用杀虫剂处理转基因玉米种子的制作方法

专利名称：用杀虫剂处理转基因玉米种子的制作方法
相关专利和专利申请的交叉参考本申请是在2000年10月6日提交的第60/238,406号美国临时专利申请的非临时部分，并要求该临时申请的优先权。
(2)相关技术的描述据估计，每年在美国有15％的农作物受到昆虫和相关节肢动物的破坏，在发展中国家甚至更高。此外，竞争性杂草和寄生以及腐生植物甚至更有可能导致产量损失。
当在播种后植物病原体、昆虫和其它这样的土壤携带的害虫破坏种子时，某些损害是在土壤中发生的。在玉米生产中，其余损害大部分是由食虫一噬食或破坏植物根部的昆虫类害虫；和切根虫、欧洲玉米钻孔虫和噬食或破坏植物地上部分的其它害虫引起的。关于害虫破坏农作物的类型和机制的一般性描述可参见例如Metcalf，Destructive and Useful Insects，(1962)；和Agrios，PlantPathology，3rd Ed.，Academic Press(1988)。
玉米是美国中西部最重要的谷类农作物。在该地区中最严重的玉米昆虫类害虫是三种条叶甲属(Diabrotica)甲虫的幼虫形式。这些害虫包括西部玉米食虫-玉米幼芽根叶甲(Diabrotica vergiferavergifera LeConte)，北部玉米食虫-Diabrotica berberi Smith和Diabrotica berberi Lawrence，和南部玉米食虫-十一星瓜叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)。事实上，在美国，用于控制玉米食虫的杀昆虫剂(insecticide)比用于任何其它玉米害虫的杀昆虫剂要多，并且处理的总英亩数大于任何其它害虫。
玉米食虫(CRW)在其中玉米在之前的季节生长的田地中在卵阶段过冬。它们的卵在从五月末到六月的期间孵化。如果在接下来的一年中没有继续种植玉米农作物，幼虫将死亡。因此，玉米食虫的影响直接作用于其中系统地连续种植玉米的区域中，美国中西部的许多地区是这种情况。
孵化后，幼虫经过三个幼虫阶段或龄期，期间它们噬食玉米根部系统。幼虫阶段的完成需要约三周。由幼虫噬食所引起的对玉米根部系统的破坏是由于玉米食虫造成的收获损失的主要原因。在大部分根部系统被削弱或破坏后玉米植物倒下并倒伏在田地中是其损失的主要原因，因为倒伏的玉米不能通过常规机械化机器收割并遗留在田地中。
幼虫发育完成后，幼虫转化成不能动的蛹，并由其转化成在整个夏季从土壤中出现的成熟甲虫，其中出现的时间取决于生长的位置。出现后，成熟的甲虫吃食约两周，然后雌性甲虫开始产卵。开始时成虫主要在其出现的同一田地中吃食，但是后来它们迁移到其它田地。顶峰成虫活动通常于七月末或八月初发生在美国玉米地带的连续种植玉米的田地中，但是成虫活动可以在第一年末或晚熟的玉米田中达到顶峰。出现约两周后，食虫甲虫开始在玉米田中产卵(关于更多的信息参见例如Corn Rootworms，Field Crops Pest Management Circular#16，0hio Pest Management & Survey Program，The Ohio StateUniversity，Extension Division，Columbus，OH.；可在www.ag.ohio-state.edu/～obioline/icm-fact/fc-16.html上在线获得，Sep.13，2000；和McGahen等人，Corn Insect ControlCornRootworm，PENpages number 08801502，Factsheet available fromPennsylvania State University，State College，PA，1989)。
目前在连续种植玉米的常规农业实践中，通常施用杀昆虫剂来保护玉米根部系统不被食虫幼虫严重噬食。常规惯例是治疗成熟的甲虫或治疗幼虫。对于成熟的甲虫，常规治疗制剂的实例包括施用甲萘威杀昆虫剂(例如以1.0-2.0Ibs活性/英亩施用SEVIN80S，)；杀灭菊酯或高氰戊菊酯(例如以0.1-0.2Ibs活性/英亩施用PYDRIN2.4EC，或以0.03-0.05Ibs活性/英亩施用ASANA0.66EC)；马拉松(以0.9Ibs活性/英亩施用57％E)；氯菊酯(例如以0.1-0.2Ibs活性/英亩施用AMBUSH2.0EC，或以0.1-0.2Ibs活性组分/英亩施用POUNCE)；或以0.25-0.5Ibs活性/英亩施用PENNCAP-M。
为了治疗CRW幼虫，常规惯例是在播种时或播种后，但是尽可能在接近卵孵化时施用土壤杀昆虫剂。常规治疗包括呋喃丹杀昆虫剂(例如以8oz/1000ft行施用的FURADAN15G)；毒死蜱(例如以8oz/1000ft行施用的LORSBAN15G)；地虫磷(例如以4.5-6.0oz/1000ft行施用的DYFONATE20G)；甲拌磷(例如以6oz/1000ft行施用的THIMET20G)；特丁磷(例如以8oz/1000ft行施用的COUNTER15G)；或七氟菊酯(例如以4-5oz/1000ft行施用的FORCE3G)。
已知上面列出的许多化学杀虫剂通常对人和动物有害。这些杀虫剂引起的环境危害经常由于通过叶喷雾来施用杀虫剂或者将杀虫剂直接施用到土壤表面上这样的操作而加剧。风漂流、沥滤和径流可导致一大部分杀虫剂从所需的活动地带迁移到表面水内，并与鸟类、动物和人直接接触。
由于担心化学杀虫剂对公众健康和环境有影响，人们已经付出了很大努力来减小化学杀虫剂的用量。最近，大部分努力是花费在开发能表达源自微生物的昆虫毒素的转基因农作物上。例如，Estruch等人的U.S.专利5,877,012公开了将蛋白从微生物例如杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、Clavibacter和根瘤菌属(Rhizobium)克隆和表达到植物中以获得抗这些害虫例如黑切根虫、粘虫、几种钻孔虫和其它昆虫类害虫的转基因植物。Privalle等人的出版物WO/EP97/07089描述了用编码过氧化物酶的重组DNA序列转化单子叶植物例如玉米，用于保护植物不被玉米钻孔虫、螟蛉和切根虫噬食。Jansens等人在Crop Sci.，37(5)1616-1624(1997)中报道了含有编码控制欧洲玉米钻孔虫生殖的结晶蛋白的得自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的基因的转基因玉米的生产。Koziel等人的U.S.专利5,625,136和5,859,336报道了用得自苏云金芽孢杆菌的编码δ-内毒素的基因转化玉米得到了具有改善的抗欧洲玉米钻孔虫能力的转基因玉米。Armstrong等人在Crop Science，35(2)550-557(1995)中提供了关于表达源自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白的转基因玉米的大田试验的综述性报道。
已知野生型Btδ-内毒素具有抗鞘翅类昆虫的低活性，并且Kreig等人报道了首次分离出鞘翅类昆虫毒性苏云金芽孢杆菌菌株(参见U.S.专利4,766,203)。U.S.专利4,797,279和4,910,016也公开了产生具有某些鞘翅类昆虫活性的蛋白的野生型和杂交的苏云金芽孢杆菌菌株。然而最近，更精确的基因工程方法已表明有希望开发这样的修饰的苏云金芽孢杆菌蛋白，它们的玉米食虫活性大大高于由野生型菌株产生的蛋白(参见例如Ecogen，Inc.和Monsanto Company的WO99/31248)。
然而，不知道任何单独的转基因事件是否足以在致力于连续种植玉米的重感染田地有效地保护玉米不被玉米食虫破坏。事实上，从长远来看通过任一种转基因事件来防治玉米食虫可能不理想，因为有可能产生耐受性目标害虫变种。
常规形式的杀虫剂施用的另一替代选择是用杀虫剂处理植物种子。使用杀真菌剂来保护种子在种植后不被破坏以及使用低水平的杀昆虫剂来保护例如玉米种子不被金针虫破坏已经使用了一段时间。用杀虫剂处理种子的优点是给种子提供了保护作用，同时将杀虫剂的必需量减至最小和限制必需的与杀虫剂的接触量以及不同的田地使用次数。
通过将杀昆虫剂直接施用到植物种子上来防治害虫的其它实例描述在例如U.S.专利5,696,144中，该专利公开了下述内容与从未处理的种子生长出的对照植物相比，欧洲玉米钻孔虫对从用1-芳基吡唑化合物以500克/公担种子的比例处理过的种子生长出的玉米的噬食破坏较小。此外，Turnblad等人的U.S.专利5,876,739(及其母专利U.S.专利5,849,320)公开了一种防治土壤携带的昆虫的方法，包括用含有一种或多种聚合粘合剂与杀昆虫剂的包衣处理种子。该参考文件提供了其认为是用于该包衣的候选化合物的一览杀昆虫剂，并且还列举了多种可能的目标昆虫。然而，虽然U.S.专利5,876,739声称用包含特定杀昆虫剂的包衣处理玉米种子能保护玉米根部不被玉米食虫损害，但是其没有指出或建议这样的处理可用于具有转基因事件的种子。
用硝基亚氨基或硝基胍基化合物杀虫剂处理具有转基因事件的种子已经提到过(参见例如WO99/35913)，然而，没有发现关于这样的治疗的可能应用或效力的任何指导，或如何让这样的治疗可能起作用-例如每单位数量的种子所必需的活性组分的量-的详细描述，并且没有提供任何能够给出理由让人们相信所提出的治疗将实际提供适当保护的实施例。
因此，虽然最近在植物基因工程方面的进展已提高了不用使用化学杀虫剂来保护植物不被害虫破坏的能力，并且虽然象用杀虫剂处理种子一样，这样的技术已经减轻了杀虫剂对环境的有害作用，但是仍然有很多问题限制了在实际田地条件下成功使用这些方法。因此，提供保护植物，尤其是玉米植物不被害虫噬食破坏的改进方法将是有用的。如果这样的方法能减少常规化学杀虫剂的必需施用比例，并且如果其还能限制农作物种植和耕作所需的单独田间操作的次数，将是特别有用的。
本发明还涉及新的转基因玉米植物种子，所述种子给所生长出的玉米植物提供了增强的抗一种或多种害虫噬食性破坏的抵抗性，其中所述种子包含具有抗一种或多种害虫当中至少一种的活性的转基因事件，并且所述种子已经用有效量的杀虫剂处理过。
本发明还涉及已通过本发明方法处理的新的转基因玉米种子。
因此，在由本发明实现的几个优点中，可注意的有提供了保护植物、尤其是玉米植物不被害虫噬食性破坏的改进方法；提供了能减少常规化学杀虫剂的必需施用比例的方法；和提供了限制农作物种植和耕作所必需的单独田间操作的次数的方法。发明详述依据本发明，已经发现，可通过下述方法保护玉米植物抗一种或多种害虫的噬食性破坏，所述方法包括提供包含具有抗至少一种害虫的活性的转基因事件的玉米种子；和用有效量的杀虫剂处理该转基因玉米种子。在优选的本发明实施方案中，已经发现，具有抗玉米食虫的活性的转基因事件与用一些杀虫剂处理种子的组合给进行这种处理的种子提供了意想不到的协同性优点，包括保护所生长出的玉米植物不被玉米食虫破坏的意想不到的优良效力。特别是，已经发现，在保护所生长出的玉米植物抗更严重水平的玉米食虫破坏-已知能减少玉米产量的破坏水平-方面，具有引起CryBb.11231内毒素生成的转基因事件的玉米种子与用吡虫啉处理这样的种子的组合意想不到地优于单独的转基因事件或单独地用吡虫啉处理。
