们仅由必需氨基酸合成酪氨酸由苯丙氨酸合成并且半胱氨酸由甲硫氨酸合成。具体地说，人和其它单胃动物不能合成必需氨基酸并且需要由其膳食中获得它们。人和家畜的膳食大量基于植物材料。然而，几种必需氨基酸经常仅以低浓度存在于农作物中，其主要构成基于所述植物的膳食。具体地说，在这些膳食中经常缺少赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。膳食蛋白质经常在营养上不等价，这与不同蛋白质的氨基酸组成有关。进食提供不适量的一种必需氨基酸的膳食将导致负氮平衡，这是由于蛋白质的正常分解代谢连续，但是取代的新合成受到必需氨基酸的相对缺少的限制。这甚至发生在蛋白质的总膳食摄取明显足够的情况下。膳食蛋白质可用于合成组织蛋白质的程度受到以需要有关的量存在的必需氨基酸含量的限制。这是那种蛋白质的限制氨基酸。现在提供高蛋白质马铃薯，使其有益地用其表达和贮藏有价值的蛋白质。本发明还提供了一种具有至少一个amf-等位基因的转基因马铃薯细胞，它已经被提供了一种核酸，所述核酸编码一种蛋白质物质，即一种sink蛋白质(sinkprotein)。在一个优选实施方案中，所述细胞聚集所述sink蛋白质高达大于2％，优选4％，或者更优选大于5％-大于7％的所述细胞的总蛋白质含量。该蛋白质优选含有高含量的必需氨基酸(优选甲硫氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸或色氨酸)。在一个优选实施方案中，本发明提供了一种本发明的高蛋白质马铃薯，它包括富含必需氨基酸的异源蛋白质，如表4所列。
本发明还提供了一种育种和选择具有增加的贮藏蛋白质的能力的马铃薯的方法，包括将具有至少一个amf-基因的第一亲代马铃薯与没有amf-等位基因的第二亲代马铃薯杂交，和选择有至少一个amf-等位基因并且其块茎的蛋白质含量高于在所述第一亲代或所述第二亲代中测定的含量的子代。优选选择其块茎的蛋白质含量高于在所述第一亲代和所述第二亲代中测定的含量的子代。当然，蛋白质的贮藏在没有直链淀粉的植物中得到最完全的强化，最优选选择纯合amf-等位基因的子代。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种育种和选择具有增加的贮藏蛋白质的能力的马铃薯的方法，包括将具有至少一个amf-等位基因的第一亲代马铃薯与没有amf-基因的第二亲代马铃薯杂交，和通过如下选择子代(优选纯合amf-等位基因)测定其有至少一个amf-基因和用一种方法，例如本文所述的Kjeldahl法测定其总生蛋白质含量，从而测定其块茎的总生蛋白质含量并选择总生蛋白质含量高于在所述第一亲代或所述第二亲代中测定的含量的子代，所述方法还优选包括选择其块茎的总生蛋白质含量高于在所述第一亲代和所述第二亲代中测定的量的子代。
在另一优选实施方案中，本发明提供了一种育种和选择具有增加的产生可收获的蛋白质的能力的马铃薯的方法，包括将具有至少一个amf-等位基因的第一亲代马铃薯与没有amf-等位基因的第二亲代马铃薯杂交，和通过如下选择子代(优选纯合amf-等位基因)测定其有至少一个amf-等位基因和用一方法测定其凝固蛋白质含量，该方法包括测定总生蛋白质和蛋白质凝固步骤之后留在溶液中的总可溶性生蛋白质，如本文所述的在沸水浴中浸泡，从而测定或计算其块茎的总凝固蛋白质含量并选择总凝固蛋白质含量高于在所述第一亲代或所述第二亲代中测定的含量的子代，所述方法还优选包括选择其块茎的总凝固蛋白质含量高于在所述第一亲代和所述第二亲代中测定的量的子代。
而且，本发明提供了一种用本发明的方法选择的马铃薯，本文提供的马铃薯用于工业制备淀粉和/或蛋白质的应用和本文提供的马铃薯用于马铃薯的育种和选择程序的应用。具体地说，本发明提供了一种具有至少一个amf-等位基因的马铃薯植物或其衍生部分在提供蛋白质含量增加的马铃薯时涉及的育种和选择程序中的应用。
