一种提高植物中水杨酸含量的方法及其专用载体的制作方法

专利名称：一种提高植物中水杨酸含量的方法及其专用载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高植物中水杨酸含量的方法及其专用载体。
背景技术：
水杨酸(Salicylic acid，SA)是一种酚类化合物，结构式见式I。纯品为粉状结晶，可溶于水，易溶于极性有机溶剂，熔点为157-159℃，干燥后易升华(原永兵，曹宗巽。1994.水杨酸在植物体内的作用，植物学通报11(3)1-9)。
式I水杨酸在植物体内普遍存在，包含游离态和结合态的水杨酸，经研究，外源施加水杨酸可以影响到植物体气孔开闭、种子萌发、果实产量、离子吸收、产热、开花、性别分化和抑制乙烯的生物合成等生理活动，因而SA及其盐类被认为是一类新的植物激素。到了20世纪90年代，水杨酸作为植物的一种重要的抗胁迫信号分子得到广泛研究(刘悦萍，宫飞，赵晓萌。2005.水杨酸介导的信号转导途径与植物抗逆性.中国农学通报21(7)227-269)。
研究表明，某些双子叶植物在受到细菌、病毒、真菌侵染后，侵染部位的SA水平便显著增加，同时出现坏死病斑，即过敏反应(Hypersensitive，HR)；由此引起非感染部位SA含量也升高，继而对同一病原或其它病原的再侵染产生抗性，即系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)。植物在接受到病原菌这一原初信号之后，首先合成SA，并被侵染点的细胞受体接受，引起侵染叶片的HR反应，并使植物获得局部获得性抗性(local acquired resistance，LAR)。SA由侵染叶片运输到非侵染叶片，使植株获得SAR。对于诱导SAR的可转移的信号分子是SA还是其它某种未知分子，存在着两种不同的观点一种观点认为引起SAR反应的信号分子是SA，当病源侵染后，在侵染的部位SA大量积累，并通过维管组织运输到非侵染部位，使植物产生了SAR；而另一种观点认为引起SAR反应的是另一种信号分子而非SA，SA只是参与了SAR反应(刘悦萍，宫飞，赵晓萌。2005.水杨酸介导的信号转导途径与植物抗逆性.中国农学通报21(7)227-269)。
在单子叶植物中也可以产生SAR反应。如果用不能与粉状霉菌共生的菌株来侵染大麦和小麦，则使大麦和小麦获得了对粉状霉菌的抗性(Ouchi S，Oku H，HibinoC.1976.Localization of induced resistance and susceptibility in barleyleaves inoculated with the powdery mildew fungus.Phytopathology.66901-905)。当把水稻下部的叶子用Pseudomonas syringae侵染后，上部的水稻叶片就产生了对Magnapovthe grisea强烈的抗性(Smith JA，Métraux J-P.1991.Pseudomonassyringae pv.Syringae induces systemic resistance to Pyricularia oryzae inrice.Physiol Mol Plant Pathol.39451-461)。水杨酸的类似物可以诱导水稻产生SAR，产生对M.grisea和Xanthamonas oryzae的抗性(Métraux J-p，Ahl-Goy P.1991.Induced systemic resistance in cucumber in response to2，6-dichloro-isonicotinic acid and pathogens.In HHennecke，DPS Verna，eds，Advances in Molecular Genetics and Plant Microbe Interactions.Kluwer.Dordrecht，The Netherlands，432-439)，但是对水稻外源施加SA，并不能像烟草一样诱导产生SAR反应。产生上述现象可能是由于SA在水稻抗逆中是个第二信使，或者在水稻中发挥着其它的生物功能(Silverman P，Seskar M，Kanter D，Schweizer P，Métraux J-p，Raskin L.1995.Salicylic acid in rice.Plant Physiol.108633-639)。
水稻中SA的含量远高于其它作物，可能是抵抗病原侵染的天然屏障。在Yang等的研究中，通过过量表达细菌的水杨酸羟化酶nahG基因来降低水稻中SA的含量，发现转基因水稻表现出一种对病源侵染和除草剂百草枯引起的氧化伤害非常敏感(YangY，Qi M and Mei C.2004.Endogenous salicylic acid protects rice plants fromoxidative damage caused by aging as well as biotic and abiotic stress.ThePlant Journal.40909-919)，说明水稻中内源性的SA起到了抗氧化的重要作用，可以增强水稻对氧化逆境的耐受性。上述研究结果表明水杨酸在植物的抗病中发挥重要作用。
