专利名称：：精子的保藏及受控的送递/释放的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于保藏精子的生物聚合物颗粒。本发明还涉及用于精子的保藏、储存和受控送递/释放的方法，以及本发明的生物聚合物颗粒在育种中的用途。
背景技术：
：人工授精(AI)是一种这样的技术，即其中通过人工方式而不是通过自然交配将精子置于动物的子宫或宫颈中。它被广泛地用作一种配偶方法，并且被用于动物育种以繁殖所需的性状，特别是对于农场动物例如牛、猪、绵羊、家禽和马，以及对于例如纯种狗的宠物、水生动物或濒危物种而言。通常，精子被采集、稀释，然后通过例如深低温保藏法保藏。深低温保藏技术的应用预先假定来自特定动物种的精子对这种处理耐受，而不导致精子质量、活力和受精能力的过度劣化。然后将深低温保藏的;位。有一点是至关重要的:即所述精子直至授精时仍保持活力并且授精后该活力在雌性动物体内保持足够长的时间直至卵细胞到达所述受精部位。农场动物的人工授精从20世纪40年代就开始使用，并且现在被广泛地应用于农业产业中，尤其是用于繁殖奶牛和猪。对现代AI发展以及育种人员在使用人工授精和保藏精子方面所面临的挑战的综述公开于R.H.Foote(2002),AmericanSocietyofAnimalScience(http://www,asas.org/symposia/esupp2/Footehist-pdf)和"Reproductioninfarmanimals",B.Hafez,E.S.E.Hafez.编著第7版，Philadelphia,LippincottWilliams&Wilkins，2000.-Xm，ISBN0-683-30577-8(ib.)中。在农业产业中，在具有特别优选的遗传性状的动物育种以及普通的动物生产这两方面，人工授精都已经成为一种重要的、经济的动物育种的方式。然而，在通过人工授精使雌性动物妊娠方面存在某些局限。例如，在储存过程中、解冻后(对于深低温保藏的精子而言)以及授精之后，所采集的精子的存储期和活力对于成功育种结果很重要。是否有可用的合适的保藏技术，这根据具体的动物种类而有所不同。对于牛，深低温保藏技术被广泛地使用。相反，来自其他物种例如猪的精子对深低温保藏技术耐受性较低，导致在精液处理和储存可能性这些方面灵活性较低。再者，为了获得具有合适受精能力的精子，所使用的保藏方法需要使得所述精子在授精后仍保持受精能力。以提供如下所述的储存方法和方式为目的的保藏方法已经很受关注并被大量研究，即所述储存方法和方式可确保精子在采集后较长时间内并且直至授精时仍保持受精能力。如果在授精后保持受精能力方面的存储期较短，那么将很难满足授精相对于排卵的优选时间点。在较短存储期特征的情况下，提供较长存储期及因此更长时间的受精能力的优良的精子保藏技术是至关重要的。现在仍没有保藏方法能提供足够长的存储期和授精后足够长的时间内的充足精子活力以满足育种人员对灵活性的需求一一特别是当雄性的位置(即因此进行精液采集的地点)与雌性受者位置之间有较远且耗时的距离的时候。再者，提供更加可控的和更长效的精子可用性的保藏方法将会减少通过激素处理进行人工激发排卵的需求。这在经济方面(根据消费者的需要)和动物健康方面都将有益处。因此，需要可确保精子在授精后受精能力保持较长时间的方法，例如当置于雌性受者体内时保持较长时间的受精能力。现在，在牛中使用深低温保藏的精子的人工授精(AI)被广泛进行。深低温保藏的精子在使用前可储存于液氮中数十年。然而，当精子解冻后，必须在几小时内进行AI。所述深低温保藏的精子在授精后具有受精潜力达大约12-24小时，所以必须在排卵前大约12-24小时内进行AI。因此需要如下这样的用于牛育种的保藏技术，即该技术可提供具有足够长的存储期特征且优选地保持受精能力达数天的精子。