已经进行过基因工程改造以引入编码以表达出具有抗鞘翅类害虫活性的Cry3δ-内毒素的源自苏云金芽孢杆菌的外源基因的玉米植物和种子是已知的，用杀虫剂处理种子(甚至某些转基因种子)的方法也是已知的。然而，直至本发明以前，没有认识到可用一定有效量的一些杀虫剂来处理具有这样的Cry3事件的玉米种子，其结果是这样的组合能有效地、优选意想不到地优良地提高杀虫剂和转基因事件的效力，并且将提供下述其它优点提高使杀虫活性与抗害虫压力相匹配的能力，降低处理和/或施用的成本，提高种子操作的安全性，以及降低转基因事件与杀虫剂任一种或二者对环境的影响。
特别是，已经发现，在优选的实施方案中，用约100克-约400克的一些杀虫剂/l00kg种子处理能够表达一些修饰的Cry3Bb蛋白的转基因玉米种子提供了意想不到的优良的抗玉米食虫的保护作用。此外，据信这样的组合还能有效地保护生长出的玉米植物抗黑切根虫的破坏。还据信本发明种子具有降低杀虫剂使用成本的性质，因为与不使用本发明方法相比，可使用较少量的杀虫剂来获得所需水平的保护。此外，由于使用较少的杀虫剂，并且由于在播种之前施用以及没有单独的田地施用，所以相信本发明方法对于操作者和环境是安全的，并且可能成本低于常规方法。
当提及某些作用是“协同作用”时，其包括在转基因事件与杀虫剂的组合的杀虫活性(效力)方面的组合协同作用。然而，这并不是意味着这样的协同作用限制在杀虫活性上，它们应当还包括意想不到的优点例如活性范围增加、有利的活性特征如破坏的类型和量减少、减少杀虫剂和施用的成本、减少杀虫剂在环境中的分布、减少杀虫剂暴露于生产、操作和播种玉米植物的个人以及本领域技术人员已知的其它优点。
本发明还提供了提高使杀虫活性与抗害虫压力相匹配的能力的优点。这是指这样的能力，设计转基因事件与杀虫剂处理的组合，以在目标害虫对种子或植物的噬食压力达到最大时给种子或所生长出的植物提供有效杀虫活性。例如，当给具有玉米食虫转基因事件的玉米种子施用杀虫剂例如吡虫啉或terfluthrin时，可在设计用于提供杀虫剂缓释的包衣中施用该杀虫剂。可选择释放速度，以使得杀虫剂在玉米的发芽后阶段提供抗其它害虫例如黑切根虫的保护作用，同时转基因事件在植物发育的后期提供对玉米食虫的保护作用-当需要这样的保护作用时。
本文所用术语“杀虫作用”和“杀虫活性”或“活性”是指抗害虫的毒害作用。术语“抗(一种或多种)害虫活性”也具有相同含义。当提及种子或植物“被保护以抗一种或多种害虫的噬食性破坏”时，这是指这样的种子或植物具有这样的特征，该特征具有对一种或多种害虫的直接或间接的作用，这种作用导致与在相同条件下对不具有该特征的植物的噬食性破坏相比，这种或这些害虫对具有该特征的植物的种子、根部、芽和叶子的噬食破坏减轻了。这样的直接或间接作用包括引起害虫死亡，将害虫从植物种子、根部、芽和/或叶子中驱逐出去，抑制害虫对植物种子、根部、芽和/或叶子的噬食，或抑制害虫在种子、根部、芽和/或叶子上产卵，和抑制或预防害虫的繁殖。
术语“杀昆虫活性”与杀虫活性具有相同含义，但是其限于其中害虫是昆虫的情况。除非另有说明，否则当术语“杀虫剂”在本文中使用时，该术语是指在外部提供给种子的杀虫剂，并且其不包括由特定种子或从特定种子生长出的植物产生的活性剂。然而，所用的术语“杀虫活性”和“杀昆虫活性”可以指在外部提供的杀虫剂和/或由种子或植物产生的活性剂的活性。
本发明的一个特征是转基因玉米植物的种子。本文所用术语“转基因玉米植物”是指玉米植物或源自转化的玉米植物细胞或原生质体的其后代，其中植物DNA含有本来在相同株系的天然非转基因植物中不存在的引入的外源DNA分子。
转基因玉米种子是含有编码杀虫蛋白的外源基因的种子。这类杀虫蛋白描述于下列文献中Schnepf等人的Microbiology & MolecularBiology Reviews，62775-806(1998)，以及ffrench-Constant和Bowen的CMSL Cell.Mol.Life Sci.，57828-833(2000)。在一个本发明实施方案中，杀虫蛋白是杀昆虫蛋白。
种子优选含有源自苏云金芽孢杆菌菌株的外源基因，特别是，所述外源基因优选是编码源自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫δ-内毒素的基因。这样的δ-内毒素描述在WO99/31248和U.S.专利6,063,597中，并包括Cry3毒素。编码可用于本发明中的修饰的苏云金芽孢杆菌鞘翅类害虫毒性结晶蛋白的核酸片段描述在U.S.专利6,060,594中，并且包含编码这样的杀昆虫蛋白的核酸序列的抗昆虫转基因植物公开在U.S.专利6,023,013中。本发明δ-内毒素优选包括Cry3B蛋白，甚至更优选地，所述δ-内毒素包括鞘翅类害虫活性Cry3Bb蛋白。Hfte和Whitely在Microbiol.Rev.，53242-255，1989中提出了苏云金芽孢杆菌杀昆虫结晶蛋白的命名原则。该命名原则已经被修正过，并且该修正的命名原则可参见http//epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/index.html。在本文中可使用该修正的命名原则来描述转基因事件特征以及由转基因事件编码的δ-内毒素蛋白。
当术语“转基因事件”在本文中使用时，这样的术语是指上述基因工程改造的DNA，但是还包括由修饰的基因编码的蛋白。因此，在玉米种子或玉米植物中的转基因事件包括表达蛋白的能力。当提及“转基因事件具有抗害虫的活性为时，应当理解，事实上是由基因编码的蛋白具有这样的活性，并且是在当蛋白表达并与害虫接触时实现这样的活性。
WO99/31248和U.S.专利6,063,597描述了对苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因进行基因工程改造以能够表达出修饰的δ-内毒素的方法。修饰的δ-内毒素与野生型蛋白的不同之处在于，与由野生型生物体产生的蛋白相比，它们具有特定的氨基酸取代、加入或缺失。在本文中，通过使用星号(*)或通过用其识别数字描述特定蛋白来表示这样的修饰的δ-内毒素。因此，基因修饰的Cry3δ-内毒素可以用Cry3*表示，其实例包括但不限于Cry3Bb.11230、Cry3Bb.11231、Cry3Bb.11232、Cry3Bb.11233、Cry3Bb.11234、Cry3Bb.11235、Cry3Bb.11236、Cry3Bb.11237、Cry3gb.11238、Cry3Bb.11239、Cry3Bb.11241、Cry3Bb.11242和Cry3Bb.11098。
已发现，在WO99/31248和U.S.专利6,063,597中描述的某些修饰的δ-内毒素具有增强的抗鞘翅类昆虫，特别是抗条叶甲属昆虫，包括玉米食虫的活性。本文所用术语“增强的活性”是指，当在相同条件下测试时，与没有氨基酸修饰的同一内毒素的活性相比，修饰的内毒素的增强的杀昆虫活性。特别是，已发现，Cry3*δ-内毒素具有增强的抗玉米食虫的活性，因此优选用于本发明。更优选的是Cry3B*δ-内毒素，甚至更优选的是Cry3Bb*δ-内毒素。甚至更优选的转基因事件是包含表达下表所列的修饰的δ-内毒素的能力的那些。该表还显示了包含表达各自的新内毒素的基因的转基因苏云金芽孢杆菌菌株，其在Agricultural Research Service Collection(NRRL)at 1815 N.University Street，Peoria，I11.91904中保存的日期以及保藏号。
还已经发现，当与具有转基因事件、并且转基因事件具有一定水平的抗害虫有效性的种子联合使用时，优选的本发明应用是减轻害虫的噬食性破坏。为了举例说明怎样的有效水平是优选的，下列实例将使用Iowa Root Rating Method(Hills and Peters，J.Econ.Entomol.，64764-765，1971)，该方法以1-6的等级估量玉米食虫对玉米根部的噬食性破坏。在该等级评定中，1＝没有破坏或仅少数较小的噬食疤痕；2＝明显的噬食疤痕，但是没有根被吃掉至植物的1.5英寸内；3＝几个根被吃掉至植物的1.5英寸内，但是根的整个节点的同等物没有被毁坏；4＝一个根节点被完全毁坏；5＝两个根节点被完全毁坏；且6＝三个或更多个根节点被毁坏。毁坏的根定义为已经毁掉至基部根的1.5英寸内的根部。毁掉的根不用必须源自一个节点，但是所有毁掉的根都必须等于完整节点的同等物以视为毁坏的节点。
如果与没有转基因事件的相同农作物相比，转基因事件将害虫的噬食性破坏减少了一定量，但是没有防止目标害虫的基本上所有破坏，则本文所用的转基因事件在抗目标害虫的有效水平的优选范围内。例如，如果10％的转基因玉米遭受了4或更高级(按照Iowa 1-6等级)的破坏，而80％的非转基因玉米遭受了4或更高级的破坏，则可以说对转基因玉米的破坏是对非转基因玉米的破坏的(10/80)×100＝12.5％。应当理解，对于本发明目的，如果在相同条件下具有转基因事件的玉米受到害虫的破坏是非转基因玉米所受到的相同害虫破坏的约5％-约50％，则玉米中的转基因事件在优选的有效水平范围内。更优选地，在相同条件下具有转基因事件的玉米受到害虫的破坏是非转基因玉米所受到的相同害虫破坏的约10％-约40％，甚至更优选地，在相同条件下具有转基因事件的玉米受到害虫的破坏是非转基因玉米所受到的相同害虫破坏的约15％-约30％、还更优选约20％-约30％。当使用如本文所用的术语“约”来描述对玉米的破坏程度时，应当理解，该破坏程度可在所述限度之上或之下多达1％或2％，并且仍然视为在所述范围内。例如，4.5％破坏应当视为“约5％”。
虽然不希望受缚于这个或任何其它理论，但是据信，当与提供抗目标害虫的在优选有效范围内的保护的转基因事件联合使用时，用杀虫剂处理种子可提供显著的优点。此外还据信，本领域技术人员众所周知得到具有在优选有效范围内的转基因事件在什么情况下是有利的。
本发明还包括具有一种以上转基因事件的种子和植物。这样的组合称为“堆积的”转基因事件。这些堆积的转基因事件可以是针对同一目标害虫的转基因事件，或者它们可针对不同的目标害虫。在一个优选的方法中，具有表达Cry3蛋白的能力的种子还具有表达至少一种不同于Cry3蛋白的其它杀昆虫蛋白的能力。
在另一个优选的方法中，具有表达Cry3蛋白的能力的种子还具有提供除草剂耐受性的转基因事件。提供除草剂耐受性的转基因事件更优选是提供抵抗草甘膦、N-(膦酰基甲基)甘氨酸，包括这些除草剂的异丙基胺盐形式的能力的转基因事件，甚至更优选是能有效地给得自gonsanto Co.，St.Louis，MO的ROUNDUP READY植物和种子提供除草剂抗性的转基因事件。
在本发明方法中，用杀虫剂处理具有转基因事件的玉米种子。
适用于本发明的杀虫剂包括除虫菊酯和合成拟除虫菊酯；噁二嗪衍生物类；chloronicotinyls类；硝基胍衍生物类；三唑类；有机磷酸酯类；吡咯类；吡唑类；苯基吡唑类；二酰基肼类；生物/发酵产物；和氨基甲酸酯类。关于在这些分类内的杀虫剂的进一步信息可参见例如The Pesticide Manual，11th Ed.，C.D.S.Tomlin，Ed.，BritishCrop Protection Council，Farnham，Surry，UK(1997)。
