新的玉米种子切块外植体和玉米离体再生的方法

专利名称：新的玉米种子切块外植体和玉米离体再生的方法
技术领域：
本发明提供一种有效而新颖的基于新型种子切块外植体的玉米 转化和再生系统。
背景技术：
玉米是工业化国家和许多发展中国家最重要的农作物之一。除 人对玉米籽粒的食物需求外，玉米的食用还包括干磨和湿磨的加工 产品。玉米植株的谷粒及非谷粒部分还广泛用作家畜饲料，主要用 作菜牛、奶牛、猪和家禽饲料，所以非常需要种植性状优良的玉米。 因此能够对玉米培养进行控制，不仅源于想要阐明植物生长的遗传 控制，而且还想开发其商业应用。单子叶植物的种子包括单子叶，当剥去种皮后种子不会分成两 半，而双子叶植物种子的种皮被剥去后则分成两半。单子叶植物中， 胚乳养料储存在胚周围，不在单子叶中。双子叶植物中，分开的两 半是子叶，或者是养料储存区。初期的子叶通常看起来不像叶片，
但随后叶片会从生长的植株上长出来。玉米成熟籽粒有三个主要部分果皮、胚乳和胚。参见图l(T.A. Kiesselbach 1999)。果皮位于玉米籽粒的外层，由子房壁发育而成， 所以其遗传特性与母本相同。胚乳和胚则代表下一代。胚乳占粒重 的85%，是胚萌发后若干天的养料来源。胚位于玉米籽粒的朝向玉米 穗上端的较宽侧，在薄的胚乳细胞层下方。胚的大部分组织是盾片 部分，为铲状结构，负责将胚乳中储存的营养物质消化并转运给正 在萌发的子叶。Green和Philips (1975)最先报道利用组织培养使玉米植株再 生。尽管这一实验取得重大突破，但与建立稳定的细胞培养有关的 问题以及接踵而来的与基因型依赖性直接相关的限制仍然存在 (Tomes禾卩Swanson, 1982， Armstrong, 1992)。 不过近来Sairam 等人(2003)的研究结果表明，芽分生组织的全能细胞能产生大量 不依赖于基因型的再生体，而且组织培养的时间明显縮短。植物全能细胞能通过两种途径进行离体再生器官发生和体胚 发生。在器官发生途径中，全能细胞分化出单极结构，即常与亲本 组织相连的芽(Thorpe, 1994)。与之相比，当分化出具有封闭独立 维管系统、包含根和芽的两极结构时，体胚发生才出现(Thorpe, 1994)。已经发现有很多种不同的外植体都可以发生植株再生。尤其是 玉米能通过组织培养再生并能利用各种组织进行转化。前期研究所 使用的外植体包括未成熟胚(Green和Philips, 1975)、成熟胚 (Wang, 1987)、未成熟穗(Songstad等，1992)、胚芽鞘节(Zhong 等，1992a)、未成熟花(Pareddy和Petolino, 1990乂颖(Suprasanna 等，1986)、原生质体(Prioli和Sondahl， 1989; Rhodes等，1988a)、 花药(Buter等1991X小孢子(Pescitelli等，1990X叶基(Chang， 1983)、芽尖(Zhang等，1992; O'Connor-Canchez等，2002)、芽分 生组织(Sairam等，2003)和悬浮培养物(Vasil等，1985)。通过 器官发生和体胚发生已获得玉米培养再生(Harms等1976; Potrykus 等，1977; Rhodes等，1988; Vasil等，1984; Vasil和Vasil， 1986; Prioli禾n Sondhal， 1989; Tomes禾n Smith, 1985; Lu等，1982; Novak 等，1983; Armstrong和Green, 1985)。这些再生方案在操作时会伴随一些严重缺陷。未成熟胚、未成 熟花和胚性悬浮培养物的玉米再生存在共同的问题，即受到基因型 特征、体细胞无性系变异、嵌合体、难以长时间保持全能性和愈伤 组织诱导率低的制约。而且所有这些组织需要植物材料恒定供应， 所以劳动密集是这些技术的又一缺点。利用愈伤组织进行的玉米转 化法同样有局限性，这是因为非胚性(I型)愈伤组织再生率极低， 而胚性(II型)愈伤组织再生只在基因型A188或其衍生物中发生 (Armstrong禾口 Green， 1985; Armstrong, 1992)。最终，现在普遍 认为，在转化步骤前后组织培养所用时间最短的外植体是用于转化 的最佳外植体。这是因为多项研究已表明，组织培养时间过长经常 会出现对再生植株不利的体细胞无性繁殖、遗传变异和转位子移动 现象，以及出现部分或全部不育，或者丧失再生潜能。因此，仍然需要一种新的、愈伤组织诱导率高而且转化前后组 织培养无需太长时间的玉米离体再生方法。本发明能够满足这种需 要。发明内容本发明提供一种适于转化的新的玉米外植体。