专利名称：一种微生物抗水稻恶苗病剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物抗水稻恶苗病剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。
背景技术：
水稻恶苗病病原菌(Fusarium monilifome)是水稻生产中重要的种传病害，水稻种子上携带的病原菌分生孢子是主要的初侵染源。该病害的流行可造成水稻减产10％～20％，严重的可减产50％以上，近年来由于长期使用相同种类的化学农药，导致病原菌产生抗药性，使该病害的发生有增长的趋势。同时由于大量施用化学药剂，使作物中农药残留量增加，天敌被大量杀伤，农田的生态平衡被破坏和环境被污染，随着我国加入WTO和人们对环境生态保护的日趋重视，我国农药业正面临着严峻的形势。
生物防治以其无污染，无残留，无生态毒性和安全性好等优点在植物病虫害的防治中起着主导作用。大力发展生物农药对我国具有非常重要的现实意义。微生物源农药是新农药创制的重要源头，具有研究周期短、投入低、易于工业化和商品化开发的优势，且对人畜安全，易于分解，与环境相容，自上个世纪90年代以来，微生物农药每年以20％的速度递增，已成为农业生物技术产业中的研究开发热点之一。我国微生物资源丰富，发展微生物农药具有充分的优势。近年来人们通过大量筛选和利用抗水稻恶苗病病原菌的有益微生物及其代谢产物，使微生物防治正日益成为水稻恶苗病控制中的一条重要而有效的途径。
发明内容
本发明的目的是通过对筛选到的一株具有防治水稻恶苗病活性的链霉菌进行研究，开发微生物抗水稻恶苗病剂。
本发明筛选到一株对水稻恶苗病具有很好防治作用的除虫链霉菌Streptomyces avermitilis ECO00005，ECO 00005菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京；保藏日期2006年4月17日；保藏登记入册编号为CGMCC No.1681。
本发明Streptomyces avermitilis ECO 00005菌株形态特征为菌落白色，圆形，表面毛绒状，边缘有较多菌丝生长，菌落中部突起，少有气丝，形成中央无气丝圆圈，菌落不均匀突起，呈现出3-4瓣的花瓣状；基内菌丝和气生菌丝为丝状，不规则分支，一般不断裂；气生菌丝上形成长孢链，直形或波形或螺旋形，孢子圆形、椭圆形至杆状。
本发明是这样实现的制备微生物抗水稻恶苗病剂1、试管种培养将菌株ECO 00005接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；琼脂20g；水1000ml；pH 7.2，于28℃下培养6天，获得试管种。(复合维生素组成为维生素B11.0mg/L，维生素B61.0mg/L，核黄素1.0mg/L，烟酸1.0mg/L，苯丙氨酸1.0mg/L，生物素1.0mg/L，丙氨酸0.3mg/L，下同)2、液体种子培养采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；水1000ml；pH 7.2，在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养2天。
3、制备微生物抗水稻恶苗病剂采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g；甘露醇20g；水1000ml；pH 7.8，在每个三角瓶中装入100ml液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10ml上述方法2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液。在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的微生物抗水稻恶苗病剂。
将上述方法制备得到的微生物抗水稻恶苗病剂，采用室内毒力测定(抑制孢子萌发法、平板抑菌试验法)及活体药效试验(温室盆栽活体试验)相结合的方法，试验该制剂对水稻恶苗病的防治作用。
室内毒力测定结果表明用上述方法制备得到的菌株ECO 00005抗水稻恶苗病剂在抑制孢子萌发法试验中，对水稻恶苗病病原菌孢子萌发的抑制率为100％；在平板抑菌试验法中，对水稻恶苗病病原菌的抑菌圈直径平均为18.7mm(3次重复)，两项试验表明该制剂对水稻恶苗病病原菌具有较强的抑制活性。
温室盆栽活体试验结果表明菌株ECO 00005抗水稻恶苗病剂对盆栽水稻苗表现出了较好的防治效果，其对水稻恶苗病的防治效果经计算为90.56％。
利用本发明生产的制剂对水稻恶苗病具有较好的离体及活体防治效果，可用于水稻恶苗病的防治。本发明具有原料成本低，生产工艺简单，防治效果好的优点，具有较好的应用前景。
具体实施例方式实施例一抑制孢子萌发法试验1、制备试验用抗水稻恶苗病剂本发明的微生物抗水稻恶苗病剂，由生产菌株(Streptomyces avermitilis)ECO 00005菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同。
2、制备水稻恶苗病病原菌将公知的水稻恶苗病病原菌(Fusarium monilifome)接种到试管固体培养基斜面上28℃下培养，培养基配方为常用的PDA培养基，该培养基制法是取马铃薯200g去皮后切成小块，加水1000ml煮沸20分钟，过滤后得到1000ml滤液，然后加入葡萄糖20g，琼脂20g，pH自然，待菌丝长满培养基，6-7天产孢后，用蒸馏水洗下孢子，并稀释成浓度为在10×10低倍显微镜下，每个视野40-50个孢子的恶苗病病原菌孢子悬浮液备用。