图1-4育种和选择马铃薯的育种方案的实例详细说明使用没有直链淀粉(amf)的二倍体马铃薯(Solanum tuberosum)突变体，制备在amf-基因座具有不同遗传型的二倍体和四倍体克隆。为了将二倍体材料用于amf-马铃薯的分析育种，选择产生大量频率的2n-花粉和2n-卵的克隆。成功尝试选择产生2n-配子的正常联会和联会消失的克隆。例如当用碘化钾溶液(Lugol)染色小孢子时，在突变体(仅包括amf-基因)中的淀粉染成红色而在野生型(仅包括Amf-等位基因)中染成深蓝色。基于小孢子中淀粉的表型，选择在Amf-基因座具有无显性组合、单显性组合、二显性组合、三显性组合和四显性组合遗传型的四倍体克隆。我们研究了突变体马铃薯植物的不同部分的淀粉性质和蛋白质含量。将块茎中的淀粉组成和蛋白质含量转变成易于记分的特征。它使得对没有直链淀粉的马铃薯的育种程序能够较早地评价在预期植物或其部分中的淀粉和/或蛋白质组成。
植物材料.单倍体无直链淀粉(amf)的克隆86.040和亲代克隆AM79.7322描述于Hovenkamp-Hermelink等(1987，出处同上)。双倍amf-植物是通过在叶外植体上不定枝再生获得的，它取自单倍体86.040的体外繁殖枝。在MS30(补充有30g/1蔗糖的Murashige &Skoog，1962，Physiol.Plant 15473-497)(MS)培养基)中根诱导之后，将大量的这些二倍体amf-植物转移到温室中，白天19℃晚上17℃，并且日长16小时，于灭菌的含叶土壤中。为了更好地开花，将部分双倍植物嫁接到番茄根状茎上。在乙酸洋红染色之后，评价花粉生育力。为了杂交，使用多种野生型马铃薯花粉。在86.040的二倍体(2x)克隆的开花上进行杂交。选择雄性和雌性生育力良好并且在雄性和雌性亲代中产生2n-配子(不减数配子)的野生型马铃薯克隆。
这样获得了在雄性和雌性方面都具有较好生育力的育种材料，因此有机会以更优越的二倍体育种材料进行杂交。由此杂交获得二倍体以及四倍体子代(4x)。二倍体材料的amf-等位基因分离，获得25％纯合植物，它可以通过用碘溶液着色块茎选择。在两个亲代中不减数花粉和不减数卵细胞的结果也可以获得一些四倍体子代。这种两侧性多倍体化也用于第三次杂交循环，利用二倍体纯合amf-克隆。获得四倍体子代的第二种方法是4x.2x杂交，其中仅花粉供体必需形成不减数配子，从而得到四倍体子代(单侧性多倍体化)。
一般说来该育种程序的头两个或三个循环用于在具有能够产生不减数配子的能力的二倍体水平产生雄性和雌性能育的amf-育种材料，作为在二倍体和四倍体染色体水平的育种程序开始。在这些育种循环中还观察到如下性质块茎形状、块茎数量和淀粉含量，但是未进行严格选择。
从第三个循环开始，在纯合四倍体amf-克隆与现有的四倍体淀粉马铃薯变体之间进行杂交。由这些变体引入针对总淀粉产生和抗病(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematode)、晚疫病(late blight)、疣病(wart disease))的遗传变化。在农学改进的这些杂交的第二个循环中，希望分离纯合隐性amf-克隆，并用碘溶液着色块茎。这种育种程序的结果是产生一些农学可接受的克隆，它们既可用于大规模生产无直链淀粉的马铃薯淀粉并以4x.4x和4x.2x杂交用作杂交亲代。