在某些国家，使用液体储存的公牛精子以降低每个AI剂量中精细胞的数目。所述精子在授精前具有受精能力达大约24-36小时。AI必须在精子采集后大约24小时内进行。然而，液体保藏的公牛精子因多种缺点而受限，例如存储期缩短/减小及分布范围减小。在猪中，深低温保藏的精子仅被用于特定的目的例如出口、长途运输和用于控制接触性传染病。猪中的AI通常用液体保藏的精液进行。液体保藏的精液(精子)的储存时间将依赖于使用何种稀释剂。用短效稀释剂稀释的精子保持受精能力达大约2-3天，而用长效稀释剂稀释的精子保持受精能力最高达5-6天。在授精后，所述精子的受精能力持续大约12-24小时。大部分的母猪在发情期以大约24小时的间隔授精两次。以更加灵活的体系提供授精前更长的储存时间(例如1周)以及/或者授精后延长的精子储存和释放(例如超过24小时)，育种产业将会具有更加有效的产出和分布，并且育种者将对相对于排卵的精确授精时间选择的要求降低。在马育种中，由于缺乏可用的马精子保藏技术，育种者通常依赖于新鲜的精子。这在马育种和赛马产业中是个很严重的问题，这是因为对于特定的传种母马来说优选的种马通常位于不同的国家，因而需要较长的运输时间。另外，由于缺乏合适的马精子保藏方法，新鲜马精子的AI必须在采集所述精子后24小时内完成。马育种因此会伴有不利的时间压力，所述压力通常导致精子质量下降或者由于授精与排卵不一致而减少受孕。因此，需要如下这样的保藏方法，即所述保藏方法可确保必需的送递运输时间相关的更长存储期以及授精后的更长存储期。可用的马精液保藏方法将具有很大的经济价值和实用价值，并且将可能引起马育种产业的变革。在储存过程中、授精前和授精后都可提供足够活力的精子保藏体系对一般的育种产业都将是有益的。更加灵活的保藏体系将使得所有动物物种的育种工作更加容易，并且会增加成功的受孕。使育种者不太依赖于匹配相对于排卵的最优选的授精时间点的体系提供了更大的灵活性。为了增强射出的精子的受精能力，已经研究了多种保藏方法包括深低温保藏和液体保藏。已经发表了多项在胶嚢中储存精子的研究。这些研究使用了形成一种颗粒的胶嚢化方法，即在所述颗粒中精子位于由半透膜包围的液态核心中。Nebele"入(1985)，Microencapsulationofbovinespermatozoa.J.Anim.Sci.198560(6):1631-39描述了一种用藻酸盐结合多聚赖氨酸制成的胶嚢将牛精子包嚢的方法。该方法基于来自LimandSun(1980)，Microencapsulatedisletsasbioartificialendocrinepancreas.Science1980210(4472):908-10的以前发表的方法，该论文研究了通过郎格尔汉细胞的胶嚢化来生产包嚢的胰岛素。NebelWa/.(1985)才艮道了在37X:下储存和335次授精的结果，并且比较了装入胶嚢的精子与未装入胶嚢的对照样品的结果。该研究报道了装入胶嚢的样品和对照样品之间没有大的差别。其他发表的研究也已经证明，可以用类似的方法将精子装入至胶嚢中，并在体内保持它们的功能性(Munkittricke〃/.(1992)Accessoryspermnumbersforcattleinseminatedwithprotaminesulfatemicrocapsules.J.DairySci.，75(3):725-31(牛)、Vishwanathe"/.(1997)Selectedtimesofinseminationwithmicroencapsulatedbovinespermatozoaaffectpregnancyratesofsynchronizedheifers,Theriogenology，48:369-76(牛)和Maxwelle"厶(1996).Survivalandfertilityofmicro—encapsulatedramspermatozoastoredat5"C.Reprod.Dom.Anim.