一般认为在植物体内，属于简单酚类化合物的SA的生物合成是走莽草酸途径，形成反式肉桂酸，反式肉桂酸的侧链经氧化或邻羟基化两种不同反应顺序转变成SA(见图1A)(Spiegel，S.et.al.，1989.Phylopathology.79253-262)。这两条途径在植物体内可能同时存在，其区别在于β-氧化和羟基化的先后顺序不同。其中的酶，尤其是催化苯甲酸或邻香豆酸转化为SA的酶还不清楚。
在特定的假单孢属中，假单孢菌借助一个很短的合成途径通过分支酸(chorismate)来产生SA(合成途径见图1B，①反应由异分支酸合成酶(ICS，isochorismate synthase)催化；②反应由异分支酸-丙酮酸裂解酶(IPL，isochorismate pyruvate lyase)催化)(Gaille C，Kast P，and Haas D.2002.Salicylate biosynthesis in Pseudomonasaeruginosa.The Journal of Biological Chemistry.277(24)21768-21775)，分支酸通常是芳香族的前体。与植物的SA合成不同，假单孢菌SA的合成首先通过异分支酸合成酶(ICS，isochorismate synthase)将分支酸转变为异分支酸，再通过异分支酸-丙酮酸裂解酶(IPL，isochorismate pyruvate lyase)将异分支酸裂解为丙酮酸和水杨酸。
人们对植物中SA途径的具体步骤还了解很少，但是对微生物中SA合成途径的研究已经很清楚。一些微生物的SA合成途径简单明确，底物为分支酸。而分支酸作为植物莽草酸酯代谢途径的终产物也存在于植物中。
水杨酸是阿司匹林(乙酰水杨酸)的药效成分，该药的作用和用途有解热作用、镇痛作用、抗炎抗风湿效应、抗血小板凝集作用、抑制肠分泌引起的腹泻、增加体内胰岛素的含量、抑制某些前列腺素的合成、升高胃酸浓度、治疗早期老年性白内障、降低直肠癌的发生机率等。但是长期服用化学方法合成的乙酰水杨酸会对胃产生不良影响，而天然植物和水果中的阿司匹林类似成分没有相关的副作用，但是含量过低，很难满足医疗和保健的需求，且提取和纯化的成本较高。现在人们多以白柳树皮为原料提取天然的阿司匹林类似物，但是自柳树资源有限，且被剥去皮的柳树很难有其它的利用价值。因此迫切需要一种提高植物中水杨酸含量的方法。

发明内容
本发明的目的是提供一种提高植物中水杨酸含量的专用载体。
本发明所提供的用于提高植物中水杨酸含量的载体，是含有异分支酸合成酶基因(ICS)和异分支酸-丙酮酸裂解酶基因(IPL)的植物表达载体。
上述载体中的异分支酸合成酶基因的来源是广泛的，如拟南芥、大肠杆菌或绿脓假单孢杆菌等，其中，来源于拟南芥的异分支酸合成酶基因(icsl)的GenBank号为AY056055，来源于大肠杆菌的异分支酸合成酶基因(entC)的GenBank号为M24142，来源于绿脓假单孢杆菌的异分支酸合成酶基因(pchA)的GenBank号为X82644；所述异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的来源也是广泛的，如荧光假单孢菌或绿脓假单孢杆菌等，其中，来源于荧光假单孢菌的异分支酸-丙酮酸裂解酶基因(pmsB)的GenBank号为Y09356，来源于绿脓假单孢杆菌的异分支酸-丙酮酸裂解酶基因(pchB)的GenBank号为X82644。
由于莽草酸酯代谢途径的终产物-分支酸主要产生于叶绿体中，因此，为获得更好的转基因效果，所述载体中的异分支酸合成酶基因和异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的5’端还紧密连接有叶绿体定位信号肽的编码序列。
所述叶绿体定位信号肽编码序列的选择是多种多样的，既可以为异分支酸合成酶基因和/或异分支酸-丙酮酸裂解酶基因自带的，如拟南芥的异分支酸合成酶基因(icsl)自身带有的叶绿体定位信号肽的编码序列，也可以为其它基因的叶绿体定位信号肽的编码序列，如番茄中的二磷酸核酮糖羧化酶(ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase)小亚基的叶绿体定位信号肽的编码序列，其GenBank号为CAA29401。
在上述载体中的异分支酸合成酶基因和异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的上游还分别添加有组成型表达启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、Actin启动子或Ubiquitin等，优选为CaMV35S启动子；在异分支酸合成酶基因和异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的下游还分别添加有终止子，如CaMV35S终止子(T35S)或NOS终止子(Tnos)等。