可用于本发明的拟除虫菊酯包括除虫菊酯和合成拟除虫菊酯。优选用于本发明方法的除虫菊酯包括但不限于2，2-二甲基-3-(2-甲基丙烯基)-环丙烷甲酸的2-烯丙基-4-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮酯，和/或(2-甲基-1-丙烯基)-2-甲氧基-4-氧代-3-(2-丙烯基)-2-环戊烯-1-基酯及其顺式和反式异构体的混合物(Chemical AbstractsService Registry Number(″CAS RN″)8003-34-7)。
优选用于本发明的合成拟除虫菊酯包括(S)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基4-氯-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(杀灭菊酯；CAS RN 51630-58-1)、(S)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(S)-4-氯-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(高氰戊菊酯；CAS RN 66230-04-4)、(3-苯氧基苯基)-甲基(+)顺式-反式-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(氯菊酯；CAS RN 52645-53-1)、(±)α-氰基-(3-苯氧基苯基)甲基(+)-顺式，反式-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基-环丙烷甲酸酯(氯氰菊酯；CAS RN 52315-07-8)、(乙体氯氰菊酯；CAS RN 65731-84-2)、(辛体氯氰菊酯；CAS RN 71697-59-1)、S-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(±)顺式/反式3-(2，2-二氯乙烯基)2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(己体氯氰菊酯；CAS RN 52315-07-8)、(S)-α-氰基-3-苯氧基苄基(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(溴氰菊酯；CAS RN52918-63-5)、α-氰基-3-苯氧基苄基2，2，3，3，-四甲基环丙烷甲酸酯(甲氰菊酯；CAS RN 64257-84-7)、(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基(R)-2-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氨基]-3-甲基丁酸酯(氟胺氰菊酯；CASRN 102851-06-9)、(2，3，5，6-四氟-4-甲基苯基)-甲基-(1α，3α)-(Z)-(±)-3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(七氟菊酯；CAS RN 79538-32-2)、(±)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(±)-4-(二氟甲氧基)-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(氟氰戊菊酯；CAS RN70124-77-5)、氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲基3-[2-氯-2-(4-氯苯基)乙烯基]-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(氟氯苯菊酯；CAS RN 69770-45-2)、氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲基3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基-环丙烷甲酸酯(氟氯氰菊酯；CAS RN 68359-37-5)、(β-氟氯氰菊酯；CAS RN 68359-37-5)、(四氟菊酯；CAS RN 118712-89-3)、(S)-α-氰基-3-苯氧基苄基(Z)-(1R-顺式)-2，2-二甲基-3-[2-(2，2，2-三氟-三氟甲基-乙氧基羰基)乙烯基]环丙烷甲酸酯(氟酯菊酯；CAS RN101007-06-1)、α-氰基-3-苯氧基苄基-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯的(1R顺式)S和(1S顺式)R对映异构体对(甲体氯氰菊酯、CAS RN 67375-30-8)、[1R，3S)3(1′RS)(1′，2′，2′，2′-四溴乙基)]-2，2-二甲基环丙烷甲酸(S)-α-氰基-3-苯氧基苄基酯(四溴菊酯；CAS RN 66841-25-6)、氰基-(3-苯氧基苯基)甲基2，2-二氯-1-(4-乙氧基苯基)环丙烷甲酸酯(乙氰菊酯；CAS RN 63935-38-6)、[1α，3α(Z)]-(±)-氰基-(3-苯氧基苯基)甲基3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯((RS)氯氟氰菊酯；CAS RN 68085-85-8)、[1α(S)，3α(Z)]-氰基(3-苯氧基苯基)甲基-3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(氯氟氰菊酯；CAS RN91465-08-6)、(2-甲基[1，1′-联苯]-3-基)甲基3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基-环丙烷甲酸酯(氟氯菊酯；CAS RN 82657-04-3)、5-1-苄基-3-呋喃基甲基-d-顺式(1R，3S，E)2，2-二甲基-3-(2-氧代，-2，2，4，5-四氢亚噻吩基甲基)环丙烷甲酸酯(噻嗯菊酯，RU15525；CAS RN 58769-20-3)、[5-(苯基甲基)-3-呋喃基]-3-呋喃基2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)环丙烷甲酸酯(苄呋菊酯；CASRN 10453-86-8)、(1R-反式)-[5-(苯基甲基)-3-呋喃基]甲基2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)环丙烷甲酸酯(右旋反灭虫菊酯；CAS RN28434-01-7)、3，4，5，6-四氢邻苯二甲酰亚氨基甲基-(1RS)-顺式-反式-菊酸酯(胺菊酯；CAS RN 7696-12-0)、3-苯氧基苄基d，1-顺式，反式2，2-二甲基-3-(2-甲基丙烯基)环丙烷甲酸酯(苯醚菊酯；CAS RN26002-80-2)、(烯炔菊酯；CAS RN 54406-48-3)、(苯醚氰菊酯；CASRN 39515-40-7)、(烯酮菊酯；CAS RN 23031-36-9)、(咪炔菊酯；CASRN 72963-72-5)、(RS)-3-烯丙基-2-甲基-4-氧代环戊-2-烯基-(1A，3R；1R，3S)-2，2-二甲基-3-(2-甲基丙-1-烯基)环丙烷甲酸酯(丙烯除虫菊；CAS RN 584-79-2)、(反丙烯除虫菊；CAS RN 584-79-2)和(ZXI8901；CAS RN 160791-64-0)。相信-种或多种上述合成拟除虫菊酯的混合物也可用于本发明。特别优选的合成拟除虫菊酯是七氟菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯菊酯、氯菊酯和氟氯氰菊酯。甚至更优选的合成拟除虫菊酯是七氟菊酯和氯氟氰菊酯，还更优选的是七氟菊酯。
噁二嗪衍生物类的杀昆虫剂可用于本发明方法。优选用于本发明的噁二嗪衍生物类包括5-(2-氯吡啶-5-基甲基)-3-甲基-4-硝基亚氨基全氢化-1，3，5-噁二嗪、3-甲基-4-硝基亚氨基-5-(1-氧化-3-吡啶基甲基)全氢化-1，3，5-噁二嗪、5-(2-氯-1-氧化-5-吡啶基甲基)-3-甲基-4-硝基亚氨基全氢化-1，3，5-噁二嗪和3-甲基-5-(2-甲基吡啶-5-基甲基)-4-硝基亚氨基全氢化-1，3，5-噁二嗪。
Chloronicotinyl类杀昆虫剂也可用于本发明方法。优选用于本发明组合物中的Chloronicotinyl类包括啶虫清((E)-N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N′-氰基-N-甲基乙脒(methyleneimiclamicle)；CAS RN135410-20-7)、吡虫啉(1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-硝基-2-咪唑烷亚胺；CAS RN 138261-41-3)和硝胺烯啶(N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-乙基-N′-甲基-2-硝基-1，1-乙二胺；CAS RN 120738-89-8)。
硝基胍类杀昆虫剂可用于本发明方法。优选用于本发明的硝基胍包括MTI 446(nidinotefuran)。
可用于本发明方法中的吡咯类、吡唑类和苯基吡唑类包括在U.S.专利5,952,358中描述的那些。优选的吡唑类包括氟唑虫清(4-溴-2-(4-氯苯基)-1-乙氧基甲基-5-三氟甲基吡咯-3-甲腈；CAS RN122453-73-0)、唑螨酯((E)-1，1-二甲基乙基-4-[[[[(1，3-二甲基-5-苯氧基-1H-吡唑-4-基)亚甲基]氨基]氧基]甲基]苯甲酸酯；CAS RN111812-58-9)和吡螨胺(4-氯-N-[[4-1，1-二甲基乙基)苯基]甲基]-3-乙基-1-甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺；CAS RN 119168-77-3)。优选的苯基吡唑类是锐劲特(5-氨基-[2，6-二氯-4-(三氟甲基)苯基]-4-[(1R，S)-(三氟甲基)亚磺酰基]-1H-吡唑-3-甲腈；CAS RN 120068-37-3)。
可用于本发明的二酰基肼类包括特丁苯酰肼(4-氯苯甲酸-2-苯甲酰基-2-(1，1-二甲基乙基)-酰肼；CAS RN 112226-61-6)、甲氧苯酰肼(RH-2485；N-叔丁基-N′-(3-甲氧基-邻甲苯甲酰基)-3，5-二甲苯酰肼；CAS RN 161050-58-4)和双苯酰肼(3，5-二甲基苯甲酸1-(1，1-二甲基乙基)-2，(4-乙基苯甲酰基)酰肼；CAS RN 112410-23-8)。
三唑类例如杀草强(CAS RN 61-82-5)和唑蚜威可用于本发明方法。优选的三唑是唑蚜威([[1-[(二甲基氨基)羰基]-3-(1，1-二甲基乙基)-1H-1，2，4-三唑-5-基]硫基]乙酸乙酯；CAS RN 112143-82-5)。
生物/发酵产物例如齐墩螨素(阿维菌素；CAS RN 71751-41-2)和艾克敌105(XDE-105，CAS RN 131929-60-7)可用于本发明方法。