，31:665-73(羊))。然而,Munkittricke"/.(1992)和VishwanathW(1997)报道了，当装入胶嚢的精子与未处理的精子同时授精的时候，其效力不如后者。这可以解释为，装入胶嚢的精子在受精前可能需要一些时间从胶嚢中释放。Contee"/.(1998)在授权给Universi"diPavia和Universit&DegliStudiDiMilano的EP0922451Bl中以及Torree"/.(2002)，Boarsemencontrolleddeliverysystem:storageandinvitrospermatozoarelease.J.Contol.Release,85:83_89已经开发了另一种将公猪精子装入胶嚢的方法。在该方法中，将精子加入至含钓或钡的溶液中，并将该悬液滴入含藻酸盐的溶液中。当液滴遇到藻酸盐溶液时，在它们的周围自然地形成了藻酸钓或藻酸钡的胶嚢。与Nebele/a/.(1985)描述的方法相比，该方法被声称对细胞更加温和。另一个优点是，该方法几乎不会稀释精子溶液，这被声称有利于所述细胞的活力。Faustinie"/.(2004)，Boarspermatozoaencapsulatedinbariumalginatemembranes:amicrodensitometricevaluationofsomeenzymaticactivitiesduringstorageat18"C，Theriogenology,61(1):173-184报道了显著大比例的精子具有完整的顶体，并且与在相同条件下储存的未处理精子相比，用该方法装入胶嚢储存的精子具有更少的酶泄漏。在最近的论文Weberetal(2006)，Designofhigh—throughput—compatibleprotocolsformicroencapsulation,cryopreservationandreleaseofbovinespermatozoa.Journ.Biotechnol.，123:155-163中还描述了一种用于将牛精子装入胶嚢的新体系。该体系被设计成用于高通量地制备装入胶嚢的精子，使用的是Ca-藻酸盐或硫酸纤维素聚二丙烯基二曱基氯化铵(pDADMAC)胶嚢。最后，Chou等人的US6，596，310Bl(2003)公开了一种通过从胶嚢或固体珠子中定时地释放精子的人工授精方法，其中由于使用了不支持获能(capacitation)的能源，所述精子被维持在一种非获能的状态。
发明内容本发明基于这样的意外发现，即将精子包埋于生物聚合物基质中(其中所述生物聚合物基质由富含古洛糖醛酸的藻酸盐组成)导致精子在存储期、活力和受精方面具有更优的保藏特性。所述生物聚合物颗粒及其中的精子因此可用于动物的人工授精中。本发明的精子保藏生物聚合物体系的一个非限制性优点是它通过赋予所述精子在授精后更长时间的受精能力，并因此使所述授精时间相对于排卵不那么至关重要而获得益处。根据本发明的所述生物聚合物颗粒可用于农业产业中的动物育种和生产。因此，在目标是获得具有特别需要的特征的动物时，所述生物聚合物颗粒是有用的。在目标是生产普通动物(例如生产肉牛)时，所述生物聚合物颗粒也是有用的。根据本发明，如果所述生物聚合物颗粒(例如藻酸盐颗粒)能在受者动物中(即在子宫或宫颈中)的生理条件下溶解，那么所述生物聚合物颗粒可以照这样在所述受者动物中直接使用和授精。因此，根据本发明的生物聚合物颗粒可使所述精子受控地释放。在用所述精子授精前，也可以将所述精子从所述生物聚合物颗粒中溶出。如上文所述，现有技术主要表明可将精子包入生物聚合物胶嚢中，其中所述精子被包含在生物聚合物胶嚢的液态核心中。