专利名称：一种苏云金杆菌及其菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种芽孢杆菌，尤其涉及一种能防治植物线虫的芽孢杆菌、其菌剂及其制备方法以及一种具有防治植物线虫活性的β-外毒素。
背景技术：
线虫对农作物的危害是制约农业生产的重要因子之一。据统计，全世界农作物因线虫危害所造成的损失每年超过1000万美元，实际的损失还超过这一数字。目前，防治线虫病的农药，均为剧毒类，对环境及生态平衡极具破坏作用。生物防治由于无公害，持效期长而被列为优选途径。在国内，已发现细菌中的穿刺巴斯德菌(Pasteuria penetrans)对根结线虫的防治效果相当好，但是，该菌至今无法人工培养，难以大规模生产，实际应用困难。淡紫拟青霉已经作为中试产品防治大豆孢囊线虫，但由于技术问题至今尚未能够商品化应用。国外自20世纪90年代起就开始对苏云金杆菌外毒素产生菌的杀线虫机理进行了大量的研究，Borgonie，G(1996)等研究了这类菌株对腐生线虫的毒杀作用，Addison，J.A等(1995)研究了这类苏云金杆菌两种剂型的效果，Devidas等1992报道了苏云金杆菌外毒素的作用机制，Leyns等1995报道了苏云金杆菌菌株杀线虫活性，Mozgavaya(2002)报道苏云金杆菌外毒素对腐生线虫具毒杀作用。国内已有一些综述文章介绍苏云金杆菌外毒素产生菌能防治植物线虫病，但迄今为止尚无苏云金杆菌外毒素产生菌防治植物线虫病的研究报告。
苏云金杆菌是国内外最著名的害虫生防菌，在我国也有几十年的应用历史，但仅限于防治有害昆虫，未涉及防治植物线虫病。防治有害昆虫的作用机理主要是其产生具有杀虫作用的δ-内毒素。δ-内毒素是对害虫有毒杀作用的蛋白质，由于其伴随芽孢而生又呈晶体态，故又称伴孢晶体。β-外毒素为耐高温，水溶性好的核苷类物质，目前尚不知道其完整的化学结构。
发明内容
本发明目的之一是提供一种能高效杀灭植物线虫的苏云金杆菌新菌株。
本发明的目的之一是通过以下技术方案来实现的本发明的苏云金杆菌外毒素产生菌(Bacillus thuringiensis)新菌株分离自甘肃戈壁滩土壤，命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)B24-14，该微生物的保藏号为CGMCC NO.1179；保藏地点中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2004年6月25号；该菌株的分离方法为取1克供试土壤，用无菌水将其梯度稀释，每次稀释均经充分振荡。自10-4-6的稀释液中吸取20微升上悬液，转至牛肉汁蛋白胨平板上，均匀涂开。27℃-28℃培养24小时，选取目标菌落。
该菌株在牛肉汁蛋白胨培养基上生长良好，30℃培养72小时形成稍带黄色的灰白菌落，直径约1厘米。适宜pH中性至微碱性。伴胞晶体染色，可以看到大量菱形伴孢晶体和椭圆形芽孢。其16sRNA片段序列与基因库中的苏云金杆菌的DNA序列相比照，B24-14与苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的符合率为99.8％，加之，其产伴孢晶体特性，因此将该菌株鉴定为苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)。
该菌株的微生物学特性如下菌杆状，革兰氏染色阳性，有芽孢，椭圆形，伴孢晶体菱形；该菌在牛肉汁蛋白胨培养基上菌落表面粗糙隆起，初为白色后带黄色；培养条件27-30℃，pH5.5～7.5。
此外本发明还提供了一种苏云金杆菌B24-14菌剂，其特征在于包括苏云金杆菌B24-14、发酵基物、吸附剂、填充物和水。
一种苏云金杆菌B24-14菌剂的生产工艺，主要包括如下步骤1)菌种活化；2)种子罐发酵；3)大罐深层发酵；4)过滤去渣；5)冷冻干燥。
上述生产工艺还包括下述步骤1)培养斜面菌株和培养茄瓶种子菌株；2)加入填料后搅拌、供气、发酵；3)过滤去渣4)冷冻干燥。
本发明目的之二是提供一种含该新菌株的菌剂制备工艺。
一种苏云金杆菌菌剂的制备工艺，包括下列步骤1、培养斜面菌株首先配制牛肉汁蛋白胨斜面培养基，将苏云金杆菌接种于该培养基中培养，2、培养茄瓶种子菌将牛肉汁蛋白胨培养基斜面种子菌株加矿物油在4℃冰箱内储存，使用前取出活化两次。
