专利名称：只生育单一性别后代的哺乳动物的生产的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明通常涉及生产单一性别后代的方法。同过去别人使用的乏味的分离精子的方法相比，本发明中的方法是通过对生殖系进行遗传修饰来实现的。因此，生育单一类型子代的特性就可以遗传给后代。这项技术在农业，特别在牛肉和猪肉产业中有特殊的用途。
2.技术背景此处所有的出版物和专利申请都在同等程度上被引用，似乎每一篇出版物和专利申请都是具体并单独地被引用的。
通过识别性染色体，雄性和雌性哺乳动物在遗传上是可区别的。正常雌性哺乳动物含有两条X染色体，而正常雄性则含有一条X和一条Y。由于在交配中，雌性哺乳动物只贡献X染色体，因此是雄性配子决定了后代的性别。在正常情况下，由于哺乳动物的精液中含X染色体的精子和含Y染色体的精子的数目大致相等，因此用正常交配技术产生雄性或雌性子代的几率十分接近于50％。
在过去的几十年中，改变产生特定性别后代的概率的能力已经成为众多兴趣关注的主题。在人类的生育中，减少性连锁疾病发生的愿望在一定程度上加强了这种兴趣。例如，由于雄性只接受一条X染色体，因此有几百种X连锁的疾病在雄性身上典型地显现出来，如血友病和莱-尼综合症。通过增加产生雌性的概率，夫妇能够避免生育显示此类疾病的男孩。
在农业中，预先决定牲畜性别的能力具有改进产业经济和管理的潜力。根据产业特定部门的不同，大多数畜牧场主对不同性别的动物有不同的喜好。例如，雄性小牛对牛奶场主来说，基本上没有用处。另一方面，肉牛场主则偏爱雄性小牛，因为雄性小牛同它们的雌性同伴相比，长得更快，而且能更有效的增加体重。养猪场主喜欢用母猪做的熏肉，而不喜欢用公猪做的。家禽场主喜欢选择母鸡而不是公鸡。
用多种方式机械分选精子的方法已经存在一段时间了，这导致了精液制剂的商业销售，这种精液制剂可以用在人工授精中以影响子代的性别。美国专利号5,439,362和5,840,504提供了对多种机械方法的评论，并且在此以参考文献形式引用。这些方法包括基于精子特性的技术，例如尺寸，头部形状，质量，表面性质，表面大分子，DNA含量，泳动速度和运动性(见Windsor等人写的评论，1993，Reprod.Fert.Dev.5155)。例如，有人试图根据膜抗原外形潜在的差别，用免疫学方法来分离精子(如美国专利号5,439,362)。最近更多的方法集中在精子的分选技术上，借此精子细胞用一种荧光染料处理，接着根据携带X染色体的精子较高的DNA含量、因此具有较高的荧光而用流式细胞仪分选(Johnson，1996，Genderpreselectioninmammalsanoverview，DTW103(8-9)288-291)。
但是，机械分离的方法乏味而且并不完全准确。尤其对于精子分选技术而言，不能在短时间内获得大量精子将使这些精子在人工授精方法中的使用复杂化。而且，已经有人争辩说DNA的标记会造成潜在的遗传损伤。另外，机械化的精子分选技术不能通过单独繁殖的单一性别动物系中将特定性状遗传下去，那些希望操纵动物后代性别的农场主必需为每次授精购买精子。
胚胎分离技术是最成功的，借此将胚胎从母体中取出，对一些细胞进行活组织检查，接着用PCR扩增去分析性染色体特异的DNA。然而，这种方法十分乏味，需要广泛的训练，昂贵的设备以及需要移植胚胎的受体雌性动物。因此，这项技术很少使用。
对生殖系进行遗传修饰以使其偏向于生育某一特定性别后代的报道很少。美国专利号5,596,089报道了一种操纵哺乳动物性别表型的方法，该方法利用SRY启动子(从Y染色体编码的睾丸决定因子而来)在胚胎发育中启动白喉毒素基因在雄性生殖组织中的转录。这个基因用Cre-Lox系统来控制和激活。但是，由于用这种处理产生的雌性后代在遗传上仍是雄性的(XY)，因此这种方法只能操纵性别的表型。