仅一篇参考文献(Chou等人的US6,596,310Bl)提及了将精子包埋于固体聚合物基质中的可能性，但没有给出文中所述的固体珠子的实例。本发明人已经另外发现一种不同的固定精子的方法。根据本发明，所述精子被包埋在由藻酸盐凝胶制备的固体凝胶网络中，其中所使用的藻酸盐富含古洛糖醛酸。本发明人已经发现，在固体凝胶网络中的固定化与现有技术中公开的用胶嚢以及珠子包嚢相比具有多个优点。并不拘囿于具体的理论，本发明人认为，通过使用生物聚合物颗粒以及本发明的方法，包埋会导致固定化，例如所述精子的天然运动由于所述凝胶网络的约束而受到限制。由于高浓度细胞和存在高粘度聚合物而造成的物理运动受限可能是影响精子在附睾尾中存活和其功能性维持的因素之一(Watson1993)。精子在附睾尾中可被长时间(超过1周)储存(Watson1993)。富含古洛糖醛酸的藻酸盐的应用使得有可能获得包含包埋的精子的生物聚合物颗粒，所述生物聚合物颗粒在实践中能被用作保藏体系，并可以用于人工授精_一例如动物育种。因此，根据一个方面，本发明提供了用于保藏精子的生物聚合物颗粒，其中所述精子被包埋于生物聚合物凝胶网络中，并且其中包埋所述精子的所述生物聚合物颗粒包含富含古洛糖醛酸的藻酸盐。根据本发明的另一个方面，包埋所述精子的所述生物聚合物包括藻酸钓。根据另一方面，所述生物聚合物包括低粘度的藻酸盐。还根据本发明的另一方面，在本发明的生物聚合物颗粒中的所述藻酸盐的浓度为至少0.1%。还根据本发明的另一方面，在本发明的生物聚合物颗粒中的所述藻酸盐的浓度为至少0.1%至6%的藻酸盐。还根据本发明的另一方面，在本发明的生物聚合物颗粒中的所述藻酸盐的浓度为至少1%。此外，根据本发明的一个方面，在所述生物聚合物颗粒中的所述精子的浓度为至少0.1x106精子/ml,例如至少100x106精子/ml，如上限至至少2.5x109精子/ml。还根据另一方面，本发明的颗粒可被储存于溶液中，例如其中所述储存液生物聚合物颗粒的比例为至少1:1至1:100。还根据另一方面，所述精子可以与对受精能力和/或动物健康有益的化合物或试剂共包埋，例如一种或多种的所述化合物或试剂非限制性地选自稀释剂、冷冻保护剂、抗生素、抗体、抗氧剂、蛋白和激素。根据本发明的另一个方面，所述精子与选自以下的一种或多种抗氧剂共包埋丙酮酸盐、2，2，6，6-四曱基哌咬基-l-氧、4-羟基-2，2,6，6-四曱基哌啶基-1-氧(4-hydroksy-2，2，6，6-tetra-mety卜p印eridin-l-oxyl)、超氧化物歧化酶、过氧化氩酶、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathionperoxydase)、丁羟曱苯和丁羟茴醚(butylatedhydroxyanisol)。根据一个方面，所述生物聚合物颗粒被包被。所述包衣非限制地可选自多聚赖氨酸(polylysin)、壳聚糖、硫酸纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚二烯丙基二甲基氯化铵。本发明的生物聚合物颗粒包含从非限制地选自以下的动物中采集的精子猪、牛、马、绵羊、山羊、兔、家禽、宠物例如纯种狗、水生动物和濒危动物种，优选猪、牛、皮毛动物和马。因此，本发明的生物聚合物颗粒可用于通过常规的人工授精方法例如AI、IVF和ICSI在从属的雌性动物中获得妊娠。根据本发明的一个方面，用于形成所述颗粒的精子被包含在精液中。任选地，所述生物聚合物颗粒可以经脱水、深低温保藏或冷冻干燥进一步处理。本发明还提供了一种制备本发明的颗粒的方法，其中富含古洛糖醛酸的藻酸盐和精子的混合物被逐滴添加至胶凝溶液中。根据本发明的一个方面，所述胶凝溶液包含非限制地选自以下的一种或多种离子钙、钠、钡和镁，优选钙和钠离子。此外，所述生物聚合物颗粒可以任选地在精液容器中直接形成。