专利名称：壳聚糖作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及壳聚糖应用技术的改进，即壳聚糖的新用途。具体讲是，壳聚糖作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂的应用，属于观赏鱼饲料技术领域。
背景技术：
现有技术中，观赏鱼市场的开发前景广阔，从世界市场看，观赏鱼出口亚洲居首位，供应量占全球市场总量的50％以上，但我国观赏鱼出口贸易很小。从重量上看，1995年世界出口13571吨，而中国出口仅460吨(占3.4％)；从金额上看，1999年出口金额232.2万美元，仅占世界观赏鱼出口额的1.4％。事实上，我国观赏鱼市场很活跃，但总成不了规模，没有自己的特点。观赏鱼养殖厂家大多是一个模式，一个套路，在世界观赏鱼行业中名声不大。究其原因主要是养殖品种档次低，体形，色泽没有特点。而就观赏鱼的商品价值而言，其中一个非常重要的指标在于鱼体的色彩，一旦失去鲜艳的颜色，就会影响欣赏价值。然而在现有的养殖条件下，一些观赏鱼的体色与自然状态下生活的同种个体有某些差异。其主要表现在颜色减退，部分漂亮的条纹消失，造成养殖观赏鱼这种体色变异的原因，可能是它们的生活环境不同，而更主要的原因是缺少先进有效的防病保健营养饲料和水质管理技术，使观赏鱼很难上新的台阶。而对于影响观赏鱼体色素沉淀的重要因素有(1)饲料和动物体内的过氧化物含量过高，影响其体色素沉淀，因而保护动物体内脂肪和色素免受氧化破坏是一重要措施；(2)鱼色素沉积是鱼的健康状况的另一重要因素，如消化道疾病，寄生虫病，沙门氏菌病等会降低观赏鱼对饲料中各种成分(包括色素)的消化和吸收，影响色素沉着。随着观赏鱼养殖业向名、特、优、新方向发展，改善养殖对象体色问题已日趋紧迫。
发明内容
本发明的目的是要提供一种调节观赏鱼体色和体重的海洋生物制品。由于壳聚糖天然无毒，无副作用，具有广谱抗菌性，抗氧化活性，调节免疫功能等多种药用活性，这几种活性与观赏鱼鱼体色素沉积息息相关。因此，本发明对壳聚糖作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂的应用进行了研究。本发明有望改善我国在观赏鱼养殖业的落后现象，缩短我国在观赏鱼领域与国际的差距。
本发明的任务是由以下技术方案完成的，研制了壳聚糖作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂的应用。
所述观赏鱼保健营养饲料，其含有重量比为1——25％的壳聚糖。
所述的壳聚糖，其脱乙酰度为60——85％，分子量为20——76万。
所述的饲料，其包括基础饲料，粘合剂和赋形剂。
所述的基础饲料，其包括粗蛋白，粗脂肪，酵母粉，紫菜，适量的钾、铜、铁离子。
所述的粘合剂和赋形剂，其为面粉，或/和羧甲基纤维素，或/和明胶，或/和糊精，骨粉，鱼粉，或糖衣，或胶囊。
所述的饲料，其还添加天然色素，或/和甜菜碱。
所述的天然色素，其为花青素，或虾青素，或原花色素，或辣椒色素。
本发明的优点在于由于壳聚糖具有抗氧化活性，而抗氧化剂能降低饵料和动物体内过氧化物的含量，保护脂肪和色素免受氧化破坏，因此，壳聚糖可以作为抗氧化剂添加到饲养观赏鱼的饲料中。由于壳聚糖是阳性趋化剂，在观赏鱼动物体内壳聚糖上的阳性基团氨基可吸收单核细胞而从血管中游出，聚集在组织中形成吞噬细胞，或直接刺激局部组织，促进细胞增生，进而演变为巨噬细胞。因此该壳聚糖可以激活机体免疫系统，促进体液免疫和细胞免疫功能。该壳聚糖为典型的B细胞活化剂，可提高巨噬细胞的吞噬功能和水解酶的活性。因此，壳聚糖在观赏鱼体中可能是有增加血淋巴吞噬细胞的能力，是一种很好的调节观赏鱼机体免疫力的添加剂。