Bruton等人在美国专利号5,223,610中建议，制作能在精子细胞中表达非致死的调节子的转基因动物，可能成为一种检验治疗法对精子受精力的影响的方法。尽管精子发生中的某些变化是意料中的结果，Bruton等人并没有建议这种方法也可以用来操纵由此产生的后代的性别。
本发明提供了几个优点，同时也克服了现有技术的不足。第一，在本发明所述的转基因动物制造出来之后，不需要进一步的技术即可生产特定性别的子代。能产生单一性别子代的雄性动物可以应用在正常的多方交配或人工授精方法中。而且，当雄性转基因哺乳动物被用来产生单一性别的子代时，遗传修饰不会传递给后代，发明的专利性质就得到了保护。一旦发展了这种遗传修饰，就可以通过克隆技术或者甚至是通过使用载体雌性动物的自然育种技术以相对低的成本来繁殖。
3.发明概述本发明涉及生产动物的方法，这些动物具有经过改变的生育某一特定性别子代的倾向性，本发明涉及的特别是那些生产具有此类倾向性的哺乳动物的方法。这些方法涉及对异配性别(带有两条不同的性染色体从而决定子代性别的性别)进行遗传修饰，以使经遗传修饰过的配子带上标记或者失活。这些哺乳动物，同时也是本发明的对象，将会生育单一性别的子代。
同时也包含那些对同配性别动物进行遗传修饰的方法，这些遗传修饰使得这些动物的异形配子的子代能生育单一性别的后代。这些经过遗传修饰的同配性别的动物，同时也是本发明的对象，提供了一种通过育种技术来繁殖生育单一性别性状的方法。这些育种技术也是本发明的对象。同时也包含用来完成此处所述方法的遗传构建体和工具。
5.发明详述定义除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语都和本发明所属领域中普通技术人员所共同理解的具有相同的含义。尽管任何同此处所述的那些相似或等同的方法和材料都可以用在本发明的实施或检验中，此处还是描述了优选的方法和材料。为本发明的用途，对下面的术语进行了定义。
如此处所用的，异配性别的意思是含有两条不同的性染色体，即一条X染色体和一条Y染色体，因此表明这样的动物将决定子代的性别。在哺乳动物中，异配性别是雄性，而在鸟类中，则是雌性。同配性别意味着含有两条相同的染色体，即含有两条X染色体的遗传上正常的雌性哺乳动物。
发明描述本发明包含一种生产动物，特别是哺乳动物的方法，其中这种动物具有经过改变的生育某一特定性别后代的倾向性。术语“后代”指直系子代或后代，即子代的子代，由所生产的动物的性别决定。
这些方法通过将核酸构建体引入所述动物生殖系的至少一条性染色体上来实现，其中核酸构建体编码一种能在减数分裂后在发育着的精子细胞中表达的转基因。转基因的表达用来改变由所述正在发育的精子细胞产生的精子的受精力，以使所生产的哺乳动物具有经过改变的生育某一特定性别后代的倾向性。
这些方法也可以用来生产异配性别和同配性别的动物。例如，当用这些方法生产在一条性染色体上带有转基因并且是异配性别的产精子动物时，减数分裂后携带转基因的配子就具有了经过改变的受精力，即完成与卵细胞受精的能力发生了改变。因此这些动物在第一代中就具有一种非自然的生育某一特定性别子代的概率，这种概率依赖于转基因的性质以及表达转基因的精子失活的程度。
当这些方法生产同配性别的产卵细胞动物时，在第一代中生育某一特定性别子代的概率不会受到影响，因为这种动物不产生精子。因此，如果转基因位于两条性染色体的其中一条上，依赖自然概率它就会传递给大约一半的子代，无论是雄性还是雌性。如果转基因位于两条性染色体上，所有的子代都会得到转基因。但是，如果转基因是用来影响精子受精力的，那么产卵细胞哺乳动物的第一代子代生育某一特定性别后代的概率就不会改变。