根据本发明的方法的一个方面，所述颗粒可经脱水、深低温保藏或冷冻干燥进一步处理。本发明还提供了本发明的生物聚合物颗粒在动物育种中的用途，所述动物例如猪、牛、马、绵羊、山羊、兔、家禽、宠物例如纯种狗、皮毛动物、水生动物和濒危动物种。才艮据本发明的一个方面，所述生物聚合物颗粒用于猪、牛或马的育种。根据一个方面，所述颗粒被直接授精。还根据另一个方面，所述颗粒在授精前被溶解。还根据另一方面，本发明的颗粒与游离的精子、固定的精子同时使用。最后，本发明提供了一种用于使动物受精的方法，其中藏于本发明的颗粒中的精子被导入受者雌性动物中。图1显示出牛(图A)和公猪(图B)精子在环境温度下(牛201C,公猪181C)的体外储存。在参比样品和具有固定精子的样品中，活率值以储存时间的函数形式给出。图2显示出牛精子(图A)和公猪精子(图B)在37匸下的体外储存。在参比样品和具有固定精子的样品中，活率值以储存时间的函数形式给出。图3显示出公猪精子在环境温度下(18X:)的体外储存。在参比样品和具有固定精子的样品中，活率值以储存时间的函数形式给出。在所述储存实验中，使用了不同量的储存介质(相对于珠子的量)，如系列名称所标识的。所述精子以1x1(^精子/ml的浓度被固定在直径为lmm的珠子上。图4:公猪精子在环境温度下(181C)的体外储存。具有固定精子的样品的活率值以储存时间的函数形式给出。具有不同浓度的固定精子的珠子被用于储存实验中，如系列名称所标识的。所述精子被固定在直4圣为3mm的珠子上。具体实施例方式如前文所述，以前研究的焦点主要针对将精子装入胶嚢以有利于体外受精和人工授精。本发明人采用了一种根本不同的方法以固定精子，其中所述精子被包埋于凝胶或固体凝胶颗粒内部的生物聚合物网络中，并且其中所述生物聚合物网络由富含古洛糖醛酸的藻酸盐组成。该方法基本上不同于以前在现有技术中描述的将精子装入胶嚢，在后者中精子被包含在具有液态核心的胶嚢中，在所述液态核心中所述精子可以如在其天然环境中一样地游动。本发明的包埋精子的所述生物聚合物颗粒不依赖于使用可确保所述精子维持在一种非获能状态的溶液。本文中使用的术语"包埋的"或"包埋，，应该理解为固定精子，从而使所述精子失去其具有的天然运动的可能性。所述固定的程度将依赖于生物聚合物颗粒的特性(例如机械强度)和使用的聚合物的类型而变化。然而，需要理解的是，包埋在本发明的生物聚合物颗粒中的所述精子失去它们具有的天然运动的可能性，而这种可能性在所述精子被储存于液体中(例如在胶嚢的液态核心中)时会存在。本文使用的术语"生物聚合物颗粒"是指这样一种颗粒，即当其包含时会降低精子运动的可能性。本发明的生物聚合物颗粒由这样一种物质构成，即该物质形成由富含古洛糖醛酸的藻酸盐凝胶组成的网络。所述生物聚合物颗粒在保藏精子方面的功能不依赖于本发明的生物聚合物颗粒的三维形状。因此，本发明的所述生物聚合物颗粒可以具有不同的形状，例如球形或圆柱形。藻酸盐是一种由古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)组成的聚合物。藻酸盐是所有褐海藻种(褐藻纲(尸heo/7Arceae))的细胞壁的共有成分，通常可用碱性溶液提取。在藻酸盐中甘露糖醛酸与古洛糖醛酸(M/G)的比例根据具体的藻酸盐植物(alginophyte)(产生藻酸盐的海藻)以及不同的季节而显著变化。藻酸盐还可由假单胞菌和固氮菌合成(Svanemetal.，(2001),TheJournalofBiologicalChemistry,Vol276:34，31542-31550、Jainetal.，(2003)，MolecularMicrobiology,47(4)，1123-1133、ScottandQuatrano(1982)，AppliedandEnvironmentalMicrobiology,44:3，754-756)。