由于壳聚糖分子中的氨基带正电，而大多数的致病菌都呈阴离子性状，壳聚糖可与病原菌表面鞭毛及套膜吸附凝聚。带正电的壳聚糖与带负电的病原菌可以相互结合，而后可排出体外，从而抑制了病原菌的生长。因此，壳聚糖可抑制观赏鱼中病原菌的繁殖而增强了观赏鱼的抗病能力。所以，壳聚糖在抗氧化，提高免疫力，抑制病原菌的作用效果佳，对观赏鱼的增色及增重具有一定的作用，可以作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂。
本发明的具体实施方式
实施例，本发明的保护范围不仅局限于下列实施例中。本发明采用的壳聚糖是由青岛百成海洋生物资源有限责任公司生产提供的。
一、壳聚糖的抗氧化活性作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂的应用实验研究，其具体方法为(1)、配制PH＝7的磷酸缓冲溶液3000ml。
(2)、配制浓度为3×10-3mol/L的氮氨酸溶液。
(3)、配制浓度为18×10-6mol/L的核黄素溶液。
(4)、配制浓度为225×10-6mol/L的氮蓝四唑(NBT)溶液。
(5)、配制系列浓度的壳聚糖溶液(0.5×10-2～0.05×10-2g/ml)。
(6)、各取(2)，(3)溶液0.5ml加入比色管，再加入(4)溶液0.5ml，比色管在日光灯下照射直至变色，此为空白样。
(7)、各取(2)、(3)溶液0.5ml加入比色管，再加入(4)溶液0.5ml，并向比色管加入0.5ml(5)溶液，将比色管在日光灯下照射约30min。
(8)、将(6)，(7)样放入分光光度计中，测定各样品的吸光度。
对自由基的清除率按下式计算
其中，A0为空白样的吸光度，A为样品的吸光度。试验结果，见表1表1 不同质量浓度的壳聚糖对清除O2·-活性的影响
由表1可以看出壳聚糖对O2·-具有明显的清除活性，清除率可达62.8％。质量浓度越低，清除O2·-活性相对较差。此表说明壳聚糖具有抗氧化活性，而抗氧化剂能降低饵料和动物体内过氧化物的含量，保护脂肪和色素免受氧化破坏，因此，壳聚糖可以作为抗氧化剂添加到饲养观赏鱼的饵料中。
二、壳聚糖作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂的应用在动物机体的免疫调节作用中的实验研究(1)、试验动物昆明种小鼠，体重18-22克，雌雄各半，由山东省新药药理研究中心实验动物室提供，合格证号970102(2)、壳聚糖对小鼠机体免疫功能的测定取健康昆明种小鼠40只，按体重随机分为4组，每组10只，分别设为壳聚糖高(300mg/kg)、低(100mg/kg)剂量组，免疫低下模型组及空白对照组，每日灌胃给药，给药时除空白对照组外各组动物皮下注射氢化可的松0.5ml(80mg/kg)，同时壳聚糖组灌胃给予各剂量药物，模型组及空白组灌胃给予等量0.5％羧甲基纤维素钠溶液。连续7天后停止注射氢化可的松，继续给予其它药物至14天，于最后一次给药后2小时摘眼球取血，离心取血清，免疫扩散板法测血清IgG含量。脱臼处死动物，取其胸腺脾脏称重。
(3)、试验结果，见表2，表3。
表2 壳聚糖连续给药14天对小鼠免疫器官重量的影响
x±s※p≤0.05※※p≤0.01 vs 模型组Δp≤0.05ΔΔp≤0.01 vs空白组N＝10由表2可见，连续给予氢化可的松后，各组动物胸腺重量与对照组比较均明显减轻，脾脏除阳性对照组外也均明显减轻，表明给予氢化可的松后可引起动物免疫器官重量明显减轻。壳聚糖高剂量、低剂量组动物的免疫器官重量均明显高于模型组。
表3 壳聚糖连续给药14天对免疫低下模型小鼠血清IgG含量的影响