该外植体包括纵 向切成两半的玉米种子，其中切开后的种子暴露出均能独立用于转 化的盾片、胚芽鞘环(cole叩tilar ring)和芽尖分生组织。该玉 米种子可选自近交细胞系或杂交细胞系。某些实施例中，可能优选的做法是，在将玉米种子纵切成两半 前，先让玉米种子在含有LS基本盐和2， 4-D的切前愈伤组织启动培 养基(pre-split callus priming medium)或含有MS基本盐禾口 2， 4_D 的切前芽启动培养基(pre-split shoot priming medium)上萌发。 这种预萌发能增加愈伤组织诱导率或芽诱导率。本发明还提供一种用目的基因体外转化玉米的方法。该方法包 括制备暴露出盾片、胚芽鞘环和芽尖分生组织的玉米种子切块外植 体(maize split-seed explant)，然后用目的基因转化上述任一组 织。本发明还提供从玉米种子切块外植体上离体生出至少一个玉米 芽的方法。该至少一个玉米芽可以直接从种子切块外植体上长出， 也可以从种子切块外植体上诱导产生的愈伤组织上长出。新培养基 和生长条件(如光照/黑暗)的选择决定不同结果。


图1是玉米种子切块外植体的纵剖面。图2是对不同玉米杂交和近交系在各种浓度2， 4-D下其愈伤组 织诱导百分比所作的比较。图3显示了从玉米种子切块外植体到玉米幼苗的再生过程。图 3A示出从种子切块外植体诱导出的愈伤组织^图3B示出愈伤组织增 殖。图3C示出胚性愈伤组织产生。图3D示出愈伤组织生根。图3E 示出体细胞胚产生；图3F示出根伸长；图3G和3H示出从种子切块 外植体再生出不定丛生芽。图3工示出生根培养基上的再生幼苗。图 3J示出土壤中经切块再生出的植株。图4是对玉米杂交和近交系在BAP和激动素的各种浓度和组合 下形成从生芽所作的比较。图5A是分离出的源于种子切块的盾片的枝芽。
是盾片的活性分裂细胞；"b"是源于愈伤组织的分生组织；"C"是形成忟牙tf、Jor王细肥；"cr定源丁匁、王组织tf、j忟牙。图6是胚性愈伤组织和初期枝芽的镜检图像。图6A是胚性愈伤组织。图6B是活性分裂细胞。图6C-6E是分 化形成枝芽的分生细胞的扫描电镜图像。图7表示胚性愈伤组织数和各愈伤组织再生出的芽数。图8表示从仅添加了 BAP的培养基上形成的芽数。
具体实施方式
定义为了对说明书、权利要求有清楚和一致的理解，并界定所用术语的范围，特给出如下定义本领域熟悉的"LS基本盐"最早由Linsmaier和Skoog (尸力j^j'o^^7's /Vs77ter湖，18:100-127， 1965)报道。本发明的方 法和培养基中所用的"LS基本培养基"、"LS培养基"或"LS基本 盐"包括Linsmaier和Skoog报道的LS基本培养基和与其等同的培 养基。本领域的技术人员应当理解，与LS基本培养基等同的培养基 是指其中的盐、化学成分等组成和浓度与LS基本培养基基本相同， 这样当把某一组织或植株置于LS基本培养基后，能保持同样的生长 /发育状态。本领域熟悉的添加维生素Bs最早由Gamborg， O丄.(1968)、 Miller, R、 0jima, K. (Exp. Cell Res. 50:151—158， 1968) 报道。本领域熟悉的"MS基本盐"最早由Murashige和Skoog (尸/ j^j'o2o^y尸^gy^ar鹏，15:473-497， 1962)报道。本发明的方 法和培养基中所用的"MS基本培养基"、"MS培养基"或"MS基本 盐"包括Murashige和Skoog报道的MS基本培养基和与其等同的培 养基。本领域的技术人员应当理解，与MS基本培养基等同的培养基
是指其中的盐、化学成分等组成和浓度与MS基本培养基基本相同， 这样当把某一组织或植株置于MS基本培养基后，能保持同样的生长 /发育状态。Gamborg， 0. L. 、 Miller, R. A. 、 0jima， K. (f早CeW紋 50:151-158， 1968)报道了向Murashige和Skoog (1962)的MS基 本盐中添加维生素B5 ( "MSBs培养基")。本发明的方法和培养基中 所用的"MSB5"包括Mumshige和Skoog报道的MS基本培养基和 Gamborg报道的维生素B5以及与MSBs等同的培养基。本领域的技术 人员应当理解，与MSB5等同的培养基是指其中的盐、化学成分、维 生素等组成和浓度与MS基本培养基基本相同，这样当把某一组织或 植株置于MSB5基本培养基后，能保持同样的生长/发育状态。"植物生长素"包括但不限于天然存在和合成的植物生长素。 天然存在的植物生长素是指由色氨酸合成的吲哚乙酸("IAA")， 典型的合成植物生长素是指二氯苯氧基乙酸("2，4-D")。