有机磷酸酯类杀昆虫剂也可用作本发明方法的一个组分。优选的有机磷酸酯类杀昆虫剂包括高灭磷(CAS RN 30560-19-1)、毒死蜱(CASRN 2921-88-2)、甲基毒死蜱(CAS RN 5598-13-0)、二嗪农(CAS RN333-41-5)、克线磷(CAS RN 22224-92-6)和马拉松(CAS RN 121-75-5)。
此外，氨基甲酸酯类杀昆虫剂可用于本发明方法中。优选的氨基甲酸酯类杀昆虫剂是涕灭威(CAS RN 116-06-3)、甲萘威(CAS RN63-25-2)、呋喃丹(CAS RN 1563-66-2)、甲氨叉威(CAS RN 23135-22-0)和硫双威(CAS RN 59669-26-0)。
当在本文中描述杀昆虫剂时，应当理解，该描述包括表现出与所述形式的杀昆虫剂相同的杀昆虫活性的杀昆虫剂的盐形式以及杀昆虫剂的任何异构体和/或互变异构体形式。
用于本发明方法中的杀昆虫剂可以是作为这样的杀昆虫剂进行市售的任何等级或纯度。在市售制剂中作为杂质伴随杀昆虫剂的其它物质可在本发明方法和组合物中耐受，只要这样的其它物质不使组合物不稳定或显著降低或破坏任何杀昆虫剂组分或转基因事件抗目标害虫的活性即可。本领域技术人员可很容易确定出可耐受的杂质和不可耐受的杂质。
已经发现，本发明方法可用于保护种子和植物抗多种农业害虫，包括昆虫、螨虫、真菌、酵母、霉菌和细菌。
当昆虫是本发明的目标害虫时，这样的害虫包括但不限于鳞翅目(Lepidoptera)，例如长翅卷蛾属(Acleriss pp.)、小卷蛾属(Adoxophyess pp.)、透翅蛾属(Aegeria spp.)、地老虎属(Agrotis spp.)、棉叶波纹夜蛾(Alabamaargillaceae)、Amylois spp.、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、黄卷蛾属(Archips spp)、银带卷叶蛾属(Argyrotaenia spp.)、夜蛾属(Autographa spp.)、玉米楷夜蛾(Busseola fusca)、粉斑螟(Cadracautella)、桃小食心虫(Carposina nipponensis)、禾草螟属(Chilospp.)、卷蛾属(Choristoneuras pp.)、葡萄果蠹蛾(Clysiaambiguella)、稻纵卷螟属(Cnaphalocrociss pp.)、卷叶蛾属(Cnephasia spp.)、Cochylis spp.、鞘蛾属(Coleophora spp.)、Crocidolomia binotalis、苹果异形小卷蛾(Cryptophlebialeucotreta)、豆小卷蛾属(Cydia spp.)、异草螟属(Diatraea spp.)、展叶松夜蛾(Diparopsis castanea)、金刚钻属(Earias spp.)、粉斑螟属(Ephestia spp.)、松花小卷蛾属(Eucosma spp.)、Eupoeciliaambiguella、黄毒蛾属(Euproctis spp.)、切根虫属(Euxoa spp.)、小卷叶额属(Grapholita spp.)、Hedya nubiferana、棉铃虫属(Heliothis spp.)、菜心野螟(Hellula undalis)、美国白蛾(Hyphantria cunea)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella)、旋纹潜蛾(Leucoptera scitella)、细蛾属(Lithocollethis spp.)、花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、毒蛾属(Lymantria spp.)、潜蛾属(Lyonetia spp.)、天幕毛虫属(Malacosoma spp.)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、烟草天蛾(Manduca sexta)、冬尺蛾属(Operophtera spp.)、玉米螟(Ostrinia Nubilalis)、超小卷蛾属(Pammene spp.)、褐卷蛾属(Pandemis spp.)、小眼夜蛾(Panolisflammea)、棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、马铃薯麦蛾(Phthorimaea operculella)、菜粉蝶(Pieris rapae)、菜粉蝶属(Pieris spp.)、小菜蛾(Plutella xylostella)、巢蛾属(Praysspp.)、三化螟属(Scirpophaga spp.)、大螟属(Sesamia spp.)、长须卷蛾属(Sparganothis spp.)、斜纹夜蛾属(Spodoptera spp.)、透翅蛾属(Synanthedon spp.)、带蛾属(Thaumetopoea spp.)、卷叶蛾属(Tortrix spp.)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)和巢蛾属(Yponomeuta spp.)；鞘翅目(Coleoptera)，例如叩甲属(Agriotes spp.)、花象甲属(Anthonomus spp.)、甜菜隐食甲(Atomaria linearis)、甜菜茎跳甲(Chaetocnema tibialis)、香蕉根象甲属(Cosmopolites spp.)、象虫属(Curculio spp.)、皮蠹属(Dermestes spp.)、条叶甲属(Diabrotica spp.)、植瓢虫属(Epilachna spp.)、Eremnus spp.、马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)、稻象甲属(Lissorhoptrus spp.)、鳃金龟属(Melolontha spp.)、Orycaephilus spp.、草莓根象甲(Otiorhynchusspp.)、Phlyctinus spp.、丽金龟属(Popillia spp.)、跳甲属(Psylliodes spp.)、动根蠹属(Rhizopertha spp.)、金龟甲科(Scarabeidae)、米象属(Sitophilus spp.)、麦蛾属(Sitotrogaspp.)、拟步行虫属(Tenebrio spp.)、拟谷温属(Tribolium spp.)和皮蠹属(Trogoderma spp.)；直翅目(Orthoptera)，例如蜚蠊属(Blatta spp.)、小蠊属(Blattella spp.)、蝼蛄属(Gryllotalpa spp.)、马得拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、飞蝗属(Locusta spp.)、大蠊属(Periplaneta ssp.)和蚱蜢属(Schistocerca spp.)；等翅目(Isoptera)，例如Reticulitemes ssp；啮虫目(Psocoptera)，例如节虱属(Liposcelis spp.)；虱目(Anoplura)，例如血虱属(Haematopinus spp.)、长颚虱属(Linognathus spp.)、虱属(Pediculus spp.)、瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)和根瘤蚜属(Phylloxera spp.)；食毛目(Mallophaga)，例如Damalinea spp.和啮毛虱属(Trichodectes spp.)；缨翅目(Thysanoptera)，例如花蓟马属(Franklinella spp.)、条蓟马属(Hercinothrips spp.)、带蓟马属(Taeniothrips spp.)、棕黄蓟马(Thrips palmi)、棉蓟马(Thrips tabaci)和非洲桔硬蓟马(Scirtothrips aurantii)；异翅亚目(Heteroptera)，例如臭虫属(Cimex spp.)、可可瘤盲蝽(Distantiella theobroma)、红蝽属(Dysdercus spp.)、Euchistus spp.、褐盾蝽属(Eurygasterspp.)、稻缘蝽属(Leptocorisa spp.)、绿蝽属(Nezara spp.)、网蝽属(Piesma spp.)、红腹猎蝽属(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis)、稻黑蝽属(Scotinophara spp.)和锥蝽属(Triatoma spp.)；同翅目(Homoptera)，例如绵纷虱(Aleurothrixus floccosus)、粉虱属(Aleyrodesbrassicae)、圆盔蚧属(Aonidiella spp.)、蚜科(Aphididae)、蚜虫属(Aphis spp.)、圆盾蚧属(Aspidiotus spp.)、甘薯粉虱(Bemisiatabaci)、蜡蚧属(Ceroplaster spp.)、茶褐圆蚧(Chrysomphalusaonidium)、蔷薇轮蚧(Chrysomphalus dictyospermi)、褐软蚧(Coccus hesperidum)、微叶蝉属(Empoasca spp.)、苹果绵蚜(Eriosoma larigerum)、红斑叶蝉属(Erythroneura spp.)、Gascardia spp.、灰稻虱属(Laodelphax spp.)、Lacanium corni、蛎蚧属(Lepidosaphes spp.)、Macrosiphus spp.、瘤额蚜属(Myzusspp.)、Nehotettix spp.、褐飞虱属(Nilaparvata spp.)、Paratoriaspp.、瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)、游球菌属(Planococcus spp.)、桑白蚧属(Pseudaulacaspis spp.)、粉蚧属(Pseudococcus spp.)、叶虱属(Psylla ssp.)、棉蚧(Pulvinaria aethiopica)、圆盾蚧属(Quadraspidiotus spp.)、缢管属(Rhopalosiphum spp.)、盔蚧属(Saissetia spp.)、叶蝉属(Scaphoideus spp.)、麦二叉蚜属(Schizaphis spp.)、Sitobion spp.、温室粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、木虱(Trioza erytreae)和桔盾蚧(Unaspiscitri)；膜翅目(Hymenoptera)，例如Acromyrmex、切叶蚁属(Atta spp.)、茎蜂属(Cephus spp.)、叶蜂属(Diprions pp.)、锯节叶蜂科(Diprionidae)、云杉叶蜂(Gilpiniapolytoma)、叶蜂属(Hoplocampa spp.)、田蚁属(Lasius spp.)