淀粉分析.用I2-KI溶液按照Hovenkamp-Hermelink等(1987)对微孔和块茎中的淀粉颗粒染色，在气孔保卫细胞和其它叶细胞中按照对小孢子所述的处理，并且在根冠细胞中通过用Lugols-溶液和水合氯醛(1∶1，v/v)的混合物处理根尖。4g水合氯醛溶解在2ml水中。按照Hovenkamp-Hermelink等，1988，Potato Res.31241-246)测定块茎的淀粉溶液中的直链淀粉百分比。按照Pijnacker和Ferwerda(1985，Can.J.Genet.Cytol.26415-419)将根尖固定并染色用于染色体计数和核型研究。例如当小孢子用碘化钾溶液(Lugol)染色时，淀粉在突变体(仅包括amf-基因)染成红色，在野生型(仅包括Amf-基因)中染成深蓝色(Jacobsen等，1989，Euphytica 4443-48)。
蛋白质分析为了测定生蛋白质和凝固蛋白质含量，将300g块茎材料与1000ppm亚硫酸氢钠(sodium bisulphite)一起在实验室混合器，型号Waring Blendor中粉碎。为了测定干物质含量，取出约10g均质样品并在40℃下干燥过夜。剩余样品在4600rpm下离心10分钟。通过用Kjeldahl法测定氮含量并在40℃下干燥过夜测定干物质来确定上清液中的生蛋白质含量。为了测定上清液中的凝固蛋白质含量，用19％HCl将pH调整至5.2，并将该液体沸腾1分钟。接着，在10000rpm下将样品离心10分钟。为了去除轻物质，在S&S 595纸过滤器上将上面的液体过滤。通过Kjeldahl法测定凝固步骤之后的上清液的氮含量。将所有试验重复一次。
如下计算生蛋白质和凝固的蛋白质的含量汁的供量＝(100-％干物质果肉)/(100-％干物质汁)生蛋白质＝N总量×供量汁×1.5×0.88×6.25凝固蛋白质＝(N总量—凝固后的N)×6.25×供量汁×1.5×0.88(1.5稀释系数)(0.88校正系数)胚培养.未成熟草莓通过用70％乙醇处理1分钟和用每100ml含有几滴1％SDS(十二烷基硫酸钠)溶液的次氯酸钙的饱和溶液处理15分钟来表面灭菌。将灭菌的草莓无菌地切开。收集胚珠并在Neal &Topoleski(1983，J.Amer.Soc.Hort.Sci.108434-438；1985J.Amer.Soc.Hort.Sci.110869-873)定义的用于番茄胚培养的培养基EC2(补充有1.10-5g/l激动素、1.10-6g/l LAA、8g/l琼脂和30g/l蔗糖的MS-培养基)上培养。在胚珠培养期间，珠被快速获得褐色并除去；然后从胚乳完全切除胚，如Haynes(1959)所述。切除的胚还在培养基EC2上于23℃见光培养16小时。拯救的小植株在MS30中繁殖生根。
结果amf-基因突变体的鉴定基于小孢子的碘染色，选择相应于野生型GBSS等位基因的无显性组合(无野生型GBSS-等位基因)、单显性组合、二显性组合和三显性组合/四显性组合的遗传型。该选择与表1中呈现的所需分离一致。
表1.二显性组合植物(AAaa x AAaa)杂交时的所期望和获得的子代。这些遗传型可以在碘染色之后通过蓝色和红色小孢子的分离来区分；三显性组合(AAAa)和四显性组合(AAAA)植物取自一个组。选择具有足够块茎进行田间试验的遗传型。
aχ2(1∶8∶19∶9)＝1.62＜7.82，这说明子代未偏离野生型GBSS等位基因的基因剂量遗传型所期望的1∶8∶18∶9分离。
二显性组合和三显性组合/四显性组合遗传型的淀粉颗粒完全是蓝色的。然而，在一些单显性组合遗传型中，小的外层有少数淀粉颗粒是红色。选择属于各自基因剂量组的大量块茎化植物用于田间试验的进一步研究(表1)。
表2.当二显性组合植物(HZ91-RUG-025x HZ91-RUG-075)杂交时子代的凝固蛋白质含量分析。这些遗传型在碘染色之后通过其蓝色和红色小孢子的分离来区分；三显性组合(AAAa)和四显性组合(AAAA)植物取自一个组。
植物遗传型 个体数平均值 S.E.