从产卵细胞的转基因亲本中得到转基因的产卵细胞者将携带这一转基因，但是由于它们不产生精子，它们的直系子代不会受到影响。但是那些得到转基因的产精子的异配性别动物将基本上生育单一性别的后代，这种程度由任何在减数分裂后得到含有转基因的染色体的精子失活来决定。由于产卵细胞的同配性别的动物具有无限制携带转基因的能力，因此当转基因导入同配性别动物系中时，任何后续代中的产精子者都可能受到影响。
本发明中的方法基本上是通过在动物的生殖系中引入转基因来实现的，凭借此方法就可以产生生育某一特定性别后代的倾向性被改变的动物。因此，任何适于产生转基因动物的方法都可能用到。特别优选的方法包括核移植技术，在此处引用的美国专利号5,945,577以及共同未决的专利申请系列号.08/888,057和08/888,283中有详细描述。当然，一旦通过在动物生殖系中引入转基因产生了合适的转基因动物，那么本发明中的转基因动物也可以用自然育种技术来生产。
转基因的表达最好只是令精子失活，如减少它的运动力或者受精力，而不是杀死精子。这就意味着本发明中的方法可以通过对雌性供体卵细胞进行胞质内精子注射来实现。通过这种方法，同配性别的雌性载体系可以用体外技术再生，这种再生还需要来自携带转基因X染色体的雄性动物的精子。同样的，只生育雌性后代的异配性别的雄性动物可以从携带转基因Y染色体的雄性精子中产生。但是，由于本发明中的动物可以用核移植技术或其它遗传技术很容易的产生，因此在表达时对精子有毒理作用的转基因也可以使用。
为了达到转基因在发育着的精子细胞中的特异表达，转基因的表达可以由精子特异性的序列来控制。这样的控制序列可以通过转录或翻译控制机制来影响其在精子中的特异表达。在优选的实施方案中，控制序列是一种精子细胞特异基因的启动子，这种启动子只在减数分裂后的精子细胞中特异性的影响转录。许多这类启动子已经确认，任何一种都可以用来影响减数分裂后精子中转基因的特异性表达。尤其是，精子特异性的控制序列包括鱼精蛋白基因1或2的启动子。
术语“经过改变的受精力”或者“经过改变的生育某一特定性别后代的倾向性”基本上指的是转基因的表达以某种方式影响了正在发育的转基因精子细胞，导致转基因精子细胞和非转基因的同类相比，具有不同的授精能力。在优选的实施方案中，通过使含有转基因染色体的精子失活，从而使非转基因的精子在受精过程中具有竞争优势来实现这一点。但是，转基因本身提供竞争优势即改善精子运动力的实施方案也是可行的。
对于那些编码结构蛋白质的转基因来说，它们所编码的蛋白质应该具有以下特征(1)不能通过精子细胞之间的胞质连接，因此就定位在含有转基因染色体的精子细胞中；(2)能使含有转基因染色体的精子细胞失活，带上标记或者增加受精力。关于转基因的单倍体表达，有人争辩说在精子生成过程中精子细胞通过胞质桥共享基因产物或转录物，从而使配子在发育的减数分裂后阶段呈现出表型上的双倍性。但是，一些研究表明并不总是这样的(如Zhang和Martin-Deleon，1997，Mol.Repro.Dev.46252-257)。事实上，已经有人提出，一些基因转录物从细胞核中转运出来之后，立刻就结合在细胞膜上或者稳固地定位下来，如同那些编码细胞骨架蛋白的转录物一样，从而不会被互相联结的精子细胞所共享(Caldwell和Handel，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA882407-2411)。也有许多报道指出，转录物储存在非多核糖体的核糖核蛋白(RNP)颗粒中(Burmester和Hoyer-Fender，1996，Mol.Repro.Dev.4510-20；Sommerville和Ladomery，1996，Chromosoma104469-478)，或者诸如拟染色体(CB)之类的细胞器中(Biggiogera等人，1990，Mol.Repro.Dev.26150-158)，进一步提示这些转录物并不能轻易的在精子细胞之间通行。