其他的 植物生长素包括但不限于4-氯苯氧乙酸("4-CPA" )、 4-(2，4-二氯 苯氧)丁酸、("2，4-DB")、三[2-(2，4-二氯苯氧)乙基]亚磷酸酯("2，4-DEP" )、 2- (2，4-二氯苯氧)丙酸("dicloropr叩")、 (RS)-2-(2，4，5-三氯苯氧)丙酸("2， 4， 5-涕丙酸")、萘乙酰胺、 or萘乙酸("NAA" )、 1-萘酚、萘氧乙酸、萘乙烯钾(potassium naphethenate)、 (2， 4， 5-三氯苯氧)乙酸("2，4，5-T" )、 口引哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸(IBA)、 4-氨基-3， 5， 6-三氯吡啶-2-羧酸("除 草剂")、3，6-二氯-0-茴香酸("麦草畏")、吲哚-3-丙酸("IPA")、苯乙酸("PAA")、苯并呋喃-3-乙酸("BFA")和 苯丁酸("raA")。产生植物生长素的主要部位是芽尖分生组织， 对生长素研究最多的是它促进伸长和细胞增大的功能。生长素还能 促进侧根和不定根生长。"细胞分裂素"是一组腺嘌呤的苯基尿衍生物。细胞分裂素能
促进细胞分裂(在细胞核分裂后促进细胞质分裂成细胞)。它还能延 迟叶片枯萎。化学鉴定出的第一个天然细胞分裂素称为玉米素。典型的合成细胞分裂素是6-苄氨基嘌呤("BAP")。细胞分裂素例如包括但不限于6-7，T二甲基烯丙基氨基嘌呤("2iP")、激动素、 玉米素核苷和BAP。"须介导转化"是指通过细长的针状微纤维或"须"促进DNA 插入植物细胞集合体和/或植物组织中，使所述DNA快速或稳定表 达。(例如参见通过引用合并于此的美国第5， 302， 523和5， 464， 765 号专利)。"目的基因"可以是同源DNA、异源DNA、外来DNA、基因组DNA 或者cDNA。本发明提供一种用目的基因体外转化玉米的方法，并且还提供 一种玉米离体再生的方法。在转化和再生过程中，要获得最大数量的再生体，基本前提是 先使组织培养外植体暴露出最大数量的感受态细胞。目前为止未成 熟胚一直是细胞再生的唯一可靠的外植体，特别是与转化结合时更 是如此(Lu等，1982; Vasil等，1984)。除了难以保证全年持续供 应未成熟胚之外，选取最佳时期的未成熟胚以保证再生反应的可预 测性也是很复杂的一项工作。相比之下，成熟种子易于储存，所以全年都有供应以进行组织 培养。不过根据为数不多的几篇报道称，玉米成熟种子的再生不仅 频率低而且有基因型依赖性，所以一般认为成熟种子的组织培养要 比未成熟胚更难操作(Wang， 1987; Huang和Wei， 2004)。与以前的认识不同，本发明利用成熟种子得到了适于转化的组 织培养外植体。本发明的方法包括将玉米种子纵向切成两半得到种 子切块外植体。种子切块外植体再生成更壮实、生命力强和可育的 植株。而且，种子切块易于操作，全年都能大量供应。另外，与已
报道的玉米再生方案相比，芽数和愈伤组织再生率明显比以前报道 的高。特别是通过器官发生途径直接从种子切块再生出的丛生芽数达到28个芽/外植体。最明显的是，从最初将收获后42天的种子制 成外植体到培育出可育植株的时间被縮短至4个月。以上切割要暴露出来自盾片、胚芽鞘环和芽尖分生组织的三个 未分化细胞源。来自盾片、胚芽鞘环和芽尖分生组织的细胞均适于 目的基因的遗传转化。可以同时将这些细胞都制成感受态以提高再 生和/或增强DNA的转移能力。所以本发明还提供向玉米体外转化目 的基因的方法。该玉米可以是近交细胞系或杂交细胞系。玉米的体外转化法本发明的一个实施例提供了一种玉米的体外转化方法。该方法 包括用抗菌皂洗涤成熟干燥的种子，然后用70%乙醇对种子进行表面 消毒，接着用0. 1%的氯化汞(HgCl2)浸泡7分钟。在将种子切开前， 最好将种子接种到"切前愈伤组织启动培养基"(包括LS基本盐和 一种植物生长素，如一般称为"2，4-D"的二氯苯氧乙酸)上培养48 小时或"切前芽启动培养基"(包括MS基本盐和一种细胞分裂素， 如一般称为"BAP"的6-苄氨基嘌呤)上培养3-4天让其萌发，这两 种培养基也是本发明的实施例，以下会有详述。选择哪种培养基取 决于是想要丛生芽(使用"切前芽启动培养基")还是想要愈伤组 织(使用"切前愈伤组织启动培养基")。玉米种子在"切前愈伤组织启动培养基"或"切前芽启动培养 基"中萌发后，用解剖刀将其纵向切成两半(大致对称)，暴露出盾 片、胚芽鞘环和芽尖分生组织。暴露在外的盾片、胚芽鞘环和芽尖 分生组织的细胞适于目的基因转化。目的基因最好具有例如但不限于抗寒、抗旱、抗除草剂、抗虫、 抗真菌或枯萎延迟等所需特性。例如，可以将从Asc力a/ pj'a 紐ar"ca或co^朋z^i/s 中分离的编码CBF基因(低温