、蚁属(Monomorium pharaonis)、锯角叶蜂属(Neodiprion spp)、水蚁属(Solenopsis spp.)和胡蜂属(Vespa ssp.)；双翅目(Diptera)，例如伊蚊属(Aedes spp.)、Antherigona soccata、Bibio hortulanus、丽蝇属(Calliphora erythrocephala)、实蝇属(Ceratitis spp.)、金蝇属(Chrysomyia spp.)、库蚊属(Culex spp.)、疽蝇属(Cuterebraspp.)、实蝇属(Dacus spp.)、黄猩猩果蝇(Drosophilamelanogaster)、厕蝇属(Fannia spp.)、马蝇属(Gastrophilusspp.)、舌蝇属(Glossina spp.)、皮蝇属(Hypoderma spp.)、Hyppobosca spp.、潜蝇属(Liriomysa spp.)、绿蝇属(Luciliaspp.)、豆干黑潜蝇属(Melanagromyza spp.)、苍蝇属(Musca ssp.)、狂蝇属(Oestrus spp.)、Orseolia spp.、瑞典麦杆蝇(Oscinellafrit)、甜菜潜叶蝇(Pegomyia hyoscyami)、春麦蝇属(Phorbiaspp.)、苹实蝇(Rhagoletis pomonella)、蕈蝇属(Sciara spp.)、螫蝇属(Stomoxys spp.)、虻属(Tabanus spp.)、Tannia spp.和大蚊属(Tipula spp.)；蚤目(Siphonaptera)，例如角叶蚤属(Ceratophyllus spp.)和印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)；和缨尾目(Thysanura)，例如西洋衣鱼(Lepisma saccharina)。
已经发现，当昆虫类害虫是条叶甲属害虫时，特别是当害虫是玉米幼芽根叶甲(Diabrotica virgifera)、Diabrotica barberi或十一星瓜叶甲(Diabrotica undecimpunctata)时，本发明是特别有效的。
其中相信本发明是特别有效的另一应用是，杀虫剂具有抗杂草或寄生或腐生植物的活性，并且转基因事件具有抗选自玉米幼芽根叶甲、Diabrotica barberi和十一星瓜叶甲的害虫的活性。相信当杂草或寄生或腐生植物是称为“Striga”的非洲植物时，本发明方法是更优选有用的，当杀虫剂是ROUNDUP(得自Monsanto Company)时，是甚至更优选的。
在本发明方法中，将杀虫剂施用给转基因玉米种子。虽然相信本发明方法可给任何生理状态的转基因种子施用，但是种子优选处于在处理期间不发生任何损害的足够耐久的状态。一般情况下，种子应当是从田地中收获的；从植物中取出的；和与任何穗、茎、外壳、和外层果肉或其它非种子植物材料中分离开的种子。种子还优选生物稳定至一定程度，以使得处理不会给种子带来任何生物损害。在一个实施方案中，例如，可给已经收获、清洁并干燥至水分含量低于约15％重量的玉米种子施以处理。在另一个实施方案中，种子可以是在用杀虫剂处理之前或期间已经干燥过，然后用水和/或另一材料清洁和/或再干燥的种子。在所述的限定中，相信可在收获种子与播种种子之间的任何时间给种子施以处理。本文所用的术语“未播种的种子”包括在收获种子与将种子播种在土地中以让植物出芽和生长之间的任何时期的种子。
当提及用杀虫剂“处理”未播种的种子时，这样的处理不包括其中将杀虫剂施加到土壤上而不是种子上的操作。例如，与种子播种同时进行的作为在条带(band)、“T”-条带或在犁沟中施用杀虫剂的这样的处理不包括在本发明内。
杀虫剂或杀虫剂组合可“纯净地”施用，即其中不存在任何稀释或添加的组分。然而，杀虫剂一般是以杀虫剂制剂的形式给种子施用。这样的制剂可含有一种或多种其它所需组分，包括但不限于液体稀释剂，起杀虫剂基质作用的粘合剂，在应力状态下保护种子的填料，和改善包衣柔韧性、粘合性和/或涂布性的增塑剂。此外，对于含有很少或不含填充剂的油性杀虫剂制剂，可能希望向制剂中加入干燥剂例如碳酸钙、高岭土或膨润土、珍珠岩、硅藻土或任何其它吸附性材料。在种子处理中使用这样的组分是本领域已知的。参见例如U.S.专利5,876,739。本领域技术人员可根据欲处理的种子的种类和所选的具体杀虫剂来容易地选择所需组分以用于杀虫剂制剂中。此外，可使用如下文实施例中所述的易于获得的已知杀虫剂的市售制剂。
还可以用一种或多种下列组分处理种子其它杀虫剂，包括仅在地下起作用的化合物；杀真菌剂，例如克菌丹、福美双、metalaxyl(methoxam＝metalaxyl的拆分异构体)、氟噁菌、噁霜灵和每一这些物质的异构体等；除草剂，包括选择下列的化合物氨基甲酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、乙酰胺类、三嗪类、二硝基苯胺类、甘油醚类、哒嗪酮类、尿嘧啶类、苯氧基化合物类、脲和苯甲酸类；除草剂安全剂，例如苯并噁嗪类、二苯甲基衍生物类、N，N-二烯丙基二氯乙酰胺、多种不同的二卤代酰基、噁唑烷基和噻唑烷基化合物类、乙酮、萘二甲酸酐化合物类和肟衍生物类；肥料；和生物控制剂例如源自根瘤菌属、杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、木霉属、Glomus和菌根真菌的天然或重组的细菌和真菌。这些组分可作为种子上的单独的层加入，或者可作为杀虫剂组合物的一部分加入。
优选地，本发明新组合物或其它组分在种子处理中的用量应当不抑制种子生殖，或者不对种子引起植物毒害性破坏。
用于处理转基因玉米种子的杀虫剂制剂可呈下列形式悬浮液；乳液；颗粒在含水介质(例如水)中的浆液；可润湿的粉剂；可润湿的粒剂(干的可流动粒剂)；和干的粒剂。如果配制成悬浮液或浆液，活性组分在制剂中的浓度优选为约0.5％-约99％重量(w/w)、优选5-40％。
如上所述，可向制剂中加入其它常用的无活性的或惰性的组分。这样的惰性组分包括但不限于常规粘合剂，分散剂例如甲基纤维素(Methocel A15LV或Methocel A15C，例如在种子处理中起联合的分散剂/粘合剂的作用)、聚乙烯醇(例如Elvanol 51-05)、卵磷脂(例如Yelkinol P)、聚合分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯PVP/VAS-630)，增稠剂(例如粘土增稠剂如Van Gel B以改善粘度和减轻颗粒悬浮液的沉淀)、乳液稳定剂、表面活性剂、防冻化合物(例如尿素)、染料、着色剂等。用于本发明的其它惰性组分可参见McCutcheon′s，vol.1，″Emulsifiers and Detergents，″MC Publishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996。用于本发明的另外的惰性组分可参见McCutcheon′s，vol.2，″Functional Materials，″MCPublishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996。
本发明的杀虫剂和杀虫剂组合可通过任何标准种子处理方法给种子施用，这样的方法包括但不限于在容器(例如瓶子或袋)中混合、机械施用、滚筒处理、喷雾和浸渍。可使用任何常规活性或惰性物质来将种子与本发明杀虫剂接触，例如常规膜包衣材料，包括但不限于基于水的膜包衣材料例如Sepiret(Seppic，Inc.，Fairfield，N.J.)和Opacoat(Berwind Pharm.Services，Westpoint，PA)。
本发明杀虫剂可作为种子包衣的组分给种子施用。当通过加入本发明杀虫剂组合的一个实施方案来改进时，本领域已知的种子包衣方法和组合物是有用的。这样的包衣方法及其施用装置公开在例如下列专利中U.S.专利5,918,413、5,891,246、5,554,445、5,389,399、5,107,787、5,080,925、4,759,945和4,465,017。种子包衣组合物公开在例如下列专利中U.S.专利5,939,356、5,882,713、5,876,739、5,849,320、5,834,447、5,791,084、5,661,103、5,622,003、5,580,544、5,328,942、5,300,127、4,735,015、4,634,587、4,383,391、4,372,080、4,339,456、4,272,417和4,245,432。
有用的种子包衣含有一种或多种粘合剂和至少一种本发明杀虫剂组合。
可用于本发明的粘合剂优选包括对所包衣的种子没有植物毒害作用的天然或合成粘合性聚合物。所述粘合剂可选自聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉、改性淀粉、糊精、麦芽糖糊精、藻酸盐和脱乙酰壳多糖；脂肪；油；蛋白，包括明胶和玉米蛋白；阿拉伯胶；虫胶；二氯乙烯与二氯乙烯共聚物；木素磺酸钙；丙烯酸共聚物；聚丙烯酸乙烯酯；聚氧化乙烯；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚丙烯酸羟乙酯、异丁烯酰胺单体；和聚氯丁二烯。
优选选择粘合剂以使它起本发明杀虫剂的基质的作用。虽然上述粘合剂都可以用作基质，但是具体的粘合剂将取决于杀虫剂组合的性质。本文所用术语“基质”是指一种或多种粘合剂化合物的连续固相，在其中分布着一种或多种本发明杀虫剂的不连续相。任选地，填充剂和/或其它组分也可以存在于基质中。应当理解，术语基质包括可认为是基质系统、贮存系统或微囊包封系统的那些。一般情况下，基质系统由本发明杀虫剂组合与均匀地分散在聚合物内的填充剂组成，而贮存系统由包含本发明杀虫剂组合的单独的相组成，其中本发明杀虫剂组合分散在周围的限速聚合相内。微囊包封系统包括小颗粒或液滴的包衣，以及在固体基质中的分散体。
粘合剂在包衣中的量可以改变，但是应当占种子重量的约0.01-约25％、更优选约0.05-约15％、甚至更优选约0.1％-约10％。
如上所述，基质可任选包含填充剂。填充剂可以是吸收剂或惰性填充剂，例如本领域已知的那些，并且可包括木粉、粘土、活性炭、糖、硅藻土、谷粉、细粒无机固体、碳酸钙等。可使用的粘土和无机固体包括钙系膨润土、高岭土、陶土、滑石粉、珍珠岩、云母、蛭石、硅酸盐、石英粉、蒙脱石及其混合物。可使用的糖包括糊精和麦芽糖糊精。谷粉包括小麦粉、燕麦粉和大麦粉。
选择填充剂以使其给种子提供适当的微气候，例如使用填充剂以提高活性组分的负载率和调节活性组分的控制释放。填充剂可有助于种子包衣的生产或加工。填充剂的量可以改变，但是填充剂组分的重量一般为占种子重量的约0.05-约75％、更优选约0.1-约50％、甚至更优选约0.5％-约15％。
可用于包衣中的杀虫剂是本文所述的杀虫剂。用于处理种子的杀虫剂的量将根据种子类型和活性组分的类型而变，但是处理将包括把种子与杀虫有效量的杀虫剂组合接触。当昆虫是目标害虫时，该量应当是杀昆虫有效的杀昆虫剂的量。本文所用的杀昆虫有效量是指将杀死处于幼虫或蛹生长状态的昆虫类害虫，或将始终降低或延迟昆虫类害虫产生的破坏量的杀昆虫剂的量。