用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pHOS(购于Invitrogen公司，原名为GatewayTMvector pH2GW7载体，此处简称为pHOS)、pCAMBIA系列载体(购于CAMBIA公司)或其它衍生植物表达载体。
此外，为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
以pHOS为出发载体，构建的用于提高植物中水杨酸含量的载体可为pmBE/pHOS、pcBE/pHOS、pmBA/pHOS、pcBI/pHOS或pmBI/pHOS。
本发明的第二个目的是提供一种提高植物中水杨酸含量的方法。
本发明所提供的提高植物中水杨酸含量的方法，是将上述专用载体导入植物组织或细胞，得到水杨酸含量获得提高的转基因植株。
本发明的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
上述提高植物中水杨酸含量的方法对所有植物都适用，既适用于水稻、小麦、玉米或高羊茅草等单子叶植物，也适用于柳树、甘草、板蓝根、大豆、白三叶或生菜等双子叶植物。
本发明提供了一种提高植物中水杨酸含量的方法及其专用载体。该方法从水杨酸合成途径出发，将不同的ICS基因和IPL基因组合导入植物。转基因实验结果表明，转基因水稻中游离态SA含量最高达到了野生型的29倍。本发明的方法及其专用载体将在植物(特别是水稻)中水杨酸含量的提高中发挥巨大作用，并为植物的品种改良提供了一条新的途径。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。


图1A为植物体内水杨酸合成的假设途径图lB为假单孢绿脓杆菌的水杨酸合成途径图1为用于提高植物中水杨酸含量的专用载体的构建示意2为用于提高植物中水杨酸含量的专用载体的结构示意简3为野生型水稻和不同ICS和IPL基因组合转基因T1代水稻叶片游离态SA含量的比较结果图4为转基因水稻叶片中外源基因表达量与游离态SA含量对应关系的半定量RT-PCR检测结果图5为高含量SA的转基因水稻中抗病相关基因的半定量RT-PCR检测结果图6为SA高表达转基因水稻中过氧化物含量的检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，可参考Sambrook et al.，2001，Molecular cloningA Laboratory Manual，所用引物序列由英俊公司、赛百盛公司合成。
试剂及仪器一般生化试剂购于北京化学试剂公司；反转录试剂盒和胶回收试剂盒为上海申能博彩生物科技有限公司产品；质粒小量提取试剂盒购于TIANGEN BIOTECH公司；Taq聚合酶和PFU聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶等酶试剂购于TaKaRa公司。层析仪型号为BioLogic DuoFlow Chromatography System，BioRad公司产品。C18反向柱为Develosil Packed Column(φ4.6×250mm)，购自Develosil公司。
实施例1、构建用于提高植物中水杨酸含量的载体现参照图1(按基因的功能分别用ICS和IPL代表相应的基因，IPL包括pmsB、pchB；ICS包括entC icsl、pchA。ss，叶绿体定位信号；35S，CaMV 35S启动子；Ter，35S终止子。)，构建用于提高植物中水杨酸含量的植物转化载体，具体方法如下
一、异分支酸合成酶基因(ICS)和异分支酸-丙酮酸裂解酶基因(IPL)的扩增1、来源于大肠杆菌的异分支酸合成酶基因(entC)的扩增以大肠杆菌DH5α的基因组DNA为摸板，在引物p15’-GGCAGAACGGCGCAGGACAT-3’和p25’-CGATAGCGACGGGCAAACTCTTC-3’的引导下，PCR扩增异分支酸合成酶基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度为1176bp的目的片段，经序列分析证明与预期结果相符。回收并纯化该DNA片段，将该基因命名为entC，GenBank号为M24142。
2、来源于拟南芥的异分支酸合成酶基因(icsl)的扩增以拟南芥的cDNA为模板，在引物p75’-ATGGCTTCACTTCAATTTTCTTCTC-3’和p85’-TCAATTAATCGCCTGTAGAGATGTT-3’的引导下，PCR扩增异分支酸合成酶基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度为1710bp的目的片段，经序列分析证明与预期结果相符。回收并纯化该DNA片段，将该基因命名为icsl，GenBank号为AY056055。
3、来源于绿脓假单孢杆菌的异分支酸合成酶基因(pchA)的扩增以绿脓假单孢杆菌PA01(P.aeraginosa，中科院微生物所1.1782)的基因组DNA为模板，在引物p95’-CGCGGATCCATGAGCCGGCTGGCGCCCCT-3’和p105’-GCGAAGCTTGGCGACGCCGCGCTGCAAG-3’的引导下，PCR扩增异分支酸合成酶基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度为1446bp的目的片段，经序列分析证明与预期结果相符。回收并纯化该DNA片段，将该基因命名为pchA，GenBank号为X82644。