结合因子，"cold binding factor")或抗寒基因的DNA转化玉米， 得到抗寒、抗旱的玉米株。其他目的基因包括但不限于抗真菌的渗 透蛋白(osmotin)基因、抗广谱细菌和真菌的SGT-l基因和抗传染 性法氏囊病的VP-2基因。另外，还可以使用编码人目的蛋白的基因 进行转化例如，可以使用治疗II型糖尿病的GAD65基因转化植物。任何适于遗传转化的方法均可用来转化暴露在外的盾片、胚芽 鞘环和芽尖分生组织。已知的适于转化的方法包括但不限于电穿孔 法、粒子轰击法、须介导转化法和农杆菌介导转化法。当选用农杆菌介导转化法时，玉米种子切开后，暴露在外的要 被转化的组织(盾片、胚芽鞘环和芽尖分生组织)受到损伤。然后 用本领域技术人员已知的方法进行农杆菌介导的转化。转化后，将 被转化的种子切块外植体置于"种子切块外植体-愈伤组织共培养 基"或"种子切块外植体-芽共培养基"上培养，这两种培养基也是 本发明的实施例，以下会有详述。如果要让种子切块外植体产生愈伤组织，就使用"种子切块外 植体-愈伤组织共培养基"。优选的"种子切块外植体-愈伤组织共 培养基"包括添加了Bs维生素、3mg/l 2，4-D、 200/xM乙酰丁香酮、 300 mg/1 L-半胱氨酸的LS培养基。该共培养基的pH值调为5. 3， 12rC灭菌20分钟。将转化后的种子切块外植体置于"种子切块外 植体-愈伤组织共培养基"上最好25。C暗温育3天。如果要让种子切块外植体生芽，就使用"种子切块外植体-芽共 培养基"。优选的"种子切块外植体-芽共培养基"包括添加了 B5 维生素、2mg/1细胞分裂素、4mg/1 BAP、 200/xM乙酰丁香酮和300 mg/1 半胱氨酸的MS培养基。该共培养基的pH值调为5. 3， 12rC灭菌20 分钟。将转化后的种子切块外植体置于"种子切块外植体-芽共培养 基"上最好25。C暗温育3天。本发明实施例中也可使用其他已知的 共培养基。
温育三到四天后，将被转化的种子切块外植体转入"种子切块 外植体愈伤组织诱导培养基"(诱导愈伤组织形成)或"种子切块 外植体芽诱导培养基"(诱导芽形成)，该两种培养基是本发明的实 施例，下面会有详述。当选用基因枪法转化时，将种子切块外植体放在所需组织(盾 片、胚芽鞘环和芽尖分生组织)易受粒子轰击的位置。转化完后， 将种子切块外植体转移到本发明的"种子切块外植体愈伤组织诱导 培养基"上，使愈伤组织形成。无论采用何种转化法，操作本发明实施例都可以通过器官发 生、体细胞胚发生或直接诱导丛生芽的途径从种子切块再生出植 株。操作本发明实施例可以在很短时间内产生大量芽(即每个种子 切块外植体大约产生28个芽)，可以在很短的可控时间内完成多次 转化。这样，因为未分化细胞经重新编程后分化成体细胞胚，所以 使用从种子切块基于愈伤组织得到的体细胞胚对任何转化方法都非 常有效。种子切块外植体经胚性愈伤组织/体细胞胚离体生出玉米芽的 体外方法本发明的另一实施例提供了一种从种子切块外植体离体生出玉 米芽的方法。如上所述，将玉米种子接种到"切前愈伤组织启动培 养基"上萌发、准备并按上述方法切开后(包括根据需要进行目的 基因转化)，置于"种子切块愈伤组织诱导培养基"上，该培养基是 本发明的实施例，下面会有详述。种子切块外植体置于"种子切块愈伤组织诱导培养基"上27。C暗培养约一周后启动形成初期愈伤组 织。然后每隔两周将初期愈伤组织转入新鲜的"初期愈伤组织保持 培养基"中，共培养约2-4周，该培养基也是本发明的实施例，下 面会有详述。大约1个月后，初期愈伤组织变成可增殖愈伤组织。
接着将可增殖愈伤组织置于"胚性愈伤组织诱导培养基"中培养 (本发明的实施例，下面会有详述)，以形成胚性愈伤组织和体细胞胚。可增殖愈伤组织在"胚性愈伤组织诱导培养基"上27'C暗温育 约4天后成为具有体细胞胚的胚性愈伤组织。再将胚性愈伤组织/体细胞胚转入"愈伤组织/体细胞胚芽诱导 培养基"中(本发明的实施例，下面会有详述)，使其生芽。27°C、 16小时柔和白光培养。通过计算生芽的胚性愈伤组织数和每个愈伤 组织的生芽数确定芽的再生率。见图7。接着将再生芽转入本领域己知的生根培养基中，该生根培养基 包括但不限于添加了 0.8mg/l 1-萘乙酸("NAA")的MS盐。种子切块外植体离体生出玉米芽的方法本发明的另一实施例提供了一种离体生出玉米芽的方法，该方 法不包括形成愈伤组织。按上述方法让玉米种子置于"切前芽启动 培养基"中萌发后制备种子切块外植体。可以向种子切块外植体转 化目的基因，然后转入"种子切块芽诱导培养基"中温育形成再生 芽。