X±s※p≤0.05※※p≤0.01 vs 模型组Δp≤0.05ΔΔp≤0.01 vs空白组N＝10由表3可见，连续给予氢化可的松后，除阳性对照组外，各组动物IgG含量与正常对照组比较均明显降低，与模型组比较，壳聚糖高剂量、低剂量组动物IgG含量均明显升高。
三、壳聚糖作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂在动物机体的抗菌性实验研究3.1供试菌种苹果腐烂病菌(Valsa mali)。冰箱内保存的菌种经2次转管复壮后备用。接种时用在新鲜菌落的外围，直径6mm的打孔器打取菌饼接种。
3.2供试药品脱乙酰85％的壳聚糖，试验以50％多菌灵可湿性粉剂(威海韩孚生化农药有限公司)为阳性对照，以0.1mol/LHCl溶液为阴性对照。
3.3培养基准备本实验采用PDA培养基，配方为水 1000ml；马铃薯 200g；蔗糖 20g； 琼脂粉 10g培养基配制好后，装入三角瓶中，每瓶容量为38ml(加2ml样品)或40ml(加200□1和20□1样品)，灭菌备用。
3.4实验设计样品对病原菌的抑菌活性采用生长速率法测定。样品的原始浓度为10000ppm(10mg/ml)，拟测试3个浓度，即5ppm，50ppm和500ppm对病原菌的抑菌活性。病原菌拟采用苹果腐烂病菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)。每处理设置2个培养皿，每皿接种3个菌落，对每个菌落测定最大直径和最小直径。全部试验重复一次。
3.5测试方法将灭菌的培养基加热熔化，然后放置于水浴锅中冷却至60℃，备用。分别将2ml、200□1和20□1样品溶液加入38ml、40ml和40ml 60℃的培养基中，配成含药量分别为500ppm、50ppm和5ppm的培养基，将培养基均匀倒入2个直径为9cm的培养皿中，待完全凝固后，在每个培养皿中接种3块直径为6mm的菌饼。在25℃下培养48hr或72hr后，测量菌落直径，计算样品的抑菌率。
3.6结果分析表4对苹果腐烂病菌的抑菌效果
从上述结果可看出，壳聚糖对病原菌具有抑制作用，并且浓度越大抑制作用越强。
四、壳聚糖作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂对观赏鱼的增色及增重作用的实验研究(1)、取红长尾狮头200尾(雌雄鱼各半)，经暂养12天后平均分成七组放养于65×35×40cm3的玻璃水族箱中，按金鱼的养殖方式进行养殖和管理。
(2)、将粗蛋白、粗纤维、壳聚糖(脱乙酰度为85％，分子量为76万)、酵母粉、紫菜、氨基酸、特殊矿物质、天然色素、甜菜碱等按配方比例(见表7)混合待用，然后将粘合剂(面粉和或羧甲基纤维素钠)用温开水或文火调成厚浆状，在将上述混合物慢慢掺入拌合成象蒸松糕样胚料，再经饵料机制成颗粒状鱼饲料，晒干即可用。
(3)、将(1)中的七组，设1组为对照组并投喂(2)中不含壳聚糖的饲料，其余6组为处理组，投喂(2)中拌有不同浓度壳聚糖的量为25％、20％、15％、10％、8％、5％的壳聚糖添加剂的饲料。
(4)、(3)中的观赏鱼投喂(2)中的各饲料，以12天为一个试验周期，每一周期随机地从其中的三个试验组中抽取雌雄鱼4-5尾，进行以下项目测试①用精密天平测量观赏鱼体重变化情况，可检测出壳聚糖对观赏鱼的健康状况，即体重的影响。结果，见表5。
②用722型分光光度计测定一次鱼体表及肌肉中所沉积的胡萝卜素在450nm波长下的吸光度，可定性的看出壳聚糖对观赏鱼体色的影响。
(5)、利用胡萝卜素的标准曲线的回归直线方程，计算出相应的β-胡萝卜素的含量。试验过程中测定试验鱼鱼体及肌肉中所含β-胡萝卜素时是将试验鱼捣碎，提取，萃取分离β-胡萝卜素和类胡萝卜素液比色。