4、来源于荧光假单孢菌的异分支酸-丙酮酸裂解酶基因(pmsB)的扩增以荧光假单孢菌(ATCC17400)的基因组DNA为模板，在嵌套引物p35’-CGCCATCGAATCAAACACAG-3’，p45’-TCAAGTCGTCAGGCATCCAC-3’，p55’-ATGCTGCCGCTAAAACCG-3’和p65’-TCATGACTTGGCCTGCGC-3’的引导下，PCR扩增异分支酸-丙酮酸裂解酶基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度为336bp的目的片段，经序列分析证明与预期结果相符。回收并纯化该DNA片段，将该基因命名为pmsB，GenBank号为Y09356。
5、来源于绿脓假单孢杆菌的异分支酸-丙酮酸裂解酶基因(pchB)的扩增以绿脓假单孢杆菌PA01(P.aeraginosa，中科院微生物所1.1782)的基因组DNA为模板，在引物p115’-CGCGGATCCATGATGAAAACTCCCGAAGACTGCA-3’和p125’-GCGAAGCTTTCATGCGGCACCCCGTGT-3’的引导下，PCR扩增异分支酸-丙酮酸裂解酶基因。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度为327bp的目的片段，经序列分析证明与预期结果相符。回收并纯化该DNA片段，将该基因命名为pmsB，GenBank号为X82644。
二、番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的叶绿体定位信号肽编码序列(ss)的扩增及与异分支酸合成酶基因、异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的融合1、番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的叶绿体定位信号肽编码序列(ss)的扩增以番茄的基因组DNA为模板，在引物p135’-ATGGCTTCCTCTGTCATTTC-3’和p145’-GCTAACTCTTCCACCATTGC-3’的引导下，PCR扩增番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的叶绿体定位信号肽的编码序列。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度为168bp的目的片段，经序列分析证明与预期结果相符。回收并纯化该DNA片段，将该片段命名为ss，GenBank号为CAA29401。
2、番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的叶绿体定位信号肽编码序列与异分支酸合成酶基因、异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的融合除icsl外(自带有叶绿体定位信号肽编码序列)，通过常规的重叠延伸PCR反应将entC、pmsB、pchA和pchB基因分别与番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因叶绿体定位信号肽编码序列ss进行融合，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增分别获得了长度为1176bp、336bp、309bp和1431bp的目的片段，经序列分析证明与预期结果相符。回收并纯化上述DNA片段，将四种融合基因分别命名为ss-entC、ss-pmsB、ss-pchA和ss-pchB。然后将四种融合基因片段及icsl分别克隆到中间载体pENTR/D-TOPO(Invitrogen公司)中，反应体系为目的DNA 2.3μl，pENTR/D-TOPO 0.25μl，Salt solution 0.45μl，混匀后，先在室温下反应5min，然后冰浴5min，反应结束后，将四种重组载体转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，筛选阳性克隆并提取质粒，得到分别携带有ss-entC、ss-pmsB、ss-pchA、ss-pchB及icsl的中间载体，分别命名为ssentC/TOPO、sspmsB/TOPO、sspchA/TOPO、sspchB/TOPO和icsl/TOpO，将ssentC/TOPO、sspchA/TOPO和icsl/TOpO统称为ssICS/TOPO，将sspmsB/TOPO和sspchB/TOpO统称为ssIPL/TOPO。