aaaa151.51**0.08Aaaa151.220.05AAaa171.100.12AAAa251.240.07AAAA**显示统计学上的显著效果，P＜0.05表3.当二显性组合植物(S90-1103xS90-1101-0004)杂交时子代的凝固蛋白质含量分析。这些遗传型在碘染色之后通过其蓝色和红色小孢子的分离来区分；三显性组合(AAAa)和四显性组合(AAAA)植物取自一个组。
植物遗传型 个体数平均值S.E.
aaaa8 1.67**0.08Aaaa131.38 0.07AAaa171.25 0.12AAAa291.46 0.03AAAA**显示统计学上的显著效果，P＜0.05GBSS-蛋白质含量分析不同遗传型的淀粉颗粒中的GBSS-蛋白质的量。
图1清楚地显示了没有直链淀粉的植物在淀粉颗粒中没有GBSS，然而在其它组的GBSS-蛋白质水平方面未观察到显著差异，这说明在蛋白质水平上不存在剂量效果。未检测到淀粉颗粒大小和块茎的支链淀粉和蔗糖含量的差异(数据未显示)。
amf突变体中异源蛋白质的过表达本发明还提供了一种具有至少一个amf基因的转基因马铃薯细胞，它具有编码蛋白质物质，sink蛋白质的核酸。在一个优选实施方案中，所述细胞聚集所述sink蛋白质高达大于2％，优选4％，或者甚至大于5％-大于7％的所述细胞的总蛋白质含量。该蛋白质优选含有大量必需氨基酸(优选甲硫氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸或色氨酸)。为了能够将这些必需氨基酸强化掺入到amf马铃薯细胞的sink蛋白质级分，所述细胞提供有一个或多个编码至少一个与所述氨基酸的生物合成路径有关的功能酶的构建体或核酸分子，这样能够使所述细胞增量合成所述氨基酸，优选其中所述氨基酸是必需氨基酸，并且由此还调节供应。优选通过引入至少一个编码所述氨基酸的生物合成中涉及的反馈不敏感酶的基因来增加游离氨基酸水平。过度产生的游离必需氨基酸通过掺入sink蛋白质来捕获，富含在植物中同时表达的所述必需氨基酸。
作为食品或饲料，生物体或组织对必需氨基酸的限制不同，因此sink蛋白质的最佳氨基酸含量随生物体不同而不同。sink蛋白质优选是如下的蛋白质，其特异性地富含特定谷物或生物体所缺乏的那些氨基酸。通过使得sink蛋白质至少为2％，优选至少4％、5％，或者甚至至少7％的用作食品或饲料的组织的总蛋白质含量，我们补偿必需限制性氨基酸。例如，就马铃薯而言，sink蛋白质优选含有至少5％，更优选至少10％赖氨酸、至少2.5％甲硫氨酸、至少2.5％半胱氨酸或至少1.5％色氨酸。
蛋白质在植物中是稳定的，聚集至高水平并且对农作物的生长和生理没有显著的不利作用。该蛋白质易于被牲畜和/或人消化道充分消化。
sink蛋白质候选物例如可以从已知的贮藏蛋白质中选择。几个出版物描述了植物贮藏蛋白质的氨基酸组成以及其可以用于强化食品和饲料谷物的必需氨基酸组成的应用。谷物例如所谓谷醇溶蛋白类型的小麦、大麦和玉米的贮藏蛋白质中的含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)的含量不同。一些是相对高的富S氨基酸。然而，它们中大多数的赖氨酸和色氨酸严重不足(Shewry，P.R.，(1998)Transgenic PlantResearch，第135-149页)。豆类和其它双子叶植物的贮藏蛋白质主要是球蛋白家族或白蛋白家族。球蛋白中的含硫氨基酸通常非常少，但是有时的确含有相当高比例的赖氨酸。豌豆球蛋白(蚕豆(Vicia faba)的)中的赖氨酸含量是7.2％、苏氨酸含量是3％并且甲硫氨酸含量仅为0.2％。贮藏蛋白质的2S白蛋白家族通常具有高含量的富S氨基酸。巴西坚果2S白蛋白含有约26％硫氨基酸(Ampe 1986)，并且向日葵2S白蛋白(Sfa8)含有24％硫氨基酸(Kortt 1991)。具有高含量的赖氨酸残基的其它贮藏蛋白质是得自大麦的蛋白酶抑制剂C1和C2(分别是9.5％和11.5％赖氨酸，Hejgaard and Boisen(1980))和马铃薯的半胱氨酸蛋白酶抑制剂multicystatin(Waldron等，1993Plant Mol Biol.23(4)801-12)。