但是，即使转录物能在精子细胞之间共享，控制或使精子的受精力偏向于生成某一性别的选择还是能够通过遗传机制来实现的。例如，某些自主的自在因子被认为能够通过转录物共享来影响精子的受精力和正在发育的精子细胞的不平衡状态(如鼠的t等位基因，参见Miller的评论，1997，Mol.HumanRepro.3(8)669-676)。有人提出，这类自在因子编码了能通过胞质桥自由扩散的转录物或基因产物，从而使携带野生型等位基因的精子细胞失活，但却使得到这类因子的精子细胞产生对失活作用的免疫力。例如，将这样的一个因子插入Y染色体，预计可以有多种交配情况。例如，在Y染色体上携带自在因子的雄性就可以和两条X染色体上都携带有野生型等位基因的雌性交配了。这种交配对只能产生雄性后代。
如果确实出现转录物，还是有可能用调节序列将转录物锚定在含有X或Y染色体的精子细胞中的。例如，本发明中所用的启动子可以是杂合启动子，它们由来自不同的精子特异性控制序列的序列设计成。特别是，已经表明在小鼠鱼精蛋白2mRNA的3’非翻译区连接上一种磷蛋白，就会抑制mRNA的翻译直至精子生成过程的较迟阶段，据推测可能在调节蛋白去磷酸化之后(Fajardo等人，1995，Dev.Biol.，1994，166643-653).有人针对其它的精子特异性基因提出了一种相似的调节方式(Kwon和Hecht，1993，Mol.Cell.Biol.13(10)6547-6557)。因此，通过确保本发明的构建体含有合适的3’端非翻译区域，就有可能用蛋白质相互作用将转录物锚定在单倍体精子细胞中。
对于那些转基因产物影响它们所位于的精子细胞的受精力的实施方案而言，适合于本发明目的的蛋白质实例是精子细胞中高度不溶性的细胞骨架组分，这些骨架组分构成了外部的致密纤维或精子尾部的纤维鞘或精子头部的核周鞘。这些蛋白质在精子细胞中形成大的丛集，不太可能从一个精子细胞中通行到另一个中。另一个例子是含有很强的核定位序列的蛋白质，这些序列将把蛋白质引导至细胞核中，从而阻止蛋白质从一个精子细胞通行到另一个。
为了使精子失活，转基因产物可以过量表达，或者修饰以使其不能正常地行使功能，即令其突变，或者转基因产物也可以来自于其它物种。细胞骨架或者核蛋白的改变会使精子的运动力降低，或者产生其它缺陷和较低的受精力。要增强精子的表现，可以改变这些蛋白质，即有益突变，从而增强功能。在代谢中起作用的核调节蛋白质也可以被加工，以使其在精子中特异性表达时提供竞争性优势。
蛋白质也可以经过改变而含有一段如绿色荧光蛋白之类的标记蛋白序列，即含有绿色荧光蛋白序列的融合蛋白，这类标记蛋白序列可以用来标记携带某条或者另一条性染色体的精子细胞。可将被标记的精子分离，从而产生单一性别的后代。另外，与标记物、例如绿色荧光蛋白形成的融合蛋白，能够允许肉眼监视和评估蛋白质在精子细胞之间通过胞质桥的转运，假使这种转运存在的话。这种融合蛋白质也允许肉眼估测精子的运动力和受精力。
尽管优选的实施方案利用结构蛋白的变化来实现本发明的方法，那些编码具有调节功能的转录物即反义转录物的转基因，在与精子特异性控制元件偶联之后，也可以用来改变精子的受精力。
转基因通常应该插入一条或者另一条性染色体。要产生雄性哺乳动物，基因应该插入X染色体以使含X染色体的精子失活；要产生雌性，基因应该插入Y染色体以使含有Y染色体的精子失活。可选择的是，用来提供竞争性优势的转基因应该插入能够决定所要特定后代性别的性染色体中。
为了确保转基因的最佳表达，将基因插在内源性表达的基因附近是很有用的。特异性定位于X和Y染色体上的基因已经确定了，并且已经为本领域所熟知(参见此处引用的美国专利号5,595,089和5,700,926，以及5,763,166)。可选择的是，待插入的新位点可以用下面所述的技术或者本领域中常用的其它技术来确定。