该培养基是本发明的一个实施例，下面会有详述。将种子切块 外植体置于"种子切块芽诱导培养基"中27"C、 16小时柔和白光照 射培养使其生芽。大约3-4周后生芽。离体培育出玉米生根幼苗的方法本发明的另一实施例提供了离体培育出玉米生根幼苗的方法。 如上所述种子切块外植体生芽后(通过直接诱导生芽或诱导愈伤组 织生芽途径)，让芽生长约3-4周。然后将玉米芽置于芽伸长培养基 中让其伸长。芽伸长培养基是本领域已知的培养基，包括但不限于 添加了 Bs维生素的MS基本培养基。将伸长的芽置于本领域己知的生 根培养基，让其形成根和生根幼苗，该培养基例如包括但不限于含 MS盐和1-萘乙酸("NAA")的生根培养基。NAA的浓度约为 0.5mg/l-2.0mgA。该浓度优选为约0. 8mg/1。将生根幼苗移植到土
壤中，置于生长室中，在27°C、 16小时柔和白光照射、67%湿度条件下培育1周，最后移入温室。
除本发明上述实施例外，本发明还提供上述方法中所用的各种培养基。切前愈伤组织启动培养基
本发明提供一种"切前愈伤组织启动培养基"。本发明一实施 例中，在将玉米种子切成两半得到种子切块外植体之前，优选为将种子浸泡在"切前愈合组织启动培养基"中约48小时，以"启动" 种子在随后从该"被启动"种子得到的种子切块外植体被置于"种 子切块愈伤组织诱导培养基"(也是本发明的一个实施例)上培育 时，形成愈伤组织。制备种子切割外植体之前，让玉米种子在"切 前愈伤组织启动培养基"上萌发，与未经萌发处理相比，其愈伤组 织的诱导率增加(种子切块外植体上产生的愈伤组织数)。
"切前愈合组织启动培养基"包括LS基本盐和浓度约 1.0-3.5mg/l的一种植物生长素或植物生长素混合物。植物生长素或 其混合物的浓度优选为1.5-3.5mg/l，最优选为3.0 mg/l。在一优 选实施例中，植物生长素是2，4-D，浓度为3.0mg/1。 切前芽启动培养基本发明提供一种"切前愈伤组织启动培养基"。本发明一实施 例中，在将玉米种子切成两半得到种子切块外植体之前，优选为将 种子浸泡在"切前芽启动培养基"中约3-4天，以"启动"种子在 随后从该"被启动"种子得到的种子切块外植体被置于"种子切块 愈伤组织诱导培养基"(也是本发明的一个实施例)上培育时，生 出芽。制备种子切割外植体之前，让玉米种子在"切前芽启动培养 基"上萌发，与未经萌发处理相比，其生芽数增加。
"切前芽启动培养基"包括MS基本盐和浓度约0. 5-3. Omg/1的 一种植物生长素或植物生长素混合物。 一种植物生长素或植物生长 素混合物的浓度优选为1.0-2. 5mg/1，最优选为2.0mg/1。在一优选 实施例中，植物生长素是2,4-D，浓度为2.0mg/1。 种子切块愈伤组织诱导培养基本发明的一个实施例提供一种"种子切块愈伤组织诱导培养 基"。置于"愈伤组织诱导培养基"上的种子切块外植体在27'C暗 温育时将启动愈伤组织形成，并产生初期愈伤组织。愈伤组织诱导 培养基包括LS基本盐(见Linsmaier和Skoog， 1965)和B5维生素 (见Garaborg等1968X优选为900mg/l的L-脯氨酸、优选为1呢/1 的甘氨酸、优选为250ing/l的水解酪蛋白、优选为30g/l的蔗糖及 一种植物生长素或植物生长素混合物。该植物生长素或植物生长素 混合物的浓度可以是1.0-7.0mg/l。该植物生长素浓度优选为 1.0-4.0mg/l，更优选为1.0-3. 5 mg/l，最优选为约3. Omg/1 。在优 选实施例中， 一种植物生长素包括2， 4-D，浓度约为3.0mg/1。2，4-D的浓度变化影响愈伤组织诱导百分比，见图2。所以术语 "大约"表示该浓度不一定是所提及的精确浓度，而是可以变化的 浓度，只要该浓度得到所需愈伤组织诱导百分比即可。愈伤组织诱 导培养基中可以加8.0g/l琼脂使其固化。加琼脂前先将pH值调到 5.8，然后12rC灭菌20分钟。在2，4-D浓度作用下愈伤组织诱导率为32%-95.5%,见图2。在 愈伤组织增殖培养基上温育7天后，记录愈伤组织的诱导率。通过 记录形成愈伤组织的种子切块数来计算愈伤组织的诱导率。图2中 记录结果显示了在2，4-D浓度为l-7mg/1时可诱导愈伤组织形成。 随着2， 4-D浓度增到3. 0 mg/1，诱导出愈伤组织的外植体数也随之 增力Po在不含2， 4-D时，B73和R23近交系可以诱导出少量愈伤组会凡 图2还显示随着2， 4-D浓度增加到6. 0 mg/1以上，愈伤组织诱导百 分比开始下降。随着2,4-D浓度增加，外植体表面开始发黑，愈伤 组织停止生长，在高于4.0mg/l时开始死亡。这说明2，4-D浓度较