三、分别含有融合基因ss-pmsB和ss-pchB的植物表达载体的获得将融合有番茄二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因叶绿体定位信号肽编码序列ss的融合基因ss-pmsB和ss-pchB通过LR交换反应从中间载体ssIPL/TOPO转到植物表达载体pHOS(来源于Invitrogen公司的GatewayTMvector pH2GW7载体，此处简称为pHOS)中，LR交换反应的反应体系及反应条件为LR buffer 2μl，ssIPL/TOPO 1μl(100～300ng)，pHOS 1μl(150～300ng)，LR Clonase Enzyme mix 1μl，ddH2O5μl，25℃反应1～3小时。反应结束后，将交换产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并抽提质粒，进行测序，测序结果表明得到了插入序列正确的分别含有ss-pmsB和ss-pchB的重组载体，分别命名为sspchB/pHOS和sspmsB/pHOS，上述载体中的融合基因的上、下游分别为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(P35S)及其终止子(T35S)。再分别以质粒sspchB/pHOS和sspmsB/pHOS为模板，在引物p135’-GCGGAGCTCAGCTCTCCCATATGGTCGACTAGAGC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶SacI识别位点)和p145’-CGCTCTAGATCCGACGTCGCATGCCTG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶XbaI识别位点)的引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增分别获得了长度为1708bp的含有P35S启动子、ss-pmsB和T35S终止子的目的片段，以及2090bp的含有P35S启动子、ss-pchB和T35S终止子的目的片段，经序列分析证明与预期结果相符。然后用限制性内切酶SacI和XbaI对上述两个目的片段进行双酶切，再将两种酶切片段分别克隆到载体pHOS中，经测序鉴定后，将获得的含有融合基因ss-pmsB的植物表达载体命名为pMBOS，将获得的含有融合基因ss-pchB的植物表达载体命名为pCHBOS。
四、用于提高植物中水杨酸含量的载体的获得将icsl及融合基因ss-entC和ss-pchA分别通过LR反应从pENTR/D-TOPO中间载体icsl/TOPO、ssentC/TOPO和sspchA/TOPO重组到pMBOS和pCHBOS中，反应体系及反应条件与步骤三中的相同，得到用于提高植物中水杨酸含量的载体分别命名为pmBE/pHOS、pcBE/pHOS、pmBA/pHOS、pcBI/pHOS和pmBI/pHOS，载体的结构示意图如图2所示(35SCaMV35S启动子，ss叶绿体定位信号肽编码序列，T35SCaMV35S终止子)。
实施例2、转基因水稻的获得及其SA含量的测定以水稻为例，检测本发明的用于提高植物中水杨酸含量的载体对植物中SA含量的影响，具体方法如下一、转基因水稻的获得通过农杆菌介导法，将pmBE/pHOS、pcBE/pHOS、pmBA/pHOS、pcBI/pHOS和pmBI/pHOS分别转化水稻中花11号的愈伤组织中，经培育得到转化有上述不同载体的转基因植株，经鉴定，每种转基因植株得到10个以上的独立转基因株系，将转化有pmBE/pHOS的转基因水稻命名为pmBE(含有pmsB和entC)，将转化有pmBI/pHOS的转基因水稻命名为pmBI(含有pmsB和entC)，将转化有pmBA/pHOS的转基因水稻命名为pmBA(含有pmsB和pchA)，将转化有pcBI/pHOS的转基因水稻命名为pcBI(含有pchB和icsl)，将转化有pcBE/pHOS的转基因水稻命名为pcBE(含有pchB和entC)。
二、转基因水稻的SA含量测定用高效液相色谱法检测步骤一获得的5种ICS和IPL基因组合的转基因水稻植株(pmBE、pcBE、pmBA、pcBI、pmBI)T0代和T1代植株叶片中的SA含量，为了减少不同生长期水稻的水杨酸含量差异，选取第3片真叶和第4片真叶作为样品进行测量，具体方法如下1、T0代转基因水稻的SA含量测定随机选取上述5种转基因水稻T0代幼苗的叶片，用高效液相色谱法检测叶片中的SA含量，并用同期转化pHOS空载体的转基因水稻幼苗作为对照，检测方法包括以下步骤1)水杨酸(SA)的提取按照Verberne等人(Verberne MC，Brouwer N，Delbianco F，Linthorst HJM.BolJF，Verpoorte R.2002.Method for the extraction of the volatile compoundsalicylic acid from tobacco leaf material.Phytochem.Anal.1345-50)的方法提取水杨酸，具体方法为将待测叶片在液氮中研磨成粉，收集至事先称重的2mL离心管中加入1mL 90％甲醇，涡旋1min，超声5min，最大速度离心5min，收集上清至新离心管中，将沉淀用0.5mL 100％甲醇重悬，涡旋1min，超声5min，最大速度离心5min，合并上清，将上清再用最大速度离心5min，去不溶物，加入10μ1 0.2M NaAc，旋转蒸发至剩余约60μl，加入250μl 5％TCA，涡旋，加入800μl乙酸乙脂∶环乙烷(1∶1)抽提，重复一次，合并上层相，加入60μl 0.2M NaAc，旋转蒸发至干粉，得到游离态水杨酸。