植物中蛋白质聚集的水平是通过与该蛋白质降解速度有关的合成速度决定的。降解速度是由其对存在于产生组织中的蛋白酶的攻击的敏感性决定的。该蛋白酶敏感性受到该蛋白质表面上的易感序列结构域的可利用性以及蛋白质的结构刚性的影响。为了选择在植物中具有高的聚集机率的蛋白质，蛋白质优选具有刚性三级结构，具有最小的暴露序列结构域。某些蛋白质具有聚集成或大或小的规则或组织化大分子结构的天然趋势，例如蛋白质体或蛋白质晶体。自然，在具有贮藏功能的植物组织中聚集的贮藏蛋白质天然适合稳定地保留在这些植物组织中。因此种子贮藏蛋白质是不同的聚集必需氨基酸的候选物。然而，少有几种植物贮藏蛋白质将总是具有与所需必需氨基酸有关的所需组成。而且，一般说来必需氨基酸的量经常太低。因此本发明提供了使用由富含编码所述所需氨基酸的必需密码子的核酸编码的sink蛋白质。除此之外，自然界中存在在其天然组织中形成(半)结晶结构的几种蛋白质。实例是一些过氧化物酶体蛋白质如醇氧化酶或尿酸氧化酶或晶体蛋白(眼晶状体蛋白)。同样植物结构蛋白质能够形成规则的结晶样结构，例如存在于马铃薯皮中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂multicystatin。
作为一个实例，提供了含有编码具有二氢吡啶二羧酸合酶(DHPS)活性的酶的DNA序列和编码富含必需氨基酸的sink蛋白质的DNA序列的基因构建体，例如multicystatin的组合应用。该构建体的前半部分含有DHPS基因，使得植物或其部分中游离赖氨酸的水平比野生型每一氨基酸的水平大10倍。该表达调节应是这样的，表达以不会破坏植物的程度的方式产生赖氨酸，即与野生型植物相比在表型中不会引起负畸变。该基因构建体组合的第二部分由编码sink蛋白质的基因组成，它含有大量必需氨基酸。该sink蛋白质使得掺入到蛋白质级分的必需氨基酸增加。这样其可以从游离氨基酸库中取得这些氨基酸，因此进一步增强这些必需氨基酸的合成。
实施例1.具有突变体马铃薯DHPS基因的嵌合基因构建体使用标准方法进行DNA分离、亚克隆、限制分析和DNA序列分析(Sambrook，J.等(1989)Molecular Cloning.A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1994)Currentprotocols in molecular biology，John Wiley & Sons)。
为了产生反馈不敏感DHPS，将进化保守氨基酸残基134(天冬酰胺)变成半胱氨酸残基(W00148230)。突变体DHPS编码DNA片段(命名为DHPS-134ncl)用于在马铃薯植物中表达。
通过将DHPS cDNA自pTriplex载体亚克隆入pCR-Script SK(+)中，并且将DHPS cDNA作为XbaI-Eco RI片段自该载体亚克隆进用XbaI-EcoR消化的pBluescript SK载体中，由此来构建含有突变体DHPS基因的嵌合基因。用该克隆进行诱变，获得克隆pAAP57-134ncl。在5′端，将该突变的DHPS cDNA融合到800bp长GBSS启动子片段的HindIII-SalI片段上(Visser等，出处同上)。在该突变体DHPS序列的下游，得自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的胭脂碱合酶基因的终止信号(Greve，H.D.等(1983)J.Mol.Appl.Genet.1499-511)作为SstI-EcoRI片段插入。将该完整嵌合基因亚克隆到pBINPLUS的HindII-EcoRI位点(Van Engelen，F.A.等(1995)Transgenic Research 4288-290)(pAAP105)。