高可导致变异，乃至体细胞死亡(Choi等，2001; Vasil和Vasil， 1985)。图2还显示即使2,4-D浓度相同，不同玉米自交和杂交系中愈 伤组织诱导百分比也会产生微小变化。 初期愈伤组织保持培养基本发明的另一实施例提供一种"初期愈伤组织保持培养基"。 在种子切块外植体上形成初期愈伤组织，并让其生长约1周后，将 其置于"初期愈伤组织保持培养基"上温育以形成可增殖愈伤组 织。"愈伤组织维持培养基"包括LS基本盐、Bs维生素并添加了一 种约0. 5-2. 5mg/1的植物生长素或植物生长素混合物。在优选实施 例中，该植物生长素是2， 4-D，浓度优选为1.0-2. 0mg/1 。胚性愈伤组织诱导培养基本发明的另一实施例提供一种"胚性愈伤组织诱导培养基"， 其包括LS基本盐、Bs维生素并添加了一种植物生长素或植物生长素 混合物和一种细胞分裂素或细胞分裂素混合物。在优选实施例中， 植物生长素是2，4-D，细胞分裂素是苄氨基嘌呤("BAP")。将可增 殖愈伤组织置于"胚性愈伤组织诱导培养基"上暗培养后形成胚性 愈伤组织和体细胞胚。优选的"胚性愈伤组织诱导培养基"包括约 0. lmg/1的植物生长素和约0. 5mg/1的细胞分裂素。优选的"胚性愈 伤组织诱导培养基"进一步包括优选为900mg/l的L-脯氨酸、优选 为1. Omg/1的甘氨酸、优选为250mg/l的水解酪蛋白和优选为30g/l 的蔗糖。在一优选实施例中，"胚性愈伤组织诱导培养基"包括 0. lmg/1 2, 4-D和0. 5mg/1 BAP。愈伤组织/体细胞胚-芽诱导培养基本发明的另一实施例提供一种"愈伤组织/体细胞胚-芽诱导培 养基"。将从种子切块外植体培养产生的胚性愈伤组织/体细胞胚置 于"愈伤组织/体细胞胚-芽诱导培养基"中，在27'C、 16小时柔和 白光照射条件下温育，胚性愈伤组织/体细胞胚至少生出一个芽。"愈伤组织/体细胞胚-芽诱导培养基"包括MS基本盐、Bs维生素并添加了一种细胞分裂素或细胞分裂素混合物。细胞分裂素优选为BAP。细胞分裂素浓度优选为0. 1-2. 0mg/1。其浓度优选为0. 5_2. 5 mg/1，最优选为0.75-1.0mg/l。在一优选实施例中，细胞分裂素是 BAP，浓度优选为1.0 mg/1。"愈伤组织/体细胞胚-芽诱导培养基"进一步包括优选为1.0 rag/1的甘氨酸、优选为400mg/l的水解酪蛋白和优选为30g/l的蔗 糖。芽诱导培养基中可加8.0g/l琼脂使其固化。加琼脂前先将pH 值调到5.8，然后12rC灭菌20分钟。 种子切块外植体-芽诱导培养基本发明的另一实施例提供一种"种子切块外植体-芽诱导培养 基"。将种子切块外植体置于"种子切块外植体-芽诱导培养基" 中，在27t:、 16小时柔和白光照射条件下温育，种子切块外植体至 少生出一个芽。"种子切块外植体-芽诱导培养基"包括MS基本盐、 B5维生素并添加有一种细胞分裂素或细胞分裂素混合物。细胞分裂 素优选为BAP。其浓度可为1.0-6.0 mg/l，优选为1.0-5.0 mg/l， 更优选为1.5-4.5 mg/l。在一优选实施例中，细胞分裂素是BAP， 浓度为3.0-4. Omg/l。在另一优选实施例中，BAP的浓度优选为4.0 mg/l。"种子切块外植体-芽诱导培养基"进一步包括优选为 1.0mg/l的甘氨酸、优选为400mg/l的水解酪蛋白和优选为30g/l 的蔗糖。"种子切块外植体-芽诱导培养基"中可加8.0g/l琼脂使 其固化。加琼脂前先将pH值调到5.8，然后12rC灭菌20分钟。在另一实施例中，"种子切块外植体-芽诱导培养基"进一步包 括6-糠氨基嘌呤("激动素")。虽然含有BAP的"种子切块外植体 -芽诱导培养基"上可以生出丛生芽，但加入激动素能增加诱导芽的 数量。激动素的优选浓度为约0.5-4.5 mg/l。激动素的浓度优选为
约1.5-3.5 mg/l，更优选为1.75-2.5 mg/l。激动素的优选浓度为 2.0mg/l。在一优选实施例中，"种子切块外植体-芽诱导培养基" 包括4. 0 mg/1 BAP和2. 0 mg/1激动素。通过器官发生途径生出丛生芽的种子切块具有基因型依赖性。 单独加入BAP可诱导出丛生芽(图8)，但和激动素结合使用所生出 的芽数增多。添加了各种组合和浓度的BAP和激动素的培养基都诱 导出丛生芽(图3G和H，图4)。所试验的所有基因型都有良好应答 的最佳浓度为BAP 4. 0 mg/1和激动素2. 0 mg/l。每个外植体生出的 最大丛生芽数将近28-30个。可以将再生的芽分离出来移到生根培 养基中，然后再移栽到土壤中(图3I和J)。