将游离态SA提取后的下层相加入HCl至终浓度为1M，加入60μl 0.2M NaAc，80℃水解1小时，加入800μl乙酸乙脂∶环乙烷(1:1)抽提，重复一次，合并上层相，加入60μl 0.2M NaAc，旋转蒸发至干粉，即得到结合态水杨酸。
2)回收率的测定选取7mg水杨酸标准品，用上述方法提取游离态和结合态水杨酸，溶解于lmL HPLC流动相中，取30μl上样经HPLC柱层析，测定吸收峰面积。通过标准曲线，查得测定值为5.798，计算回收率为82％。
3)用HPLC测定水杨酸含量HPLC流动相为甲醇∶水∶冰醋酸(35∶65∶3)，层析柱为C18(φ4.6×250mm)，检测温度为室温，流速为0.8mL/min，紫外检测波长300nm，上样量为30μl，经HPLC柱层析，分析吸收峰，再根据标准曲线可知待测样品中的SA含量。
4)标准曲线的绘制进行生物样品分析时，常用相对标准偏差又称RSD(Relative StandardDeviation)表示精密度，精密度系指用该法测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合的程度。RSD应达到5％以内，不能超过10％。制备0.0167μg/μl的SA标准品6份，分别经HPLC柱层析，分析6份样品检测结果的RSD值为1.2％，证明此检测方法的偏差在规定范围内。然后精密称取105℃干燥至恒重的水杨酸标准品约100mg，置100mL容量瓶中，加75％乙醇使溶解并稀释至刻度；配成1mg/mL的母液，作为标准溶液。将母液分别稀释20、40、60、80、100、500倍，取30μl样品经HPLC柱层析，在波长340nm处测定吸收值，经计算回归方程为y＝19.443x+0.1178，r2＝0.9997。结果表明，水杨酸在0.002-0.05μg/μl的浓度范围内线性关系良好。
实际的检测结果表明，野生型水稻中游离态与结合态SA的含量相近；在转基因水稻中，随着游离态SA含量的提高，结合态SA的含量也成比例地提高，且结合态SA提高的倍数更大，因此，现以游离态SA含量的测定结果为准。上述5种转基因水稻T0代植株中的游离态SA含量的测定结果如表1所示，在对不同基因组合的初步检测中发现上述5种转基因水稻T0代植株中的游离态SA含量均比对照(野生型植株(或空载体转化植株))有所提高，特别是其中pcBE的5个独立株系的游离态SA含量均显著高于对照，且其中4个株系(2、3、8、52号)远远高于对照植株。
表1 T0代转基因水稻叶片游离SA含量

2、T1代转基因水稻的游离态SA含量测定现进一步对上述5种转基因水稻(pmBE、pcBE、pmBA、pcBI、pmBI)T1代的SA含量进行跟踪检测，以野生型为对照(wt)，并对检测结果进行比较，从每种转基因水稻中选取4-6个阳性植株的第三片和第四片真叶作为待测样品，用与步骤1相同的方法提取SA和SA含量测定，并对检测结果进行单因素方差分析。SA含量测定结果及方差分析结果如表2所示，F0.05和F0.01分别表示在显著性水平α＝0.05和α＝0.01下的统计量。当F＜F0.05时，说明转基因植株水杨酸含量与野生型相比差异不显著；当F0.05＜F＜F0.01，时，说明转基因植株水杨酸含量与野生型相比差异显著；当F＞F0.01时，说明转基因植株水杨酸含量与野生型相比差异极其显著。pmBE、pcBE、pmBA、pcBI和pmBI T1代的游离态SA含量比较结果如图3所示，其中pmBI、pcBI和pmBE转基因植株游离态SA含量同野生型相比稍有增高，而pmBA和pcBE转基因植株游离态SA含量同野生型相比有较大的提高，特别是pcBE转基因水稻中的游离态SA平均含量与野生型相比提高了18.57倍，pcBE五个转基因株系游离SA含量测定结果如表3所示。
上述分析结果表明，将本发明的载体转化水稻后，水稻中的SA含量均获得提高，且不同的ICS和IPL基因组合在水稻中合成SA能力存在差异，其中pcBE转基因水稻的SA含量提高幅度最显著，表明pchB和entC形成的基因组合在水稻中的活性最高。
表2 T1代转基因水稻叶片游离SA含量及方差分析结果

注查表获得所测样品的标准差F0.05(1，17)＝4.45，F0.01(1，17)＝8.4。
表3 T1代pcBE转基因水稻部分株系的游离SA含量