回归直线方程Y＝0.6032X+0.0018(n＝7，r＝0.997，p＜0.01)，其中，n为测定次数，r为线性相关系数，p为统计学的置信度，X为吸光度，Y为β-胡萝卜素的具体含量。可定量的看出壳聚糖对观赏鱼体色的影响，鱼体类胡萝卜素含量的增加表示颜色的加深。结果，见表6。
表5鱼的体重变化情况
*鱼的原始体重为4.78克，12天为一个周期。
由上表可以看出，添加壳聚糖后，鱼的体重变化明显，比用原饲料饲养的鱼的体重高出46％左右。说明壳聚糖对鱼的增重具有显著的作用。
表6鱼体颜色的变化，即鱼体β-胡萝卜素含量的变化
由于该鱼饲料中添加一定量的壳聚糖，在近50天中，随着饲喂时间延长，鱼体类胡萝卜素含量增加，处理I、II、III组的鱼体色较对照组有明显的加深，鱼体表色素沉积量增加2～4倍(鱼体色的加深，鱼体表色素沉积量就增加。因为类胡萝卜素是显色剂，它含量越多，颜色越深)，而对照组只增加了不到2倍。由于雄激素的作用，第二性征逐渐明显，雄鱼体色较雌鱼鲜艳，这与体表及肌肉沉积的β-胡萝卜素较雌鱼多有关。因此，壳聚糖作为观赏鱼养殖过程中的保健营养饲料添加剂，具有明显的增色、抗氧化、提高机体免疫力、抗菌等效果。
表7观赏鱼饲料配方，经饵料机制成颗粒饲料
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，但其都没有超出本发明的保护范围。
权利要求
1.壳聚糖作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂的应用。
2.根据权利要求1所述观赏鱼保健营养饲料，其特征在于该饲料含有重量比1--25％的壳聚糖。
3.根据权利要求1或2所述观赏鱼保健营养饲料，其特征在于所述的壳聚糖，其脱乙酰度为60--85％，分子量为20--76万。
4.根据权利要求1或2所述观赏鱼保健营养饲料，其特征在于所述的饲料，其包括基础饲料，粘合剂和赋形剂。
5.根据权利要求4所述观赏鱼保健营养饲料，其特征在于所述的基础饲料，其包括粗蛋白，粗脂肪，酵母粉，紫菜，适量的钾、铜、铁离子。
6.根据权利要求4所述观赏鱼保健营养饲料，其特征在于所述的粘合剂和赋形剂，其为面粉，玉米粉，或/和羧甲基纤维素，或/和明胶，或/和糊精，骨粉，鱼粉，或糖衣，或胶囊。
7.根据权利要求1或2所述观赏鱼保健营养饲料，其特征在于所述的饲料，其还添加天然色素，或/和甜菜碱。
8.根据权利要求7所述观赏鱼保健营养饲料，其特征在于所述的天然色素，其为花青素，或虾青素，或原花色素，或辣椒色素。
全文摘要
本发明公开了天然高分子碱性多糖——壳聚糖作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂的应用。所述观赏鱼保健营养饲料，其含有重量比为1－25％的壳聚糖。该壳聚糖的脱乙酰度为60－85％，分子量为20－76万。该饲料包括基础饲料，粘合剂和赋形剂。本发明首次将壳聚糖的生物活性与观赏鱼鱼体色素沉积联系在一起。提供的观赏鱼保健营养饲料是以壳聚糖作为制备观赏鱼保健营养饲料添加剂并进行了研究。该保健营养饲料在抗氧化，提高免疫力，抑制病原菌，调节免疫功能等的作用效果佳，对观赏鱼的增色及增重具有一定的作用。本发明有望改善我国在观赏鱼养殖业的落后现象，缩短我国在观赏鱼领域与国际的差距。
文档编号A23K1/16GK1559258SQ20041002363
公开日2005年1月5日 申请日期2004年2月28日 优先权日2004年2月28日
发明者李冠天, 邢荣娥, 郭占勇, 郭京君, 阎振广 申请人:李冠天