在处理中施用给种子的杀虫剂的量一般为约10g-约2000g活性组分/100kg重量的种子。杀虫剂的量优选为约50g-约1000g活性组分100kg种子、更优选为约100g-约600g活性组分/100kg种子、甚至更优选为约200g-约500g活性组分/100kg重量的种子。或者，已经发现，杀虫剂的量优选超过约60g杀虫剂活性组分/100kg种子、更优选超过约80g/100kg种子。
在优选的本发明实施方案中，转基因事件包含表达Cry3Bb.11231蛋白或Cry3Bb.11098蛋白的能力，且杀虫剂选自吡虫啉或七氟菊酯。
用于处理的杀虫剂必须不抑制种子的出芽，并且应当在目标昆虫的生命周期中昆虫引起种子或植物损伤的时间期间有效地保护种子和/或植物。一般情况下，包衣在播种后0-120天是有效的。
本发明杀虫剂可以以包衣的形式给种子施用。包衣在调和高杀虫剂负载方面是特别有效的，因为可能需要处理通常难治的害虫例如玉米食虫，同时又需要防止由于杀虫剂负载增加所引起的不需要的植物毒害性。
任选地，可在包衣制剂中使用增塑剂。增塑剂通常用于使由包衣层形成的膜具有更强的柔韧性，改善粘合性和涂布性，以及提高加工速度。提高的膜柔韧性对于在贮存、操作或播种期间减小形成碎片、破裂或剥落很重要。可使用多种增塑剂，然而，有用的增塑剂包括聚乙二醇、甘油、邻苯二甲酸丁酯苄酯、乙二醇苯甲酸酯和相关化合物。增塑剂在包衣层中的含量为约0.1-约20％重量。
当用于包衣中的杀虫剂是油型制剂，并且存在很少或不存在填充剂时，通过将制剂干燥来加快干燥过程可能是有用的。该任选步骤可通过本领域已知的手段来完成，并且可包括加入碳酸钙、高岭土或膨润土、珍珠岩、硅藻土或任何吸收性材料，它们优选与杀虫包衣层同时加入以吸收油或过量水分。有效地提供干的包衣所需的碳酸钙或相关化合物的量为占种子重量的约0.5-约10％。
用杀虫剂形成的包衣优选是能够减慢杀虫剂通过经由基质扩散或移动到周围介质中而实现的释放的速度的类型。
除了包衣层以外，还可以用一种或多种下列组分处理种子其它杀虫剂，包括杀真菌剂和除草剂，除草安全剂；肥料和/或生物控制剂。这些组分可作为单独一层加入，或者可加在杀虫包衣层中。
可用任何常规包衣技术和机器将杀虫剂制剂施加到种子上，例如流化床技术、滚压机法、旋转静态种子处理器和转筒式包衣器。其它方法例如喷动床也是有用的。可在包衣之前将种子作填孔处理。包衣后，一般可将种子干燥，然后转移到用于上浆的上浆机中。这样的操作是本领域已知的。
还可以用膜保护涂层包封用杀虫剂处理过的种子以保护杀虫剂包衣。这样的保护涂层是本领域已知的，并且可使用常规流化床和转筒膜包衣技术施加。
在另一个本发明实施方案中，可通过使用固体基质填装来将杀虫剂引入到种子上或种子中。例如，可将一定量的杀虫剂与固体基质材料混合，然后可让种子与固体基质材料接触一定时间以将杀虫剂引入到种子中。之后可任选将种子与固体基质材料分离开并贮存或使用，或者将固体基质材料与种子的混合物一起贮存或直接播种。用于本发明的固体基质材料包括聚丙烯酰胺、淀粉、粘土、二氧化硅、矾土、土壤、沙子、聚脲、聚丙烯酸酯或者能够将杀虫剂吸收或吸附一定时间并能够将杀虫剂释放到种子上或种子中的任何其它材料。确定杀虫剂与固体基质材料彼此相容是有用的。例如，应当选择固体基质材料，以使得其可以以适当速度在例如数分钟、数小时或数天的时间内释放杀虫剂。
本发明还涉及采用浸渗来作为另一用杀虫剂处理种子的方法。例如，将植物种子与在溶剂例如水中包含约1％重量-约75％重量杀虫剂的溶液混合一定时间。所述溶液的浓度优选为约5％重量-约50％重量、更优选为约10％重量-约25％重量。在种子与溶液混合的期间内，种子吸收(吸取)一部分杀虫剂。可任选将植物种子与溶液的混合物搅拌，例如通过振摇、转动、滚动或其它手段来搅拌。浸渗后，可 将种子从溶液中分离出来，并任选干燥，例如通过轻拍或风干来干燥。
在另一实施方案中，可将杀虫剂粉末与种子直接混合。可任选使用粘合剂将杀虫剂粉末粘合在种子表面上。例如，可将一定量的种子与粘合剂混合，并任选搅拌以促进用粘合剂将种子均匀包衣。然后可将用粘合剂包衣的种子与杀虫剂粉末混合。可将该混合物搅拌，例如通过滚动来搅拌，以促进粘合剂与杀虫剂粉末接触，由此使杀虫剂粉末粘着在种子上。
本发明还提供了已经通过上述方法用杀虫剂处理过的转基因玉米种子。
本发明处理的种子可用于以与常规处理的玉米种子相同的方式繁殖玉米植物。可按照与任何其它杀虫剂处理过的种子相同的方式将本发明处理的种子贮存、操作、播种和耕种。应当采取适当地安全措施来限制处理的种子与人、食品或饲料、水和鸟类以及野生或家养动物接触。
在下述实施例中描述优选的本发明实施方案。对于本领域技术人员来说，通过考虑本说明书或本文所公开的本发明实施方案，在本发明权利要求书范围内的其它实施方案是显而易见的。应当理解，本说明书和实施例仅是举例说明，本发明范围和实质由权利要求书限定。
下述实施例描述了优选的本发明实施方案。对于本领域技术人员来说，通过考虑本说明书或本文所公开的本发明实施方案，在本发明权利要求书范围内的其它实施方案是显而易见的。应当理解，本说明书和实施例仅是举例说明，本发明范围和实质由权利要求书限定。在实施例中，除非另有说明，否则所有百分比都是重量百分比。
实施例1制备具有能有效地抗玉米食虫的转基因事件的玉米种子，并用吡虫啉(Gaucho)和七氟菊酯(Raze)处理这样的种子。
通过在WO 99/31248中描述的关于这些各自事件的方法制备玉米种子以表达苏云金芽孢杆菌内毒素Cry3Bb.11231或Cry3Bb.11098。
如下所述，将具有或不具有各转基因事件的相同杂交种类的玉米种子用吡虫啉(作为GAUCHO得自Bayer Corp.)或七氟菊酯(作为RAZE得自Wilbur-Ellis Co.，Great Falls，Mont.；Walla Walla，WA)处理。所需杀虫剂的种子处理制剂是通过将测定量的杀虫剂在作为载体的水中混合而制得的，并在旋转静态种子处理器中于室温将所得制剂给测定重量的玉米种子施加1分钟。计算杀虫剂制剂和玉米种子各自的重量以给种子提供所需的杀虫剂处理比例。将杀虫剂混合到足量水中以使制剂有效地分布到该批量的所有种子上，同时将由于种子缺乏对制剂的摄取所致的处理制剂的损失减至最少。在播种之前让处理的种子无盖存放至少4小时。
当用吡虫琳处理种子时，将足量的Gaucho600 FS(含有48.7％重量的吡虫啉；得自Gustafson LLC)充分混合到水中以形成种子处理制剂，并将该制剂施用给一定重量的玉米种子以提供300克吡虫啉/100kg种子(0.75mg吡虫啉/粒种子)或400克吡虫啉/100kg种子(1.0mg吡虫啉/粒种子)的处理水平。
当用七氟菊酯处理种子时，将足量的Raze2.5 Fs(合有26.8％重量的七氟菊酯；得自wilbur-Ellis Co.)充分混合到水中以形成种子处理制剂，并将该制剂施用给一定重量的玉米种子以提供300克七氟菊酯活性组分/100kg种子(0.75mg七氟菊酯/粒种子)。
实施例2测定玉米种子中的转基因事件Cry3Bb.11231与玉米食虫杀虫剂种子处理的组合抗西部和北部玉米食虫的效力的大田试验。
依据有关方案并遵守USDA的通知要求来进行大田试验。这些试验的目的是测定玉米种子中的转基因事件Cry3Bb.11231与玉米食虫杀虫剂种子处理的组合抗西部和北部玉米食虫的效力。
对于所选的每个生长位置，试验田设计包括下列内容行间隔30英寸试验田大小4行×20播种密度2.0粒种子英尺所用的杂交体LH198×LH185或RX670复现试验4设计随机完全区组位置4幼虫来源通过以400个卵/ft(生长阶段V2)人工感染来补充天然感染对于每个生长区域使用下列种子处理组合编号玉米种子类型杀虫剂和量(克AI/100kg种子或mg ai/粒种子)1异杂交体 除了低水平的金针虫保护之外没有2Cry3Bb.11231 除了低水平的金针虫保护之外没有3Cry3Bb.11231 Gaucho600 FS@300g AI/100kg或0.75mgAI/粒种子4Cry3Bb.11231 Gaucho600 FS@400g AI/100kg或1.0mgAI/粒种子5Cry3Bb.11231 Raze2.5 FS@300g AI/100kg或0.75mgAI/粒种子6异杂交体 Force3G@0.014g AI/m或0.15oz AI/1000ft行，作为5″条带在播种时在土壤表面施用7异杂交体 Lorsban15G(毒死蜱；得自DowElanco)@0.11g AI/m或1.2oz AI/1000ft行，作为5″条带在播种时在土壤表面施用使用杀虫剂的所有种子处理都是如实施例1所述进行的。在编号为1和2的种子处理中，使用Gaucho进行抗金针虫保护，但是其水平足够低，以致于预计其对玉米食虫没有任何作用(即以约60g活性组分/100kg种子或0.16mg活性组分/粒种子的处理水平)，另外，接受编号为2的处理的种子仅具有转基因事件Cry3Bb.11231，并且没有进行任何预计将有效地抗玉米食虫的杀虫剂处理。
对于接受编号为3-5的处理的种子，通过实施例1中描述的方法施用杀虫剂。对于接受编号为6和7的处理的种子，将市售Force3G和Lorsban15G在播种时在5″条带中施用到土壤上。施用水平如上所示，并且在标准商业惯例的推荐范围内。
依据上述方案，在四个美国中西部州的4个不同位置播种和生长欲测试的玉米种子。
依据下述方案测定玉米食虫的破坏。在阶段V4-V6，通过计数每英亩中植物的数量来评价早期直立。在阶段VT-R1，通过该产业中众所周知的方法来评价玉米食虫破坏，并依据Iowa 1-6等级评定系统报告玉米食虫破坏。在该系统中，回收每块试验田10颗玉米植物的根部系统，并使用该1-6等级评定系统进行打分，其中1＝没有损害或仅少数较小的噬食疤痕，2＝明显的噬食疤痕，但是没有根被吃掉至植物的1.5英寸；3＝至少一个根被吃掉至植物的1.5英寸内，但是根的整个节点没有被毁坏，4＝一个根节点被吃掉至植物的1.5英寸内，5＝两个根节点(圈)被吃掉至植物的1.5英寸内，6＝三个或更多个根节点(圈)被吃掉至植物的1.5英寸内。
表1(A).在4个生长位置玉米食虫对具有常规表面条带的异杂交玉米植物和仅具有转基因事件Cry3Bb.11231以及具有其与用所选杀虫剂进行种子处理的组合的玉米植物的破坏。
从表1(A)的数据中可以看出，用吡虫啉或七氟菊酯以任何水平处理的转基因种子抗玉米食虫破坏的能力比未用这样的杀虫剂处理的种子强。此外，所有组合处理(转基因事件与杀虫剂处理的组合)的效力都高于用FORCE或LORSBAN进行的常规表面条带处理。
因此可以得出这样的结论，相对于单独的转基因事件或在播种时接受标准杀虫剂表面条带处理的异杂交种子，用吡虫啉或七氟菊酯处理具有转基因事件的玉米种子提供了改善的抵抗性。
实施例3测定玉米种子中的转基因事件Cry3Bb.11231与吡虫啉种子处理的组合抗西部和北部玉米食虫的效力的大田试验。
依据有关方案并遵守USDA的通知要求来进行大田试验。该试验的目的是测定玉米种子中的转基因事件Cry3Bb.11231与使用吡虫啉的玉米食虫种子处理的组合的效力。