将该二元载体pAAP105用于根癌农杆菌菌株AGLO的冻融转化(Hfgen，R.和Willmitzer，L.(1988)Nucl.Acids Res.169877)。转化的AGLO接着用于接种马铃薯(Solanum tuberosum，品种Kardal)茎外植体，如Visser(Visser，R.G.F.(1991)Plant Tissue Culture Manual B5(K.Lindsey编辑)1-9，Kluwer Acad.Publishers，The Netherlands)所述。在含有卡那霉素的培养基上再生枝和根之后，将植物放入土壤并转移至温室中。用缺少二元载体的土壤杆菌属菌株AGLO处理的茎外植体(在没有卡那霉素的培养基上)再生的植物用作对照。
实施例2马铃薯multicystatin基因的过表达马铃薯multicystatin(本文后面的PMC)基因编码多结构域半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质。在5′端将PMC基因的基因组克隆(Waldron等，(1993)Plant Molecular Biology，23801-812)融合到得自烟草花叶病毒的包被蛋白的ωDNA序列上(Gallie，D.R.等(1987)Nucl.AcidsRes.153257-3273)。在PMC序列的下游，插入得自根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因的终止信号(Greve，H.D.等(1983)J.Mol.Appl.Genet.1499-511)。在pBluescript中以BamHI/SpeI片段克隆该嵌合PMC基因构建体。该patatin启动子(Wenzler，H.C.等(1989)Plant Mol.Biol.1241-50)以平(填平HindIII)/BamHI片段在用SmaI/BamHI消化的PMC嵌合基因的前面连接(pAAP169)。
实施例3.马铃薯植物的转化将二元载体pAAP105和PAAP169用于根癌农杆菌菌株AGLO的冻融转化(Hofgen，R.和Willmitzer，L.(1988)Nucl.Acids Res.169877)。转化的AGLO接着用于接种四倍体野生型马铃薯(Solanumtuberosum，品种Kardal)和四倍体amf突变体KA96-1396茎外植体，如Visser(Visser，R.G.F.(1991)Plant Tissue Culture Manual B5(K.Lindsey编辑)1-9，Kluwer Acad.Publishers，The Netherlands)所述。在含有卡那霉素的培养基上再生枝和根之后，将植物放入土壤并转移至温室中。用缺少二元载体的土壤杆菌属菌株AGLO处理的茎外植体(在没有卡那霉素的培养基上)再生的植物用作对照。
实施例4.转基因植物中游离氨基酸含量的分析组织(0.5-1.0g)用研钵和研杵于含有1mM二硫苏糖醇的2ml50mM Pi缓冲液(pH7.0)中匀浆。加入Nor-亮氨酸作为内标准。游离氨基酸经5ml的水∶氯仿∶甲醇混合物(3∶5∶12)萃取纯化。收集水相并将剩余物再萃取两次。冻干浓缩至3ml之后，通过HPLC使用阳离子交换柱分析20mu 1样品，在570和440nm下测定氨基酸的柱后茚三酮衍生化(BIOCHROM 20，Amersham Pharmacia biotech)。