实施例3、半定量RT-PCR法检测基因表达与SA含量的关系用半定量RT-PCR法检测实施例2获得的转基因水稻pcBE中外源基因(含有pchB和entC)的表达量，并分析基因表达量与水杨酸含量提高的相关性，以确定水杨酸含量的提高是否是由于导入的外源基因的过量表达引起的。具体方法为选取游离态SA含量不同的13株pcBE转基因水稻，提取总RNA，经反转录合成cDNA，再以该cDNA为模板，用外源基因5’连接的叶绿体定位信号肽编码序列的引物(p135’-ATGGCTTCCTCTGTCATTTC-3’和p145’-GCTAACTCTTCCACCATTGC-3’)和内源参照基因Actin的引物(p155’-TCCGTGACATCAAGGAAAAG-3’和p165’-GATATCAACATCGCACTTCATG-3’)进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(见图4中的图b)，经PCR扩增可得到200bp的Actin条带和168bp的信号肽条带，计算基因表达的相对量，并与13株pcBE转基因水稻中的游离态水杨酸含量(见图4中的图a)进行比较，通过凝胶成像软件算出外源基因的叶绿体定位信号肽编码序列扩增条带和Actin扩增条带强度的比值(相对表达量)，见图4中的图c。由图4中的图a与图c可以看出，游离态SA含量高的样本，外源基因的相对表达量也越高，证明转基因植株中SA含量的提高是由于过表达了外源基因所致。
实施例4、半定量RT-PCR检测高含量SA的转基因植株中抗病相关基因的表达情况在拟南芥和烟草中，感染细菌或真菌性病原体，或是提高内源性SA含量，均可以诱导抗病相关基因(如NPR1、PR1、PR2和PR5等)的表达，并引发SAR反应。而在水稻中，幼苗感染细菌或是真菌性病原体，SA含量没有或是仅发生了很小的改变。当对水稻施加外源SA时，不能激活PR基因表达或诱导抗性产生。现用半定量RT-PCR检测SA含量显著提高的转基因水稻中抗病相关基因的表达情况，具体方法为提取野生型水稻和一株pcBE转基因水稻pcBE-3叶片的总的RNA，经反转录合成cDNA，再以cDNA为模板，分别用OsNPR1(nonexpresser of pathogenesis-related genel，NPR1)的半定量引物(p175’-TGATCTTATCTGTTGCCAACTTATGC-3’和P185’-ACCCAGGTTAAATTCCAAAGTTCC-3’)和内源参照基因Actin的引物(p15和p16)进行PCR扩增，同时用OsPBZ/PR10(probenazole-inducible gene，PBZ)的半定量引物(p195’-GCGGCTGTGGAAGGCGTTCAT-3’和p205’-CAGGGTGAGCGACGAGGTAGTCCT-3’)和内源参照基因Actin的引物(p15和p16)进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示(W，野生型水稻；T，转基因水稻pcBE)，经PCR扩增可得到200bp的Actin条带、500bp的osNPR1基因条带和300bp的OsPBZ/PR10基因条带，表明在T0代转基因水稻pcBE-3的叶片中，抗病相关基因OsNPR1，OsPBZ/PR10大量表达，而在野生型水稻中相应的基因没有表达，表明在高含量SA的转基因水稻中的OsNPR1和OsPBZ/PR10的表达被强烈激活，说明在没有外源施加化学物质处理或是病原体感染的情况下，提高内源性的SA的表达量可以激活水稻中与抗病相关的OsNPR1和OsPBZ/PR10基因的表达，推测该转基因水稻具有较高的抗病性。
实施例5、SA高表达转基因水稻中过氧化物的检测Yang等人在水稻中组成型表达细菌的水杨酸羟化酶，以此来降低水稻中内源性SA的含量，引起转基因水稻中过氧化物和H2O2水平的升高，出现发育和光依赖的损伤(Yang Y，Qi M and Mei C.2004.Endogenous salicylic acid protects rice plantsfrom oxidative damage caused by aging as well as biotic and abiotic stress.The Plant Journal.40909-919)。选取提高内源SA含量的转基因水稻叶片，利用可与过氧化物反应的底物NBT(nitro blue tetrazolium)来检测过氧化物的含量，具体方法为选择野生型水稻和T1代pmBE转基因株系，每个植株选取5个叶片，用解剖刀将水稻叶片从基部切离植株，并将基部浸泡于1mg/mL NBT中8小时，之后于95％的乙醇中煮沸15分钟进行脱色，过氧化物含量越高，显色越深。以经水处理的野生型水稻叶片为对照，平行检测3次。检测结果如图6所示(pmBE，WT分别为经1mg/mL NBT处理的pmBE转基因和野生型水稻叶片；WT+H2O为水处理的野生型水稻叶片)，结果表明，水杨酸含量越高，植物体中的过氧化物含量就越少，从另一个方面证明了SA在抗氧化方面的作用。在水稻体内高水平的SA也许能直接作为抗氧化剂来抵抗过氧化物或是间接通过激活抗氧化剂来调整氧化还原平衡。