藻酸盐被广泛地应用于例如在食品产业中(如作为稳定剂及用于控制粘度)，制药和化妆品产业中(如作为崩解剂)。基于不同的目的可分别获得富含古洛糖醛酸或甘露糖醛酸的藻酸盐(Mancinietal.，(1999):JournalofFoodEngineering39，369-378),并且多种用于生产富含古洛糖醛酸的藻酸盐的方法是已知的(参见W08603781、US4,990,601、US5,639,467)。本文使用的术语"富含古洛糖醛酸的藻酸盐"或"富含G的藻酸盐"是指在构成所述多糖的聚合物链中藻酸盐含有古洛糖醛酸的量比甘露糖醛酸的量高。用于理解如本领域技术人员通常使用的术语"富含G"的实例，可从上面两段所述的现有技术中显而易见。由于二价阳离子例如Ca"和藻酸盐聚合物链中古洛糖醛酸的区段结构之间的相互作用形成了藻酸盐凝胶。因此，所述藻酸盐凝胶的形成可以在非常温和的条件下完成，并适合用于固定细胞。因此，藻酸盐凝胶通常被用于固定多种类型的细胞。然而，在藻酸盐中的固定最常用作随后形成具有液态核心的多种类型的胶嚢的起始点。当在本文中提及藻酸盐、藻酸盐凝胶、藻酸盐网络或本发明的生物聚合物颗粒的时候，应理解所述藻酸盐、藻酸盐凝胶、藻酸盐颗粒或者本发明的生物聚合物网络或颗粒富含古洛糖醛酸。合适的藻酸盐类型的非限制性实例为从FMCBiopolymerAS，Drammen,Norway获得的FMCLF10/40、FMCLF10/60和FMCLF20/60，或从fromSigma,Oslo,Norway获得的A2033。本文使用的术语"存储期"是指精子在授精前的体外储存以及在授精后于受者动物体内都保持有受精能力的时间。不同来源的精子的具体存储期可以不同。然而，与精液采集后经常规储存方法储存后被授精的精子相比，本保藏体系(其中精子被包埋于本发明的生物聚合物颗粒中)获得了更长的授精后的存储期。根据本发明的一个实例，猪精子在授精后保持优良的受精能力达12小时以上，更优选在授精后达24小时以上。根据本发明的另一个实例，公牛精子在授精后保持优良的受精能力达12小时以上，更优选在授精后达24小时以上。本文使用的术语"育种"是指任何用于获得雌性动物妊娠的方法。这种方法的一个非限制性列表包括IVF、人工授精和ICSI。此外，育种涵盖获得具有特别需要的性状的动物以及商业化生产这两方面的育种。本文使用的术语"精子"包括精子本身，并且还包括包含在精液中的精子，即在形成本发明的生物聚合物时可以直接使用精液。然而，从精液中分离的精子(任选地被包含在其他合适的储存液中)也可以用于形成本发明的生物聚合物颗粒。本文使用的术语"精液容器"包括所有类型的适宜于保存和储存精子的包装体。现有技术中公开的以及如上文所述的以前的装胶嚢方法很费力，并且所述固定化操作一般包含多个步骤。然而，根据本发明的生物聚合物颗粒可以用一步操作制备。更准确地，包含精子的藻酸钙颗粒易于以这样的方式形成，即对所述被固定的细胞具有最低限度的生理应激和化学应激。藻酸盐颗粒可被制备成多种尺寸和形状，并且可用多种的藻酸盐类型、藻酸盐浓度和被固定的精子的浓度进行制备。为了包埋本发明的精子，使用藻酸盐作为生物聚合物材料是特别合适的，这是由于以下事实i)藻酸盐在温和条件下可以形成凝胶，ii)藻酸盐对于精子和受者动物都是无毒的，以及iii)藻酸盐可在生理条件下溶解并因此能够在子宫或宫颈内释放精子。根据本发明的一个方面，可通过这样的方式制备所述藻酸盐颗粒，即将包含藻酸盐和精子的溶液逐滴添加到胶凝溶液中，形成其中包埋了所述精子的藻酸盐珠子。藻酸盐珠子的制备是本领域技术人员已知的，例如Smidsrad,0.andSkjak-Braesk，G.(1990)Alginateasi腿obilizationmatrixforcells.7>e/7&//8，71-78和US6，497，902中所/>开的。多种凝胶溶液可应用于形成生物聚合物颗粒，例如藻酸盐珠子。