3、将活化后的菌株转入250毫升茄瓶中培养，培养温度为27-30℃，48小时生长良好时用灭菌生理盐水洗下菌株，将洗脱物作为种子罐的接种物。
4、按发酵罐体积的2/3投放培养基，从种子罐向生产罐接种，接种量为3～5％，开始发酵，发酵条件为培养温度为28～32℃，通风量为1∶0.5～0.8，罐压为0.05mpa/cm2，搅拌速度为220rpm，接种20小时后每隔4小时取样一次，观察菌体生长状况、是否有污染。
5、待发现孢子生成达90以上后，液体发酵完成，将发酵物过滤除渣，加填充料，菌数达到40亿/毫升，将滤液进一步冷冻干燥，即得商品化菌剂。
6、质量检验按产品企业标准的有关规定进行各项指标的测定。
上述的制备方法中，步骤1中所述的牛肉汁蛋白胨培养基其配制方法如下称取牛肉膏3克、蛋白胨5-10克、NaCl 5克，用蒸馏水定容至1000毫升，调pH值到7，高压灭菌即得。
步骤4中所述的向发酵罐中投放的培养基，其成分包括下述物质淀粉、植物蛋白、植物脂肪、粗纤维。该培养基可以由包括下述重量百分数的各组分配制而成玉米粉1.5-4.5％、豆饼粉1.5-4.5％、K2HPO41.9-2.4％、KH2PO40.5-1.0％、MgSO40.005-0.1％、花生油0.2-0.4％、其余为水。所述的培养基各组分的重量百分数优选为玉米粉3％、豆饼粉3％、K2HPO42.15％、KH2PO40.8％、MgSO40.075％、花生油0.3％、其余为水。
步骤4中所述的填充料为黄原胶。
本发明目的之三是提供一种具有杀灭植物线虫活性的β-外毒素。
本发明目的之三是通过以下技术方案来实现的一种具有杀灭植物线虫活性的β-外毒素，其特征在于由下述方法制备而成1)将苏云金杆菌B24-14摇瓶发酵培养，将发酵液离心，取上清液备用，2)将步骤1)所得的上清液减压浓缩后用乙醇分级沉淀，将最后所得的沉淀溶于去离子水中备用，3)将步骤2)所收集的沉淀水溶液分别与纤维素及乙醇混合装柱，然后用乙醇洗脱，将收集到的无色洗液除去乙醇后将固形物重新溶于无离子水即得。
本发明所用的所有化学试剂、药品或原料均可从普通生物技术公司购买得到。
本发明苏云金杆菌新菌株能够产生β-外毒素因而能够高效杀灭植物根结线虫，故能高效防治线虫对植物的危害。此外，本发明苏云金杆菌新菌株还能有效防治鳞翅目地下害虫。本发明除了具有防治害虫对植物危害的作用以外，还具有促进植物生长的作用。
以下通过实施例进一步阐明本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
图190％乙醇菌液提取物的紫外扫描结果2外毒素浓度与线虫死亡率之间关系的拟合曲线图具体实施方式
[实施例1]本发明菌剂的工业化制备培养基的配制本发明苏云金杆菌新菌株的培养基为通用的牛肉汁蛋白胨培养基，其配制的方法如下牛肉膏3克，蛋白胨5～10克，NaCl 5克，用蒸馏水溶解上述成分定容至1000毫升，调pH值至7。
工业生产用培养基的配制如下玉米粉20kg、豆饼粉20kg、K2HPO47.2kg、KH2PO45.3kg、MgSO40.5kg、花生油2kg、水45kg)生产步骤将苏云金杆菌接种于牛肉汁蛋白胨斜面培养基中培养，将牛肉汁蛋白胨培养基斜面种子菌株加矿物油后4℃冰箱内储存，使用前取出活化两次，将活化后的菌株转入250毫升茄瓶中培养，培养温度为28℃，培养48小时，菌株生长良好时用灭菌生理盐水将其洗下，洗脱物即为种子罐的接种物。在1吨的发酵罐中加入培养基，其组成为玉米粉20kg、豆饼粉20kg、K2HPO47.2kg、KH2PO45.3kg、MgSO40.5kg、花生油2kg、水45kg，将上述组分混合均匀，调pH值至6.8。从种子罐向生产罐接种，接种量为50kg，开始发酵。
发酵条件培养温度为30℃，通风量为1∶0.6，罐压为罐压为0.05mpa/cm2，搅拌速度为220rpm，接种20小时后每隔4小时取样一次，观察菌体生长状况、是否有污染，待发现孢子生成达90以上后，液体发酵完成，将发酵物过滤除渣，加黄原胶，当菌数达到40亿/毫升，进一步将滤液冷冻干燥，即得商品化菌剂。