应该指出的是，对于提供竞争性优势的转基因，可以设想这样的实施方案将转基因插在编码某种所要特性的基因旁边，而这个基因位于非性染色体上(常染色体)。将转基因以此种方式插入，使得转基因和所要的特性能以连锁的方式遗传。因此，得到常染色体上提供优势的转基因的精子细胞也连锁地得到了所要的特性，而且通过连锁的、精子特异性的竞争优势，这些精子细胞也为所要特性在后代动物中的传播提供了选择优势。这类技术对育种者设计或繁殖具有多种所要特性的动物系是有用的，减少了培育每种性状至纯合状态所需的时间以及由此带来的不便。
本发明也涵盖了用上述方法生产的转基因动物。关于具有失活作用的转基因，转基因哺乳动物也可以组成一个载体雌性动物系，这个动物系可以由许可的育种者来繁殖。
此处也涵盖了在某些方式中使用本发明中所述转基因动物的方法，这些方式能基本上改变生育某一特定性别后代的自然概率。可以用自然育种技术培育本发明中所述的转基因动物，从而在任何后续代基本上改变生育某一特定性别后代的自然概率，由此实现上述的方法。
用来实现这些公开的方法的核酸构建体也是本发明的一部分。如上所述，这样的核酸构建体包括精子特异性控制序列，它有效地与编码某一蛋白质的转基因序列连接在一起，这一蛋白质选自精子结构蛋白质，它们的突变体以及从它们设计的融合蛋白质中。转基因序列可以是cDNA序列，基因组序列或者人工序列。
含有这类核酸构建体的载体也包括在本发明中，同时也包括原核和真核细胞系，这些细胞系含有插在染色体上的该核酸构建体或者带有核酸构建体的载体。特别有用的细胞系包括含有整合在合适染色体上合适位置处的核酸构建体的成纤维细胞系，用来进行体细胞的细胞核移植(参见此处引用的美国专利号5,945,577)。含有核酸构建体的胚胎干细胞系也是可取的。
如上面所讨论的，在至少一条性染色体上带有转基因的同配性别产卵细胞的动物，即雌性哺乳动物，是转基因的载体，并且可以培育来繁殖这种特性。因此，本发明也涵盖了培育转基因雌性哺乳动物系的方法，这种动物系的至少一条性染色体上带有转基因。这种方法基本上包括在所述转基因雌性哺乳动物系的雌性后代中检测所述转基因，以及用所述的转基因阳性雌性后代来延续这一品系。
在这种育种方法中，后代可以用自然育种技术来产生，从而含有一个拷贝的所述转基因。可选择的是，后代也可以通过胞质内精子转移来产生，所述精子来源于基本上生育雄性后代的雄性动物，从而含有两个拷贝的所述转基因。
本发明也涵盖用这种育种方法产生的转基因雌性哺乳动物，以及用这种转基因雌性哺乳动物来生育雄性哺乳动物的方法，而这种雄性哺乳动物基本上生育雄性后代。这种方法包含培育转基因雌性哺乳动物从而来生产转基因雄性哺乳动物。这样产生的转基因雄性哺乳动物也是本发明的一部分。
如上所述，这种育种方法中繁殖的转基因在减数分裂后在由所述转基因雌性的转基因雄性后代产生的精子细胞中表达。如果转基因对精子细胞有失活作用，用自然育种技术就能使这样的转基因雄性后代产生大量的雄性后代。可选择的是，如果转基因给精子提供竞争性优势，由此产生的转基因雄性后代就能通过自然育种技术生育大量雌性后代。生育单一性别后代的概率依赖于转基因的性质而改变。但是，‘基本上’是雄性或雌性的后代，是指几乎总是允许劣势转基因精子早于非转基因精子而使卵细胞受精的小概率事件，或者具有竞争性优势的转基因精子未能敌过非转基因精子而发生受精的小概率事件。
尽管，确信本发明能用任何一种动物来轻易实现，但是优选的动物包括哺乳动物，这中间最好的是小鼠，牛和猪。
通过参考下面的实验方法，本发明的全部范围将变得更加明显。
优选实施方案详述用于评估鱼精蛋白启动子特异性的转基因构建体设计了两个构建体。通过将启动子和EGFP基因构建体配对，设计了第一个构建体，用来检验鱼精蛋白启动子的功能。建成了六只转基因小鼠(三只雄性和三只雌性)，其中一只表达定位于整个精子的EGFP(数据没有列出)。第二个构建体含有一段核定位序列，其它部分与第一个构建体相同。目的是确定EGFP表达能否定位于精子的细胞核。建成了三只转基因小鼠，将使其生育雄性后代来评估精子。