外植体的选取期、光源和用含2，4-D等植物生长素的"切前芽 启动培养基"对种子进行的外植体预处理是影响丛生芽形成的必要 因素(数据未显示)。与6天或6天以上的外植体相比，3-4天的种 子切块外植体对形成丛生芽更有效，与前者相比其形成的丛生芽数 最多。用含2，4-D等植物生长素的"切前芽启动培养基"对种子进 行预处理对丛生芽形成效果显著。当不用"切前芽启动培养基"对 外植体进行预处理时，仅有少量外植体生出丛生芽，而绝大多数仅 仅是萌发。许多玉米相关报道表明，暗培养可诱导产生丛生芽(Zhong 等，1992a; Lowe等，1995)。但是，在本发明的方法中，光照是诱 导产生从生芽的必要因素。在27。C、 16小时柔和白光照射条件下温 育外植体所得到的芽数最多。实施例例1:制备种子并用"启动培养基"预处理用抗菌皂洗涤成熟、干燥的种子，然后用70%乙醇对种子进行表 面消毒，接着用O. 1%的氯化汞(HgCl2)浸泡7分钟。若用于愈伤组 织诱导，用无菌水将种子漂洗多次，然后在含LS (Linsmaier和 Skoog， 1965)液体培养基且添加了 3mg/1 2， 4-D的"切前愈伤组织
启动培养基"中浸泡48小时。若用于芽诱导，先用无菌水浸泡种子24小时，然后置于含MS (Murashige和Skoog， 1962)基本盐且添加了 2mg/1 2, 4-D的"切 前芽启动培养基"上3-4天让其萌发。例2:愈伤组织形成和保持一周后将种子切块外植体表面形成的白色柔软的愈伤组织移到 "初期愈伤组织保持培养基"上继续生长(图3B)。培养四天后观察 到种子切块上诱导出愈伤组织。培养1个月后，将大量增殖的愈伤 组织(图3C)转入含0. lmg/1 2， 4-D和0. 5mg/1 BAP的"胚性愈伤 组织诱导培养基"中以保持胚性愈伤组织(图3D)。每两周继代培养一次。继代培养之后，有趣的是观察到两种愈伤组织胚性愈伤组 织和有器官发生能力的愈伤组织(organogenic callus)。从胚性愈伤组织上观察到有组织结构的体细胞胚(organized somatic embryos)(图3D、 E和F，图6)。从有器官发生能力的愈伤组织上 还可观察到不定芽(图犯)。愈伤组织继续在"愈伤组织/体细胞胚-芽诱导培养基"上继代培养，该培养基是添加了各种浓度BAP的改 动MS培养基。每个胚性愈伤组织再生出2-11个芽。在长达两个月 的期间，含l.O mg/1 BAP的培养基上长出的芽数最多。 例3:从生芽形成和幼苗产生萌发后的成熟种子(萌发3-4天)纵向切成两半得到种子切块 外植体。在27t:、 16小时柔和白光照射条件下，将种子切块外植体 置于"种子切块外植体-芽诱导培养基"上温育让其生芽。3-4周后 从种子切块外植体上取下芽，置于含MS基本盐和Bs维生素的芽伸长 培养基上温育。再将伸长芽置于含MS基本盐且添加了 0.8ml/l NAA (l-萘乙酸)的生根培养基上，让生根幼苗形成。将生根幼苗移植 到土壤中，置于生长室内，在27。C、 16小时柔和白光照射和67%湿 度下培养1周，最后移到温室内。
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权利要求
1. 一种适于转化的玉米外植体，该外植体包括纵向切成两半的 玉米种子，其中切开后的种子暴露出盾片、胚芽鞘环和芽尖分生组 织，并且该盾片、胚芽鞘环和芽尖分生组织均能独立用于转化。
2. 根据权利要求1所述的玉米外植体，其中该玉米种子选自近交细胞系或杂交细胞系。
3. 根据权利要求1所述的玉米外植体，其中在将玉米种子纵切 成两半前，先让玉米种子在含有LS基本盐和2， 4-D的切前愈伤组织 启动培养基或含有MS基本盐和2， 4-D的切前芽启动培养基上萌发。
4. 一种用目的基因体外转化玉米的方法，该方法包括将玉米种 子纵向切成两半得到玉米种子切块外植体，其中，切开后的种子暴 露出盾片、胚芽鞘环和芽尖分生组织，并且该盾片、胚芽鞘环和芽 尖分生组织均能独立用于目的基因的遗传转化，然后用目的基因转 化该盾片、胚芽鞘环或芽尖分生组织。
5. 根据权利要求4所述的方法其中该目的基因具有选自抗泉 抗旱、抗除草剂、抗真菌、抗虫和枯萎延迟的所需特性。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中该所需特性是抗寒。
7. 根据权利要求5所述的方法，其中该目的基因编码CBF。
8. 根据权利要求4所述的方法，其中该转化按照选自电穿孔、 粒子轰击、须介导转化和农杆菌介导转化的方法进行。