实施例6、转基因生菜和甘草的获得及其SA含量的初步测定将实施例1构建的含有水杨酸合成关键酶基因ICS和IPL的载体pcBE/pHOS、pmBA/pHOS分别转入双子叶植物生菜和甘草中，转基因生菜的获得方法为利用生菜子叶为外植体，经分别转化有载体pcBE、pmBA的农杆菌EHA105侵染10分钟后，在MS培养基上共培养3天，洗涤后，在筛选培养基(在MS培养基得基础上添加潮霉素50毫克/升)上连续继代培养20-30天，再经生根后，获得转基因生菜。转基因甘草的获得方法为以甘草种子中的胚尖为外植体，将胚尖浸泡在分别转化有载体pcBE、pmBA的农杆菌EHA105农杆菌菌液中，进行超声波辅助浸染10min，用无菌滤纸吸干后置于MS培养基上暗培养48-72小时，再经过筛选和生根，获得转基因甘草苗。然后用与实施例2中相同的方法检测转基因生菜和甘草叶片中的SA含量，结果与对照(野生型生菜和甘草)相比，转化有载体pcBE/pHOS、pmBA/pHOS的转基因生菜和甘草叶片中的SA含量显著提高，初步测定的提高倍数约为10倍。
上述转基因实验结果证明本发明提高植物中水杨酸含量的方法及其专用载体不但可以用于提高单子叶植物的SA含量，也可用于提高双子叶植物的SA含量。
权利要求
1.用于提高植物中水杨酸含量的载体，是含有异分支酸合成酶基因和异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的植物表达载体。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于所述异分支酸合成酶基因来源于拟南芥、大肠杆菌或绿脓假单孢杆菌，所述异分支酸-丙酮酸裂解酶基因来源于荧光假单孢菌或绿脓假单孢杆菌。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于所述来源于拟南芥的异分支酸合成酶基因的GenBank号为AY056055，来源于大肠杆菌的异分支酸合成酶基因的GenBank号为M24142，来源于绿脓假单孢杆菌的异分支酸合成酶基因的GenBank号为X82644，来源于荧光假单孢菌的异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的GenBank号为Y09356，来源于绿脓假单孢杆菌的异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的GenBank号为X82644。
4.根据权利要求1或2或3所述的载体，其特征在于所述异分支酸合成酶基因和异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的5’端紧密连接有叶绿体定位信号肽的编码序列。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于所述叶绿体定位信号肽的编码序列为异分支酸合成酶基因和/或异分支酸-丙酮酸裂解酶基因自带的，或其它基因的叶绿体定位信号肽的编码序列。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于所述叶绿体定位信号肽的编码序列为番茄中的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的叶绿体定位信号肽的编码序列，其GenBank号为CAA29401。
7.根据权利要求4所述的载体，其特征在于所述异分支酸合成酶基因和异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的上游分别添加有CaMV35S启动子、Actin启动子或Ubiquitin启动子；在异分支酸合成酶基因和异分支酸-丙酮酸裂解酶基因的下游分别添加有CaMV35S终止子或NOS终止子。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于用于构建所述植物表达载体的出发载体为pHOS、pCAMBIA系列载体或其它衍生植物表达载体；以pHOS为出发载体构建的植物表达载体为pmBE/pHOS、pcBE/pHOS、pmBA/pHOS、pcBI/pHOS或pmBI/pHOS。
9.一种提高植物中水杨酸含量的方法，是将权利要求1所述的载体导入植物组织或细胞，得到水杨酸含量获得提高的转基因植株。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述植物包括单子叶植物和双子叶植物；所述单子叶植物为水稻、小麦、玉米或高羊茅草，所述双子叶植物为甘草、生菜、板蓝根、柳树、大豆或白三叶草。
全文摘要
本发明公开了一种提高植物中水杨酸含量的方法及其专用载体。该载体是含有异分支酸合成酶基因和异分支酸－丙酮酸裂解酶基因的植物表达载体。该方法从水杨酸合成途径出发，将不同的ICS基因和IPL基因组合导入植物。该方法是将所述载体导入植物组织或细胞，得到水杨酸含量获得提高的转基因植株。转基因实验结果表明，转基因水稻中游离态SA含量最高达到了野生型的29倍。本发明的方法及其专用载体将在植物中水杨酸含量的提高中发挥巨大作用，并为植物的品种改良和增加农作物的用途提供了一条新的途径。
文档编号A01H5/00GK1850978SQ20061007865
公开日2006年10月25日 申请日期2006年4月29日 优先权日2006年4月29日
发明者王喜萍, 于鲲, 陈丽娜, 谢莹, 夏勉, 张朝晖 申请人:北京未名凯拓农业生物技术有限公司