用来评估蛋白质在精子细胞之间转移的转基因构建体为了实现本发明的方法，可以在发育的精子细胞中自转基因表达分子量为85kDa和27kDa的精子外致密纤维(ODF)蛋白质，或者是它们的衍生物。这两种蛋白质的序列信息都是已知的，因此可以很容易的做到以下几点(i)分离小鼠精子细胞群，(ii)制备用来筛选的cDNA文库，(iii)筛选这样的文库以获得一个或几个能用来制作转基因的cDNA克隆，或者PCR扩增合适的序列。用本领域中熟知的技术，能很容易的构建含有融合基因的构建体，这个融合基因是将绿色荧光蛋白(GFP)掺入ODF蛋白序列的融合体。下面给出了对这些构建体的描述。
1.CMV/ODF-GFP+SV40或IRES/NEO这个构建体允许在成纤维细胞中检测ODF/GFP融合蛋白盒的功能。
2.CMV/NEO+PROT/ODF-GFP这个构建体允许在ES或成纤维细胞中进行选择、在精子细胞中的较迟表达以及在精子细胞中追踪GFP荧光。具有功能的PROT/ODF-GFP盒可以使得构建体用于同源重组。
融合蛋白构建体对确定那些携带转基因的精子，以及调查蛋白质在精子细胞之间的转移是很有用的。在这个构建体中所用的启动子是小鼠鱼精蛋白启动子，但是任何能限制基因在减数分裂后的精子细胞中表达的启动子或者其它表达控制元件都可以使用。
能够用这些构建体来制备转基因小鼠。在性成熟期，使雄性和雌性配对，并且监视转基因的传递。另外，让转基因雌性交配来生育转基因雄性。这些GI和GO雄性将和雌性配对，并且监视转基因的传递。在与至少五只雌性交配之后，雄性将被施以无痛致死术，并且摘除睾丸和附睾。从附睾中取出一些精子样品，并且在半数的精子中检验GFP的存在。如果这些结果是模棱两可的，对睾丸进行冷冻切片来检查生精小管和GFP的分布。
预期转基因会从雌性转基因动物而不是雄性转基因动物传给后代。这将意味着转基因蛋白质影响了精子的受精力。如果不是这样，就有必要用修饰过的基因制备一个构建体，重新检验对受精力的作用。(注意预期子代性别比不会发生变化，因为在这项研究中，转基因的靶子并不是性染色体)。
由于绿色荧光融合蛋白的表达，来自转基因雄性的半数转基因精子预期会在尾部有绿色荧光。这将显示转基因在减数分裂后的成功表达。而且，它也显示转基因正确定位在半数的转基因精子细胞中。
牛X染色体上能用于基因打靶的DNA序列的确定如前面所述，插在X染色体上从而在含X染色体的精子细胞中表达的有害基因会降低将产生雌性小牛的精子的受精力。这种基因应该插在它可能表达的位点。要做到这一点，就需要确定临近组成型表达的内源基因的一段序列。为了避免破坏基因的功能，对这片DNA区域进行鉴定是必要的。
这可以通过筛选牛YAC文库以分离两个带有标记位点的酵母人工染色体(YAC)克隆来实现，这些标记位点已被鉴定位于X染色体的特定区域，在假常染色体边界(PAB)区域附近。YAC克隆原位杂交(FISH)中的荧光能够用于确认X染色体上的合适位点。将这些克隆亚克隆入粘粒载体来获得更小的DNA插入物。外显子捕获法将被用来确定编码序列在这些粘粒克隆中的存在。
要进行外显子捕获，就要将粘粒克隆亚克隆入质粒pSPL3中。在亚克隆之后，将亚克隆DNA转染入COS-7细胞中。经过瞬间表达后，收获RNA，用载体特异的寡核苷酸进行反转录来生成第一链的cDNA。在将RNA模板消化之后，进行起始轮PCR，接着用BstXI消化以除去那些不含外显子的PCR产物。再进行第二轮PCR，接着用尿嘧啶-DNA糖基化方法快速克隆进噬菌粒载体中。
捕获的外显子就用来确定含有编码序列的粘粒区域。其中一些序列将用来筛选牛cDNA文库、确定全长基因，以确定粘粒区域，从而避免对这些区域进行同源重组。缺少外显子和重复序列的粘粒区域将特别标明，以用来作为同源重组的目标位点。