9. 根据权利要求4所述的方法，其中在切开玉米种子前，先让 玉米种子在含有LS基本盐和2， 4-D的切前愈伤组织启动培养基或含 有MS基本盐和2， 4-D的切前芽启动培养基上萌发。
10. —种离体生出至少一个玉米芽的方法，该方法包括a)让种子在含有LS基本盐和2，4-D的切前愈伤组织启动培养 基上萌发； b) 将萌发后的玉米种子纵向切成两半得到玉米种子切块外植体；c) 将种子切块外植体置于含LS基本盐、Bs维生素和2，4-D的 种子切块愈伤组织诱导培养基上温育以形成初期愈伤组织；d) 将初期愈伤组织置于含LS基本盐、Bs维生素和2，4-D的初 期愈伤组织保持培养基上温育以形成可增殖愈伤组织；e) 将可增殖愈伤组织置于含LS基本盐、Bs维生素、2，4-D和 BAP的胚性愈伤组织诱导培养基上温育以形成胚性愈伤组织；f) 将胚性愈伤组织置于含MS基本盐和BAP的愈伤组织/体细胞 胚芽诱导培养基上温育以生出至少一个芽。
11. 一种离体生出玉米芽的方法，该方法包括a) 让种子在含有MS基本盐和2，4-D的切前芽启动培养基上萌发；b) 将萌发后的玉米种子纵向切成两半得到玉米种子切块外植体；c) 将种子切块外植体置于含MS基本盐和BAP的种子切块外植 体芽诱导培养基上温育以生出至少一个玉米芽。
12. 根据权利要求ll所述的方法，其中种子切块外植体芽诱导 培养基进一步包括6-糠氨基嘌呤。
13. —种离体培育出玉米生根幼苗的方法，该方法包括a) 将权利要求10、 11或12中生出的至少一个玉米芽置于含MS 基本盐和Bs维生素的芽伸长培养基上，让至少一个玉米芽伸长；并 且b) 将伸长芽置于含MS基本盐和l-萘乙酸的生根培养基上生根 以形成生根幼苗。
14. 一种在玉米种子被切成两半得到种子切块外植体前使玉米 种子萌发的切前愈伤组织启动培养基，该培养基包括LS基本盐和一 种植物生长素或植物生长素混合物，其中该植物生长素或其混合物的浓度为1.5-3.5mg/l，让上述玉米种子在上述培养基上萌发，与未 在切前愈伤组织启动培养基上萌发相比，其种子切块外植体的愈伤 组织诱导率增加。
15. 根据权利要求14所述的切前愈伤组织启动培养基，其中植 物生长素是2，4-D，浓度为3.0mg/1。
16. —种在玉米种子被切成两半得到种子切块外植体前使玉米 种子萌发的切前芽启动培养基，该培养基包括MS基本盐和一种植物 生长素或植物生长素混合物，其中该植物生长素或其混合物的浓度 为1.0-3. 5mg/1，让上述玉米种子在上述培养基上萌发，与未在切前 芽启动培养基上萌发相比，其种子切块外植体的芽诱导率增加。
17. 根据权利要求16所述的切前芽启动培养基，其中植物生长 素是2，4-D，浓度为2.0mg/1。
18. —种包含LS基本盐、Bs维生素和1. 0-3. 5mg/1 2， 4-D的种 子切块愈伤组织诱导培养基，其中种子切块外植体在该种子切块愈 伤组织诱导培养基上暗温育后产生愈伤组织。
19. 根据权利要求18所述的种子切块愈伤组织诱导培养基，其 中2,4-D的浓度为3. Omg/L
20. 一种包含LS基本盐、Bs维生素和O. 5-2. 5mg/1 2， 4-D的初 期愈伤组织保持培养基，其中初期愈伤组织在该初期愈伤组织保持 培养基上暗温育后变成可增殖愈伤组织。
21. 一种包含LS基本盐、Bs维生素、0. lmg/1 2， 4-D和0. 5mg/1 BAP的胚性愈伤组织诱导培养基其中从玉米种子切块外植体上产生 的可增殖愈伤组织在该胚性愈伤组织诱导培养基上暗温育后变成胚 性愈伤组织。
22. —种包含MS基本盐、Bs维生素、1. Omg/1 BAP的愈伤组织/ 体细胞胚-芽诱导培养基，其中体细胞胚在该愈伤组织/体细胞胚-芽 诱导培养基上温育后生出至少一个芽。
23. —种包含MS基本盐、B5维生素、2. 0-5. Omg/1 BAP的种子 切块外植体芽诱导培养基，其中种子切块外植体在该芽诱导培养基 上温育后生出至少一个芽。
24. 根据权利要求23所述的芽诱导培养基，其进一步包括浓度 约为1. 75-2. 5 mg/1的6-糠氨基嘌呤。
25. 根据权利要求24所述的芽诱导培养基，其中6-糠氨基嘌呤 浓度为2.0 mg/1， BAP浓度为4.0 mg/1。
全文摘要
本发明公开了一种适于转化的玉米外植体，该外植体包括纵向切成两半的玉米种子，其中切开后的种子暴露出盾片、胚芽鞘环和芽尖分生组织，并且该盾片、胚芽鞘环和芽尖分生组织均能独立用于转化。
文档编号A01H5/00GK101123868SQ200580026844
公开日2008年2月13日 申请日期2005年6月9日 优先权日2004年6月10日
发明者D·阿拉贝德, S·L·戈德曼, S·V·鲁得拉哈特拉 申请人:托莱多大学