实施例5.转基因植物的凝固蛋白质含量为了测定生蛋白质和凝固蛋白质含量，将300g块茎材料与1000ppm亚硫酸氢钠一起在实验室混合器Waring Blendor型中粉碎。为了测定干物质含量，取约10g均匀样品并在40℃下干燥过夜。剩余样品在4600rpm下离心10分钟。在该上清液中，通过用Kjeldahl法测定氮含量并在40℃下干燥过夜测定干物质来确定生蛋白质含量。为了测定上清液中的凝固蛋白质含量，用19％HCl将pH调整至5.2并将该液体煮沸1分钟。接着，在10000rpm下将样品离心10分钟。为了除去轻物质，将上述液体经S&S 595纸过滤器过滤。通过Kjeldahl法测定凝固步骤之后的上清液的氮含量。所有试验都重复一次。
表4富含赖氨酸豌豆球蛋白 蚕豆436aa32lys(7.2％) 贮藏蛋白质SCR1 大豆102aa21lys(20.6％)应激诱导Fcor2 草莓133aa19lys(14.3％)冷诱导TLRP 番茄62aa 11lys(17.7％)基质蛋白质multicystatine 马铃薯 11.8％lys蛋白酶抑制剂富含甲硫氨酸γ玉米醇溶蛋白 玉米211aa55met(26.1％)贮藏蛋白质10kDa玉米醇溶蛋白 150aa31met(20.7％)贮藏蛋白质2S白蛋白 向日葵 141aa18met(12,8％)贮藏蛋白质富含苏氨酸TIP13 芦笋182aa23thr(12.6％)收获PTGRP 番茄78aa 16thr(20.5％)水应激富含半胱氨酸PA1b 豌豆130aa10cys(7.7％) 贮藏蛋白质SE60 大豆47aa 8cys(17.2％) 贮藏蛋白质PCP1 油菜籽 83aa 8cys(9，6％) 花粉/柱头(rape seed)
权利要求
1.一种具有至少一个amf-基因的马铃薯植物或其部分，所述马铃薯植物或部分还具有增加的贮藏蛋白质的能力，特征在于其块茎中的蛋白质含量为至少1.9％m/m。
2.如权利要求1的马铃薯植物或部分，特征在于所述块茎中的蛋白质含量为至少2.3％m/m。
3.如权利要求2的马铃薯，特征在于所述块茎中的蛋白质含量是至少2.7％m/m。
4.如权利要求1-3任一项的马铃薯，特征在于它是不含直链淀粉的马铃薯。
5.如权利要求1-4任一项的马铃薯，特征在于其块茎基本上显示出凝固蛋白质与淀粉之比是至少45kg/吨。
6.如权利要求5的马铃薯，其显示出凝固蛋白质与淀粉之比是至少90kg/吨。
7.如权利要求1-6任一项的马铃薯，特征在于它是转基因马铃薯。
8.如权利要求7的马铃薯，其包括异源蛋白质。
9.如权利要求8的马铃薯，其中所述异源蛋白质包括表4中所列的蛋白质。
10.一种育种和选择马铃薯的方法，包括将具有至少一个amf-基因的第一亲代马铃薯与没有amf-基因的第二亲代马铃薯杂交，通过测定其存在至少一个amf-基因并测定其蛋白质含量来选择子代，以及选择具有至少一个amf基因并且蛋白质含量高于所述第一亲代或所述第二亲代中测定的含量的子代。
11.如权利要求10的方法，还包括通过确定其块茎或根冠的蛋白质含量来测定蛋白质含量。
12.如权利要求10或11的方法，还包括选择amf-基因纯合子的子代。
13.一种用如权利要求10或12的方法选择的马铃薯植物或其部分。
14.具有至少一个amf-等位基因的马铃薯植物或其部分在用于提供具有增加的蛋白质含量的马铃薯的育种和选择程序中的应用。
全文摘要
本发明涉及马铃薯的育种和选择。本发明提供了一种具有至少一个amf－等位基因的马铃薯植物或其所得部分，所述马铃薯植物或部分还提供有增加的贮藏蛋白质的能力，它是通过其块茎的蛋白质含量增加表征的。而且，本发明提供了一种育种和选择具有增加的贮藏蛋白质的能力的马铃薯的方法，包括将具有至少一个amf－等位基因的第一亲代马铃薯与没有amf－等位基因的第二亲代马铃薯杂交，和选择一存在至少一个amf－等位基因并且其块茎的蛋白质含量高于所述第一亲代或所述第二亲代中测定的蛋白质含量的子代。
文档编号A01H5/04GK1744813SQ200380109482
公开日2006年3月8日 申请日期2003年12月2日 优先权日2002年12月4日
发明者保罗·黑雷斯, 尼古拉斯·克莱门丝·马里亚·亨里克斯·德费滕 申请人:阿韦贝合作公司