预期上述技术将允许用同源重组的方法在X染色体的合适区域插入载体构建体，从而使载体构建体的插入不会对转基因动物有害。相似的方法也可以用Y染色体或常染色体进行。
将DNA构建体插入预先确定的X染色体位点并且选择能用作细胞核移植的正确打靶的成纤维细胞系。
要将序列正确导入有限寿命的原代培养细胞系，就必需作大规模的转染，克隆和选择。优化转染效率，选择以及使转基因克隆细胞系传代的方法在本领域中是熟知的，并且也可以用来实现这个目的。
基本上，DNA构建体是通过这样一种方式构建的，即令X染色体同源序列位于阳性选择标记(CMV/neo)和常有鱼精蛋白启动子盒的目的基因侧翼。阴性选择标记位于X染色体同源序列3’端的下游，当发生同源重组时，它们将被删除。构建体如下1.BTX5’序列+CMV/NEO+PROT/ODF-GFP+BTX3’序列+SV40/HGR2.BTX5’序列+PROT/ODF-GFP+CMV/NEO+BTX3’序列+SV40/HGR3.BTX5’序列+CMV/NEO+PROT/ODF+BTX3’序列+SV40/HGR4.BTX5’序列+PROT/ODF+CMV/NEO+BTX3’序列+SV40/HGRCMV/neo盒允许在成纤维细胞中选择DNA插入。PROT/ODF-GFP盒将在精子细胞中表达，GFP可使表达可视化。如果融合蛋白太大而不能到达它的目的位点从而无法组装入ODF，就必需用到PROT/ODF了。如果确是这种情况，ODF蛋白还需要经过诱变处理。由于双顺反子构建体表达3’端顺反子的效率降低了，因此具有CMV/neo+PROT/ODF顺序或者相反顺序的构建体应该先进行测试。
用本领域中熟知的技术，电穿孔参数也可以得到优化。将细胞在选择性培养基中生长，那些存活的克隆将得到繁殖。用PCR来评估总群体混合物，以确定同源重组体是否已经产生。如果存在同源重组体，在500个每个含有约10个细胞的孔中进行初始的连续稀释培养，并用PCR评估。这样就确保阴性选择只在含有同源重组体的细胞群体中进行。因此，就可以丢弃任何存活的阴性选择克隆。任何在影印培养后死掉的克隆都可以认为是真正的同源重组体，并且将用Southern分析法来筛选。待用细胞将是那些具有大约35次群体倍增寿命的胎儿成纤维细胞。在选择过程中监测群体倍增情况，以尽量减少衰老。将大约3到5个细胞系冷冻，并且运往Ultimate Biosystem来生产后代。
预期第一轮选择后在生产转基因细胞中将运作良好，并且该实验能很轻易地重复，从而使得能很容易地筛选成千上万的克隆。将用PCR进行初筛选以确定同源重组体。接着应该对几个重组体进行测试以确定那些能在培养基中生长良好的重组体。
本发明提供了如下实施方案实施方案1、一种生产哺乳动物的方法，这种哺乳动物生育某一特定性别后代的倾向性被改变，该方法包括将核酸构建体导入所述哺乳动物生殖系的至少一条性染色体中，其中该核酸构建体编码一种能在发育着的精子细胞中在减数分裂后表达的转基因，这种转基因的表达改变了由上述发育着的精子细胞产生的精子的受精力，从而使上述哺乳动物具有被改变的生育某一特定性别后代的倾向性。
实施方案2、实施方案1中的方法，其中所述哺乳动物是异配性别的。
实施方案3、实施方案1中的方法，其中所述哺乳动物是同配性别的。
实施方案4、实施方案2中的方法，其中所述哺乳动物生育某一特定性别的第一代后代的倾向性被改变。
实施方案5、实施方案3中的方法，其中所述哺乳动物生育某一特定性别的第二代后代的倾向性被改变。
实施方案6、实施方案1中的方法，其中所述哺乳动物是用细胞核移植技术生产的。
实施方案7、实施方案1中的方法，其中所述哺乳动物是用自然育种技术生产的。
实施方案8、实施方案1中的方法，其中所述哺乳动物是用胞质内精子注射的方法生产的。