对于所选的每个生长位置，试验田设计包括下列内容行间隔30英寸试验田大小4行×20播种密度2.0粒种子/英尺所用的杂交体LH198×LH185或RX670复现试验4设计随机完全区组位置4幼虫来源通过以400个卵/ft(生长阶段V2)人工感染来补充天然感染对于每个生长区域使用下列种子处理组合编号玉米种子类型杀虫剂和量(克AI/100kg种子或mg ai/粒种子)1 异杂交体除了低水平的金针虫保护之外没有2 Cry3Bb.11231除了低水平的金针虫保护之外没有3 Cry3Bb.11231Gaucho600FS@300g AI/100kg或0.75mg AI/粒种子4 Cry3Bb.11231Gaucho600FS@400g AI/100kg或1.0mg AI/粒种子5 Cry3Bb.11231Raze2.5FS@300g AI/100kg或0.75mgAI/粒种子6 异杂交体Force3G@0.014g AI/m或0.15oz
AI/1000ft行，作为5″条带在播种时在土壤表面施用7 异杂交体 Lorsban15G(毒死蜱；得自DowElanco)@0.11gAI/m或1.2oz AI/1000ft行，作为5″条带在播种时在土壤表面施用使用杀虫剂的所有种子处理都是如实施例1所述进行的。在编号为1和2的种子处理中，使用Gaucho进行抗金针虫保护，但是其水平足够低，以致于预计其对玉米食虫没有任何作用(即以约60g活性组分/100kg种子或0.16mg活性组分/粒种子的处理水平)，另外，接受编号为2的处理的种子仅具有转基因事件Cry3Bb.11231，并且没有进行任何预计将有效地抗玉米食虫的杀虫剂处理。
对于接受编号为3-5的处理的种子，通过实施例1中描述的方法施用杀虫剂。对于接受编号为6和7的处理的种子，将市售Force3G和Lorsban15G在播种时在5″条带中施用到土壤上。施用水平如上所示，并且在标准商业惯例的推荐范围内。
依据上述方案，在四个美国中西部州的4个不同位置播种和生长欲测试的玉米种子。
依据实施例2中描述的方案测定玉米食虫的破坏。
表2(A).在不同生长位置玉米食虫对异杂交玉米植物和仅具有转基因事件Cry3Bb.11231以及具有其与用吡虫啉杀虫剂进行种子处理的组合的玉米植物的破坏。
注解关于异杂交体对照的数据是按照与在相邻的试验田中进行的相关方案相同的方式获得的。
数据表明，单独的转基因事件和单独的用吡虫啉处理种子都提供了超过未处理异杂交体对照的一定水平的抗玉米食虫保护作用。在较高的破坏水平(即4-6的破坏水平)，具有转基因事件的玉米遭受的破坏是非转基因对照的破坏的4.7％。因为4.7％可视为约5％，所以Cry3Bb.11231事件可认为在非转基因对照的破坏的约5％-约50％的优选有效范围内。
仅用吡虫啉以400g/100kg处理种子能有效地抗玉米食虫破坏，但是吡虫啉的有效性低于单独的转基因事件。用吡虫啉处理转基因种子的组合抗食虫破坏的有效性高于单独的杀虫剂处理或单独的转基因事件。此外，Cry3Bb.11231与以400g/100kg种子施用的吡虫啉的组合提供的保护作用好于在播种时作为表面条带施用的FORCE或LORSBAN的商业标准处理。
用吡虫啉处理转基因种子的优点包括由于无需单独施用杀虫剂而简化了的播种。此外，播种更容易和更安全，这是因为播种者不用必须操作浓的杀虫剂。
以3-6的食虫破坏水平测试吡虫啉种子处理与具有Cry3Bb.11231转基因事件的组合的可能协同作用。在如表2(A)所示的第一个试验中，测定了对照种子、用杀虫剂以两个水平处理的种子以及具有单独和组合的转基因事件的种子的具有3-6破坏水平(Iowa 1-6等级)的试验植物的百分比。使用下述公式计算“协同作用阈值”(Cry3Bb.11231的％对照)×(吡虫啉处理的％对照)/100比较该阈值与处理组合(即Cry3Bb.11231与吡虫啉@400g/100kg的组合)占对照的百分比。如果该处理组合占对照的百分比低于该阈值，则该组合有协同作用。如果该处理组合占对照的百分比高于该阈值，则该组合没有表现出协同作用。
相信在较高破坏水平(即3-6的水平)测定食虫破坏是与随后的由于这种破坏引起的产量损失有关的有用指标。原因是在1和2水平的食虫破坏很少引起玉米植物倒下和倒伏，并且我们不认为这样的最小根部损失能减少每穗玉米的粒的数目或重量。然而，在3以及3以上水平的根部破坏可不断地引起植物倒伏和产量损失。因此，相信3-6(在某些情况下4-6以及5和6)的总破坏水平提供了玉米食虫破坏对随后的玉米产量的影响的有用指示。
表2(B).单独的或者与玉米转基因事件Cry3Bb.11231组合的吡虫啉种子处理抗3-6水平(Iowa 1-6等级)的玉米食虫破坏的效力。
该分析表明，玉米Cry3Bb.11231转基因事件与用吡虫啉以400g/100kg处理种子的组合表现出抗3-6水平的玉米食虫破坏的协同且意想不到的效力。因此，可以推断出，该转基因事件与吡虫啉种子处理的组合提供了显著优于单独使用任一种方法的优点，并且这样的保护在抗玉米食虫的严重破坏方面具有意想不到的优良效力。
相信还值得注目的是，吡虫啉与转基因事件的组合提供的抗玉米食虫严重破坏的保护作用远好于作为表面条带施用的FORCE或LORSBAN提供的保护作用。
实施例4测定玉米种子中的转基因事件Cry3Bb.11231与七氟菊酯杀虫剂种子处理的组合抗西部和北部玉米食虫的效力的大田试验。
测定玉米种子中转基因事件Cry3Bb.11231与用七氟菊酯(作为RAZE得自Wilbur-E1lis Company)处理的组合的效力的大田试验可依据实施例3中描述的相同方案来进行，但是在其中吡虫啉以预计能有效地抗玉米食虫的水平使用(例如以高于60g/100kg种子的水平使用)的每一情况下用七氟菊酯代替吡虫啉。如果需要的话，可继续以60g/100kg或更低的水平使用吡虫啉以进行抗金针虫保护。
可以预计，七氟菊酯种子处理与玉米种子中具有抗玉米食虫的有效性的转基因事件的组合将提供类似于实施例3所示的吡虫啉与Cry3Bb.11231的组合的协同保护作用。
关于本文所引用的参考文献的讨论仅是为了概括总结其作者的宣称，决不是承认构成现有技术的任何参考文献。本申请人保留对所引用文献的正确性和有关性怀疑的权利。
从上面可以看出，实现了本发明的几个优点，并获得了其它有利结果。
在不背离本发明范围的情况下，可对上述方法和组合物作各种改变，但是应当理解，包含在上述说明中的所有方案都是为了说明而不是限制。
权利要求
1.保护转基因玉米植物抗一种或多种害虫噬食性破坏的方法，所述方法包括提供转基因玉米植物的种子，所述种子包含具有抗一种或多种害虫当中至少一种的活性的转基因事件；和用有效量的杀虫剂处理种子。
2.权利要求1的方法，其中所述转基因事件包含表达Cry3蛋白的能力。
3.权利要求2的方法，其中所述转基因事件包含表达Cry3*蛋白的能力。
4.权利要求3的方法，其中所述Cry3*蛋白是Cry3B*蛋白。
5.权利要求4的方法，其中所述Cry3B*蛋白选自Cry3Bb.11230、Cry3Bb.11231、Cry3Bb.11232、Cry3Bb.11233、Cry3Bb.11234、Cry3Bb.11235、Cry3Bb.11236、Cry3Bb.11237、Cry3Bb.11238、Cry3Bb.11239、Cry3Bb.11241、Cry3Bb.11242和Cry3Bb.11098。
6.权利要求5的方法，其中所述Cry3B*蛋白是Cry3Bb.11231。
7.权利要求5的方法，其中所述Cry3B*蛋白是Cry3Bb.11098。
8.权利要求2的方法，其中所述转基因事件能够减轻玉米食虫引起的破坏，以使得在相同条件下对转基因玉米的破坏是对非转基因玉米的破坏的约5％-约50％，其中这样的破坏是以具有通过Iowa CornRootworm 1-6等级测定的4-6级的玉米植物的百分比表示的。
9.权利要求8的方法，其中所述转基因事件能够减轻玉米食虫引起的破坏，以使得在相同条件下对转基因玉米的破坏是对非转基因玉米的破坏的约10％-约40％，其中这样的破坏是以具有通过Iowa CornRootworm 1-6等级测定的4-6级的玉米植物的百分比表示的。
10.权利要求9的方法，其中其中所述转基因事件能够减轻玉米食虫引起的破坏，以使得在相同条件下对转基因玉米的破坏是对非转基因玉米的破坏的约15％-约30％，其中这样的破坏是以具有通过IowaCorn Rootworm 1-6等级测定的4-6级的玉米植物的百分比表示的。
11.权利要求10的方法，其中其中所述转基因事件能够减轻玉米食虫引起的破坏，以使得在相同条件下对转基因玉米的破坏是对非转基因玉米的破坏的约20％-约30％，其中这样的破坏是以具有通过Iowa Corn Rootworm 1-6等级测定的4-6级的玉米植物的百分比表示的。
12.权利要求2的方法，其中所述具有表达Cry3蛋白的能力的种子还具有表达至少一种不同于Cry3蛋白的其它杀昆虫蛋白的能力。
13.权利要求2的方法，其中所述具有表达Cry3蛋白的能力的种子还具有提供除草剂耐受性的转基因事件。
14.权利要求13的方法，其中所述转基因事件提供抗草甘膦的除草剂耐受性。
15.权利要求2的方法，其中所述转基因事件具有抗昆虫的活性。
16.权利要求15的方法，其中所述昆虫选自鳞翅目、鞘翅目和半翅目昆虫。
17.权利要求16的方法，其中所述昆虫是鞘翅目昆虫。
18.权利要求17的方法，其中所述昆虫是条叶甲属昆虫。
19.权利要求18的方法，其中所述昆虫包括至少一种选自下列的昆虫玉米幼芽根叶甲、Diabrotica barberi和十一星瓜叶甲。
20.权利要求2的方法，其中所述杀虫剂选自杀昆虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂和除草剂。
21.权利要求20的方法，其中所述杀虫剂是杀昆虫剂。
22.权利要求21的方法，其中所述杀虫剂选自除虫菊酯和合成拟除虫菊酯、噁二嗪衍生物类、chloronicotinyls类、硝基胍衍生物类、三唑类、有机磷酸酯类、吡咯类、吡唑类、苯基吡唑类、二酰基肼类、生物/发酵产物和氨基甲酸酯类。