具有杀线虫活性的β-外毒素提取物的制备将苏云金杆菌B24-14摇瓶发酵，180rpm培养24小时，发酵液121℃处理10min，12000rpm离心，取上清液备用。减压浓缩及乙醇分级沉淀取上清液100ml，在50℃下进行旋转蒸发至20ml，加入冷却的等体积的无水乙醇，4℃静置24h，离心去沉淀，上清液再加无水乙醇至乙醇浓度为60％(V/V)，4℃静置24h，离心取沉淀，并溶于10ml的无离子水中。上清液继续加无水乙醇至乙醇浓度为90％，(V/V)，在4℃静置24h，离心收集沉淀，并溶于10ml的无离子水中。将上步所收集的沉淀水溶液分别与纤维素及乙醇混合装柱，然后用80％的乙醇洗脱，收集的无色洗液即含有效成份，然后旋转蒸法除去乙醇，将固形物重新溶于无离子水即为β-外毒素提取物。
本发明新菌株杀线虫效果试验一、试验材料1、菌株本发明菌株B24-142、线虫以灰霉菌(Botrytis cinerea)培养的松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)作为挑战线虫，二、试验方法测定方法为悬滴法，即将灰葡萄孢菌接种于PDA培养基，在28℃下恒温培养4-5d，待长满白色的灰葡萄孢菌菌落，接种松材线虫，每皿接种300-400条，在28℃下恒温培养5d，白色的菌丝消失，菌落变为黄褐色时即表明线虫已经长满菌落可以提取使用。此时的线虫数量可以达到1400条/cm2。取培养2周生长有线虫的真菌培养物一皿，稀释法镜检有大量活体存在，用漏斗法分离线虫备用。将苏云金杆菌B24-14及其它待测菌株的上清液用稀释梯度法稀释为100％，75％，50％，25％，10-1，10-2...10-9，每稀释度各取5ml分别置于直径5cm平皿中，CK为清水对照。取线虫分离液一滴于目镜16X，物镜40X下镜检，达到每视野中有3-5条活体线虫。取线虫液1ml分别加入到各稀释液中，连续观察线虫存活情况，记录他们对线虫的杀伤效果及致死线虫的速度。
三、试验结果用菌液处理后4小时观察，B24-14处理组中，线虫100％死亡，对照组线虫仍然存活，表明苏云金杆菌B24-14具有高效杀线虫作用。
苏云金杆菌B24-14防治根结线虫的温室试验自北京海淀区马连洼根结线虫重病田取土，播种番茄，黄瓜。播种前，用B24-14菌剂处理土壤，设清水对照，3周后检查，处理组的黄瓜，番茄苗的根结数比对照组植株的根结数减退率为70.3～84.6％，其结果见表1和表2。
表1 本发明苏云金杆菌B24-14处理黄瓜根结数量与对照比较(个)
表2 本发明菌株防治根结线虫温室试验效果
试验结果统计分析表明处理组与对照差异显著，表明本发明新菌株能有效防治植物线虫的危害。
本发明菌株防治鳞翅目地下害虫试验一、试验材料1)供试害虫玉米螟，棉铃虫(由中国农业科学院植物保护研究所提供)，甜菜夜蛾(由中山大学昆虫研究所张宣达，周汉辉提供)。
2)菌剂本发明实施例所制备二、试验方法及结果当试虫2-3龄期，用B24-14菌剂100倍稀释液喷雾处理，每处理50头虫，重复3次。3天后玉米螟，棉铃虫死亡率达80-90％，甜菜夜蛾死亡率达60-70％。表明本发明菌株还可兼治鳞翅目害虫。
本发明菌株促进植物生长试验一、试验材料1)供试植物绿豆2)菌株本发明B24-14菌株二、试验方法采用液体培养法进行试验，方法为将B24-14菌株进行发酵培养28℃，36h检测菌量然后进行稀释，再将催芽的绿豆种子植入各个处理液中，在28℃下进行培养，观察记录绿豆苗的生长情况，7天时并进行检测植株的鲜重。
三、试验结果结果表明，用不同浓度菌液培养绿豆，可证明该菌对植物生长的影响。将B24-14的发酵液稀释10-500倍，培养绿豆，7天后检查结果。试验结果表明，在低浓度下，B24-14发酵液有促进植物生根和幼苗生长作用(试验结果见表3、表4)。
表3 B24-14不同浓度菌液对绿豆芽生根及鲜重的影响时间2003-10-24(豆芽培养7天)
表4 稀释菌剂处理后的植株鲜重对比试验
观察结果清水对照中豆芽生长细弱，茎尖在七天时发生萎蔫1/10倍发酵液的稀释液中，豆芽生长短粗，没有须根。地上部叶色浓绿，叶片较厚。
在发酵液50倍稀释液中，豆芽生长较正常，但须根较少，地上部叶较厚。
发酵液500倍稀释液中，豆芽生长较细弱，但植株最高，须根洁白，茎尖没有萎蔫现象，叶色较绿，有促进豆苗生长的作用。