3、抑制孢子萌发试验方法将抗水稻恶苗病剂供试样品与配制好的水稻恶苗病病原菌孢子悬浮液等体积混合，平铺于水琼脂培养基上，培养基配方为葡萄糖10g，琼脂10g，水1000ml，pH自然，每处理3个重复，同时设清水为空白对照。在28℃下保湿培养24小时后察看空白对照孢子的萌发情况，以芽管长度超过分生孢子小端直径一半时为萌发。当空白对照孢子的萌发率达到95％后，察看抗水稻恶苗病剂供试样品对水稻恶苗病病原菌孢子萌发的抑制情况。
按以下公式计算孢子萌发抑制率孢子萌发抑制率(％)＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/(对照孢子萌发率)×100实验结果表明菌株ECO 00005抗水稻恶苗病剂供试样品对水稻恶苗病病原菌孢子的萌发抑制率为100％。
实施例二平板抑菌试验本发明的微生物抗水稻恶苗病剂，由生产菌株(Streptomyces avermitilis)ECO 00005菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同，水稻恶苗病病原菌的制备同抑制孢子萌发法中的方法。
平板抑菌试验将培养好的水稻恶苗病病原菌取0.5cm2大的试管种斜面与10ml PDA培养基(制法同抑制孢子萌发法中的方法)混合均匀，倒入内径为9cm的已灭菌培养皿中制成带菌平板，平板抑菌实验采用常规的滤纸片法，即在每个带菌平板上放置3个直径为5mm的灭菌滤纸片，其中的1个滤纸片上点滴45ppm的施保克(prochloraz)药剂为阳性对照，另1个滤纸片点滴无菌清水作为空白对照，剩余2个滤纸片上滴加制备好的微生物抗水稻恶苗病剂供试样品15μL，每处理3个重复，放置于28℃培养箱中培养48小时后，用十字交叉法测定抑菌圈直径。
表1.微生物抗水稻恶苗病剂对水稻恶苗病病原菌的抑菌结果
实验结果表明菌株ECO 00005抗水稻恶苗病剂供试样品对水稻恶苗病病原菌的抑菌圈直径平均为18.7mm。
实施例三温室盆栽活体试验本发明的微生物抗水稻恶苗病剂，由生产菌株(Streptomyces avermitilis)ECO 00005菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同，水稻恶苗病病原菌的制备同抑制孢子萌发法中的方法。具体试验步骤为本实验采用的水稻品种为采自云南省昆明市嵩明县的感染了恶苗病菌的带菌蒙古稻。
用抗水稻恶苗病剂供试样品浸种48小时，取出稻种，置于清水中，30℃下催芽24小时，待种子萌芽时，均匀播于装有秧田土的长宽为5×15cm，深10cm的塑料育苗盒内，表面覆盖薄土，每盒50苗，在温度为28-30℃的温室内培养，按0.2克/盒追施尿素，共施2-3次。分别在3叶期和移栽至大田前进行发病株率调查，记录病株数，计算防治效果。
防治效果(％)＝(对照组病株率-处理组病株率)/对照组病株率×100。
温室盆栽活体试验结果表明菌株ECO 00005抗水稻恶苗病剂供试样品对水稻恶苗病表现出了较好的防治效果，其对水稻恶苗病的防治效果经计算为90.56％。
权利要求
1.一种微生物抗水稻恶苗病剂，其特征在于该制剂的生产菌株为除虫链霉菌Streptomycesavermitilis ECO 00005，ECO 00005菌株已于2006年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1681。
2.权利要求1所述微生物抗水稻恶苗病剂的制备方法，其特征在于(1)试管种培养为将菌株ECO 00005接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；琼脂20g；水1000ml；pH 7.2，于28℃下培养6天，获得试管种；(2)液体种子培养为采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；水1000ml；pH 7.2，在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养2天；(3)制备微生物抗水稻恶苗病剂采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g；甘露醇20g；水1000ml；pH 7.8，在每个三角瓶中装入100ml液体发酵培养基，120℃灭菌30分钟，冷却后接入10ml上述方法(2)中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的微生物抗水稻恶苗病剂。
3.权利要求1所述的微生物抗水稻恶苗病剂，其特征在于该制剂对水稻恶苗病具有较好的离体及活体防治效果，可用于水稻恶苗病的防治。
全文摘要
本发明涉及一种微生物抗水稻恶苗病剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。该制剂的制备工序包括微生物菌株试管种培养、菌株液体种子培养、菌株液体发酵培养。本发明的生产菌株为除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)ECO 00005，该菌株已于2006年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1681。利用本发明生产的制剂对水稻恶苗病具有较好的离体及活体防效，可用于水稻恶苗病的防治。本发明具有原料成本低，生产工艺简单，防治效果好的优点，具有较好的应用前景。
文档编号A01P3/00GK1926993SQ200610048660
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月6日 优先权日2006年9月6日
发明者崔晓龙, 尚慧, 文孟良, 杨佩文, 李铭刚, 刘树芳, 李一青, 李家瑞 申请人:云南大学