23.权利要求22的方法，其中所述杀虫剂选自除虫菊酯，包括2，2-二甲基-3-(2-甲基丙烯基)-环丙烷甲酸的2-烯丙基-4-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮酯，和/或(2-甲基-1-丙烯基)-2-甲氧基-4-氧代-3-(2-丙烯基)-2-环戊烯-1-基酯及其顺式和反式异构体的混合物；合成拟除虫菊酯，包括(S)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基4-氯-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(杀灭菊酯)、(S)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(S)-4-氯-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(高氰戊菊酯)、(3-苯氧基苯基)-甲基(+)顺式-反式-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(氯菊酯)、(±)α-氰基-(3-苯氧基苯基)甲基(+)-顺式，反式-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基-环丙烷甲酸酯(氯氰菊酯)、乙体氯氰菊酯、辛体氯氰菊酯、S-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(±)顺式/反式3-(2，2-二氯乙烯基)2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(己体氯氰菊酯)、(S)-α-氰基-3-苯氧基苄基(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(溴氰菊酯)、α-氰基-3-苯氧基苄基2，2，3，3，-四甲基环丙烷甲酸酯(甲氰菊酯)、(RS)-α-氰基-3-苯氧基苄基(R)-2-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氨基]-3-甲基丁酸酯(氟胺氰菊酯)、(2，3，5，6-四氟-4-甲基苯基)-甲基-(1α，3α)-(Z)-(±)-3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(七氟菊酯)、(±)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(±)-4-(二氟甲氧基)-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(氟氰戊菊酯)、氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲基3-[2-氯-2-(4-氯苯基)乙烯基]-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(氟氯苯菊酯)、氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲基3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基-环丙烷甲酸酯(氟氯氰菊酯)、β-氟氯氰菊酯、四氟菊酯、(S)-α-氰基-3-苯氧基苄基(Z)-(1R-顺式)-2，2-二甲基-3-[2-(2，2，2-三氟-三氟甲基-乙氧基羰基)乙烯基]环丙烷甲酸酯(氟酯菊酯)、α-氰基-3-苯氧基苄基-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯的(1R顺式)S和(1S顺式)R对映异构体对(甲体氯氰菊酯)、[1R，3S)3(1′RS)(1′，2′，2′，2′-四溴乙基)]-2，2-二甲基环丙烷甲酸(S)-α-氰基-3-苯氧基苄基酯(四溴菊酯)、氰基-(3-苯氧基苯基)甲基2，2-二氯-1-(4-乙氧基苯基)环丙烷甲酸酯(乙氰菊酯)、[1α，3α(Z)]-(±)-氰基-(3-苯氧基苯基)甲基3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯((RS)氯氟氰菊酯)、[1α(S)，3α(Z)]-氰基(3-苯氧基苯基)甲基3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基环丙烷甲酸酯(氯氟氰菊酯)、(2-甲基[1，1′-联苯]-3-基)甲基3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基-环丙烷甲酸酯(氟氯菊酯)、5-1-苄基-3-呋喃基甲基-d-顺式(1R，3S，E)2，2-二甲基-3-(2-氧代，-2，2，4，5-四氢亚噻吩基甲基)环丙烷甲酸酯(噻嗯菊酯)、[5-(苯基甲基)-3-呋喃基]-3-呋喃基2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)环丙烷甲酸酯(苄呋菊酯)、(1R-反式)-[5-(苯基甲基)-3-呋喃基]甲基2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)环丙烷甲酸酯(右旋反灭虫菊酯)、3，4，5，6-四氢邻苯二甲酰亚氨基甲基(1RS)-顺式-反式-菊酸酯(胺菊酯)、3-苯氧基苄基d，1-顺式，反式2，2-二甲基-3-(2-甲基丙烯基)环丙烷甲酸酯(苯醚菊酯)、烯炔菊酯、苯醚氰菊酯、烯酮菊酯、咪炔菊酯、(RS)-3-烯丙基-2-甲基-4-氧代环戊-2-烯基(1A，3R；1R，3S)-2，2-二甲基-3-(2-甲基丙-1-烯基)环丙烷甲酸酯(丙烯除虫菊)、反丙烯除虫菊和ZXI8901；噁二嗪衍生物类，包括5-(2-氯吡啶-5-基甲基)-3-甲基-4-硝基亚氨基全氢化-1，3，5-噁二嗪、3-甲基-4-硝基亚氨基-5-(1-氧化-3-吡啶基甲基)全氢化-1，3，5-噁二嗪、5-(2-氯-1-氧化-5-吡啶基甲基)-3-甲基-4-硝基亚氨基全氢化-1，3，5-噁二嗪和3-甲基-5-(2-甲基吡啶-5-基甲基)-4-硝基亚氨基全氢化-1，3，5-噁二嗪；chloronicotinyl类杀昆虫剂，包括啶虫清((E)-N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N′-氰基-N-甲基乙脒)、吡虫啉(1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-硝基-2-咪唑烷亚胺)和硝胺烯啶(N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-乙基-N′-甲基-2-硝基-1，1-乙二胺)；硝基胍类杀昆虫剂；吡咯类；吡唑类，包括氟唑虫清(4-溴-2-(4-氯苯基)-1-乙氧基甲基-5-三氟甲基吡咯-3-甲腈)、唑螨酯((E)-1，1-二甲基乙基酯)-4-[[[[(1，3-二甲基-5-苯氧基-1H-吡唑-4-基)亚甲基]氨基]氧基]甲基]苯甲酸和吡螨胺(4-氯-N-[[4-1，1-二甲基乙基)苯基]甲基]-3-乙基-1-甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺)；苯基吡唑类，包括锐劲特(5-氨基-[2，6-二氯-4-(三氟甲基)苯基]-4-[(1R，S)-(三氟甲基)亚磺酰基]-1H-吡唑-3-甲腈)；二酰基肼类，包括特丁苯酰肼(4-氯苯甲酸-2-苯甲酰基-2-(1，1-二甲基乙基)-酰肼)、甲氧苯酰肼(RH-2485；N-叔丁基-N′-(3-甲氧基-邻甲苯甲酰基)-3，5-二甲苯酰肼)和双苯酰肼(3，5-二甲基苯甲酸1-(1，1-二甲基乙基)-2，(4-乙基苯甲酰基)酰肼)；三唑类，包括杀草强和唑蚜威；生物/发酵产物，包括齐墩螨素(阿维菌素)和艾克敌105(XDE-105)；有机磷酸酯类杀昆虫剂，包括高灭磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、二嗪农、克线磷和马拉松；和氨基甲酸酯类杀昆虫剂，包括涕灭威、甲萘威、呋喃丹、甲氨叉威和硫双威。
24.权利要求20的方法，其中所述杀虫剂包括噁二嗪衍生物类。
25.权利要求24的方法，其中所述噁二嗪衍生物类包括5-(2-氯吡啶-5-基甲基)-3-甲基-4-硝基亚氨基全氢化-1，3，5-噁二嗪、3-甲基-4-硝基亚氨基-5-(1-氧化-3-吡啶基甲基)全氢化-1，3，5-噁二嗪、5-(2-氯-1-氧化-5-吡啶基甲基)-3-甲基-4-硝基亚氨基全氢化-1，3，5-噁二嗪和3-甲基-5-(2-甲基吡啶-5-基甲基)-4-硝基亚氨基全氢化-1，3，5-噁二嗪。
26.权利要求20的方法，其中所述杀虫剂包括chloronicotinyl类杀昆虫剂。
27.权利要求26的方法，其中所述chloronicotinyl类杀昆虫剂包括啶虫清((E)-N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N′-氰基-N-甲基乙脒)、吡虫啉(1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-硝基-2-咪唑烷亚胺)和硝胺烯啶(N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-乙基-N′-甲基-2-硝基-1，1-乙二胺)。
28.权利要求20的方法，其中所述杀虫剂包括硝基胍类杀昆虫剂。
29.权利要求20的方法，其中所述杀虫剂是草甘膦。
30.权利要求22的方法，其中所述转基因事件包含表达选自下列的蛋白的能力Cry3Bb.11230、Cry3Bb.11231、Cry3Bb.11232、Cry3Bb.11233、Cry3Bb.11234、Cry3Bb.11235、Cry3Bb.11236、Cry3Bb.11237、Cry3Bb.11238、Cry3Bb.11239、Cry3Bb.11241、Cry3Bb.11242和Cry3Bb。
31.权利要求30的方法，其中所述杀虫剂选自吡虫啉和七氟菊酯。
32.权利要求31的方法，其中所述杀虫剂包括吡虫啉。
33.权利要求32的方法，其中所述转基因事件包含表达Cry3Bb.11231蛋白的能力。
34.权利要求32的方法，其中所述转基因事件包含表达Cry3Bb.11098蛋白的能力。
35.权利要求31的方法，其中所述杀虫剂是七氟菊酯。
36.权利要求35的方法，其中所述转基因事件包含表达Cry3Bb.11231蛋白的能力。
37.权利要求35的方法，其中所述转基因事件包含表达Cry3Bb.11098蛋白的能力。
38.权利要求22的方法，其中所述杀虫剂的有效量为至少约10克至约2000克杀虫剂活性组分/100千克种子。
39.权利要求38的方法，其中所述杀虫剂的有效量为至少约70克至约1000克杀虫剂活性组分/100千克种子。
40.权利要求39的方法，其中所述杀虫剂的有效量为至少约100克至约600克杀虫剂活性组分/100千克种子。
41.权利要求40的方法，其中所述杀虫剂的有效量为至少约200克至约500克杀虫剂活性组分/100千克种子。
42.转基因玉米植物种子，所述种子给所生长出的玉米植物提供了增强的抗一种或多种害虫噬食性破坏的抵抗性，其中所述种子包含具有抗一种或多种害虫当中至少一种的活性的转基因事件，并且所述种子已经用有效量的杀虫剂处理过。
43.权利要求42的种子，其中所述转基因事件能够表达源自苏云金芽孢杆菌的Cry3蛋白。
44.权利要求43的种子，其中所述转基因事件能够表达源自苏云金芽孢杆菌的Cry3Bb蛋白。
45.权利要求43的种子，其中所述转基因事件能够表达源自苏云金芽孢杆菌的Cry3Bb.11230、Cry3Bb.11231、Cry3Bb.11232、Cry3Bb.11233、Cry3Bb.11234、Cry3Bb.11235、Cry3Bb.11236、Cry3Bb.11237、Cry3Bb.11238、Cry3Bb.11239、Cry3Bb.11241、Cry3Bb.11242或Cry3Bb.11098蛋白。
46.已经通过权利要求22的方法处理过的转基因玉米种子。
全文摘要
保护玉米植物抵抗一种或多种害虫噬食性破坏的方法，包括将具有抗至少一种害虫的转基因事件的玉米种子用抗相同或另外一种或多种害虫的有效量的杀虫剂处理。还公开了具有这样的保护作用的种子。
文档编号C12N15/29GK1476295SQ01816991
公开日2004年2月18日 申请日期2001年10月2日 优先权日2000年10月6日
发明者J·阿萨, F·C·科恩, E·F·桑德斯, J 阿萨, 桑德斯, 科恩 申请人:孟山都技术有限公司