实施方案9、实施方案1中的方法，其中所述哺乳动物选自小鼠，牛和猪。
实施方案10、实施方案1中的方法，其中所述转基因的表达由精子特异性的控制序列控制。
实施方案11、实施方案10中的方法，其中所述精子特异性控制序列是选自鱼精蛋白1或2基因启动子的启动子。
实施方案12、实施方案1中的方法，其中所述转基因选自精子结构蛋白，它们的突变体以及由它们设计的融合蛋白质。
实施方案13、实施方案12中的方法，其中所述精子结构蛋白是一种外致密纤维(ODF)蛋白。
实施方案14、实施方案12中的方法，其中所述融合蛋白包含与绿色荧光蛋白(GFP)的融合体。
实施方案15、实施方案1中的方法，其中所述哺乳动物具有增强的生育雄性后代的倾向性。
实施方案16、实施方案1中的方法，其中所述哺乳具有增强的生育雌性后代的倾向性。
实施方案17、实施方案5中的方法，其中所述第二代后代基本上是雄性。
实施方案18、由实施方案1中的方法生产的转基因哺乳动物。
实施方案19、通过对实施方案3中的哺乳动物进行育种而生产的转基因哺乳动物系。
实施方案20、一种基本上改变生育某一特定性别后代的自然概率的方法，该方法包括用自然育种技术繁殖实施方案1中的转基因哺乳动物，从而基本上改变任何后续代中生育某一特定性别后代的自然概率。
实施方案21、含有精子特异性控制序列以及与之可操作连接的cDNA序列的核酸构建体，该cDNA序列编码选自下组的蛋白质；精子结构蛋白，它们的突变体以及由它们设计的融合蛋白质。
实施方案22、含有实施方案21中的核酸构建体的载体。
实施方案23、含有实施方案21中的核酸构建体的成纤维细胞系。
实施方案24、含有实施方案21中的核酸构建体的胚胎干细胞系。
实施方案25、一种培育至少在一条性染色体上带有转基因的转基因雌性哺乳动物系的方法，其中该转基因在所述转基因雌性哺乳动物的转基因雄性后代产生的精子细胞中在减数分裂后表达，从而用自然育种技术就可以使所述转基因雄性后代基本上生育雄性后代，所述方法包括检测所述转基因雌性哺乳动物系的雌性后代中的所述转基因，以及用所述雌性后代来携带这一转基因。
实施方案26、实施方案25中的方法，其中所述雌性后代是用自然育种技术产生的，并且含有一个拷贝的所述转基因。
实施方案27、实施方案25中的方法，其中所述雌性后代是用胞质内精子移植来产生的，并且含有两个拷贝的所述转基因，所述精子则来自基本上生育雄性后代的雄性携带者。
实施方案28、用实施方案25中的方法产生的转基因雌性哺乳动物。
实施方案29、一种生产基本上生育雄性后代的雄性哺乳动物的方法，该方法包括培育实施方案28中的转基因雌性哺乳动物，从而来生产转基因雄性哺乳动物。
实施方案30、用实施方案29中的方法生产的转基因雄性哺乳动物。
权利要求
1. 一种生产哺乳动物的方法，这种哺乳动物生育某一特定性别后代的倾向性被改变，该方法包括将核酸构建体导入所述哺乳动物生殖系的至少一条性染色体中，其中该核酸构建体编码一种能在发育着的精子细胞中在减数分裂后表达的转基因，这种转基因的表达改变了由上述发育着的精子细胞产生的精子的受精力，从而使上述哺乳动物具有被改变的生育某一特定性别后代的倾向性。
全文摘要
本文公开了对哺乳动物进行遗传修饰从而使其生育单一性别的后代或者子代的方法，该方法包括将核酸构建体导入所述哺乳动物生殖系的至少一条性染色体中，其中该核酸构建体编码一种能在发育着的精子细胞中在减数分裂后表达的转基因，这种转基因的表达改变了由上述发育着的精子细胞产生的精子的受精力，从而使上述哺乳动物具有被改变的生育某一特定性别后代的倾向性。
文档编号A01K67/027GK101024829SQ20061014243
公开日2007年8月29日 申请日期2001年2月26日 优先权日2000年2月24日
发明者J·M·罗博, A·F·庞斯德里恩 申请人:马萨诸塞大学