β-外毒素杀线虫试验一、试验材料1、β-外毒素本发明实施例所制备2、供试线虫将松材线虫培养在灰葡萄孢(Borytis cinerea)上5d，然后用贝曼漏斗法提取线虫，提取的线虫用无菌水冲洗三次保证不含活菌，然后用于试验处理。
二、试验方法及结果细胞培养板法B24-14菌株发酵液90％乙醇(V∶V)粗提外毒素分别称取0.01g然后按照试验设计分别用无离子水进行等比稀释，然后分别取0.5ml加入细胞培养板的孔中，在孔中加入约100条线虫，在45min、2h、4h、8h、16h时检查线虫的死亡率。
用清水设置对照组，将B24-14外毒素的粗提物分别稀释为4mg/ml，2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml、0.125mg/ml溶液。
每一处理做1孔，重复4次。
试验结果见表5表5 8h时线虫的死亡率(％)
对上表中的死亡率及浓度进行曲线的拟合，并计算拟合方程。死亡率与浓度之间的关系见图2。
从拟合曲线图可以看出，随着处理浓度的增加线虫的死亡率也随之增加，二者呈现出正相关，当浓度高于2mg/ml或低于0.25g/ml时线虫的死亡率变化很小。
通过试验可以看出本发明苏云金杆菌B24-14产生的外毒素可以有效的杀死松材线虫，而且死亡率与浓度的自然对数成正相关，且随着时间的延长，防治效果提高。因此证明，本发明菌株产生的β-外毒素是杀植物线虫的有效成分。
权利要求
1.一种苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)，微生物保藏号为CGMCCNo.1179，命名为B24-14，其微生物特征为该菌杆状，革兰氏染色阳性，有芽孢，椭圆形，伴孢晶体菱形，在牛肉汁蛋白胨培养基上生长良好，30℃培养72小时形成稍带黄色的灰白菌落，直径约1厘米，适宜pH值中性至微碱性，伴胞晶体染色，可以看到大量菱形伴孢晶体和椭圆形芽孢。
2.一种苏云金杆菌菌剂，其特征在于包括权利要求1所述的苏云金杆菌、发酵基物、填充物、吸附物和水。
3.根据权利要求2所述的苏云金杆菌菌剂，其特征在于可加入辅料制成农药所通用的颗粒剂、水剂、粉剂、乳化剂、可湿性粉剂、片剂、油剂、喷雾剂、等任意剂型。
4.一种苏云金杆菌菌剂的制备方法，包括以下步骤1)培养斜面菌株首先配制牛肉汁蛋白胨斜面培养基，将苏云金杆菌B24-14接种于该培养基培养，2)培养茄瓶种子菌将牛肉汁蛋白胨培养基斜面种子菌株在矿物油中贮存在4℃冰箱内，使用前取出活化两次，将活化后的菌株转入250毫升茄瓶中培养，培养温度为27-30℃，48小时生长良好时用灭菌生理盐水将其洗下，作为种子罐的接种物，3)按发酵罐体积的2/3投放培养基，从种子罐向生产罐接种，接种量3～5％，开始发酵。发酵条件为培养温度为28～32℃，通风量为1∶0.5～0.8，罐压为0.05mpa/cm2，搅拌速度为220rpm，接种20小时后每隔4小时取样一次，观察菌体生长状况、是否有污染等，待发现孢子生成达90以上后，液体发酵完成，将发酵物过滤除渣，加填充料，菌数达到40亿/毫升，将滤液进一步冷冻干燥，即得商品化菌剂。
5.一种具有杀灭植物线虫活性的β-外毒素，其特征在于由下述方法制备而成1)将苏云金杆菌B24-14摇瓶发酵培养，将发酵液离心，取上清液备用，2)将步骤1)所得的上清液减压浓缩后用乙醇分级沉淀，将最后所得的沉淀溶于去离子水中备用，3)将步骤2)所收集的沉淀水溶液分别与纤维素及乙醇混合装柱，然后用乙醇洗脱，将收集到的无色洗液除去乙醇后将固形物重新溶于去离子水即得。
6.权利要求5所述的β-外毒素在防治植物线虫、鳞翅目地下害虫中的用途。
7.权利要求1、2或3所述的苏云金杆菌或其菌剂在防治植物线虫、鳞翅目地下害虫中的用途。
8.权利要求1、2或3所述的苏云金杆菌或其菌剂在促进植物生长中的用途。
全文摘要
本发明公开了芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的一种新菌株、其菌剂、以及一种从该菌株中提取的具有防治植物线虫活性的β－外毒素。本发明新菌株或其菌剂除能有效防治植物线虫以及鳞翅目地下害虫外，还具有促进植物生长等作用。
文档编号A01N63/00GK1715396SQ20041005006
公开日2006年1月4日 申请日期2004年7月2日 优先权日2004年7月2日
发明者唐文华, 余永年, 茆振川 申请人:唐文华