多种适宜形成各种生物聚合物颗粒的溶液是本领域技术人员熟知的。根据本发明，二价离子(在本文中也被称为胶凝离子)例如钙和钡可用于形成藻酸盐颗粒，例如以实现所述藻酸盐的凝胶化。藻酸盐在存在多种二价离子和多价离子的情况下会形成凝胶。钙离子的使用导致了快速凝胶化以及形成相对较强的颗粒。在另一方面，钡离子的使用形成了甚至更强的颗粒，该颗粒在生理条件下更加稳定。需要理解的是，为形成本发明的生物聚合物颗粒所使用的胶凝离子的类型和量可以根据所形成的凝胶所需的强度、所使用藻酸盐的类型和浓度、藻酸盐的古洛糖醛酸含量和G-区段的长度、所使用精子的类型和来源、掺入至所述颗粒中的其他试剂的类型(例如抗生素、稀释剂、抗氧剂等)等而变化；并且需要理解的是这种改变均在本发明的范围之内。基于现有技术以及本说明书的教导，本领域技术人员并不需要过多的劳动即可鉴定出并确定可以与所述精子共包埋在本发明的生物聚合物颗粒中的各种化合物。根据本发明的一个方面，钙离子和钠离子被用于形成生物聚合物颗粒。因此，通过改变藻酸盐浓度和交联结合的程度，可以得到具有多种精子释放特性的颗粒，所述颗粒适合于例如特定的动物种或多种动物中特定的排卵条件。另外，所述藻酸盐的浓度影响所述生物聚合物颗粒的机械特性，并因此还影响所述颗粒的溶出特性。因此，所述藻酸盐浓度会根据每种情况下依赖于例如所述受者动物所需要的溶出特性而变化。本领域技术人员在制备本发明的生物聚合物颗粒时，基于其一般的知识并基于本文的教导不需过多劳动即可确定要使用的富含G的藻酸盐的各种适用浓度。根据本发明的一个方面，本发明的生物聚合物颗粒中的藻酸盐浓度为至少0.1至6%。包埋于本发明的所述生物聚合物颗粒中的精子浓度可以有变化，这依赖于例如精子的类型/来源、品种、受者动物、授精技术或体系、受精技术或体系、包括在所述颗粒中的其他试剂(抗体、抗氧剂、稀释剂、蛋白等)的存在。所述精子浓度原则上没有下限并且该浓度可以有变化，这依赖于例如所述受精方法、所述精子的来源、所述受者动物、所述生物聚合物颗粒的溶出特性等。本领域技术人员根据本说明书的教导以及一般知识，基于所需的受精方法、精子的来源、受者动物等，不需过多的实验即可确定在每种情况下需要使用的合适的精子浓度。需要了解，当ICSI被用作所需的授精方法时，可以使用比例如人工授精更低的精子量。根据本发明的一个方面，所述精子浓度因此为至少0.1x106精子/ml,本发明的发现结果表明，对于某些动物，所述精子的存活率随精子浓度的增加而有很大提高。因此，根据本发明的一个实例，至少2.5x109猪精子/血1被包埋于生物聚合物颗粒中(参见图4)。然而，100x106猪精子/ml也可使在所述雌性动物妊娠。对于公牛精子，可适用与猪精子相同的浓度范围。通过改变相对于凝胶化前的藻酸盐量的精子量或者通过在混合所述藻酸盐溶液和包含精子的溶液前浓缩或稀释所述精子溶液，可以进一步改变所述精子在所述生物聚合物颗粒中的浓度。然而，由于所述精子量的改变最终会导致藻酸盐在所得到颗粒中的浓度的改变，如果需要维持所述藻酸盐在所述生物聚合物颗粒中的浓度，则必须调整藻酸盐在所述起始藻酸盐溶液中的浓度。由于藻酸盐在溶液中的高粘度，实际上可能很难使用含超过4-6%藻酸盐的藻酸盐溶液。因此，根据本发明的一个方面，所述生物聚合物颗粒由低粘度的条酸盐构成。另外，包埋在本发明的所述生物聚合物颗粒中的精子在一定程度上与周围环境相分离，并且直至藻酸钙凝胶网络溶解才被释放。此外，所述藻酸钙凝胶网络在生理条件下緩慢溶解，这可引起精子从所述固定化基质上緩慢地释放。由于这种效应，具有受精能力的精子可以存在更长时间。在所述固定化基质上使用不同类型的包衣可控制溶出速率。多种有用的包衣是已知的，包括但不限于多聚赖氨酸、壳聚糖、硫酸纤维、羟丙基甲基纤维素或聚二烯丙基二甲基氯化铵。为了进一步改良精子品质，可以将所述精子与各种对精子存活和活力很重要的溶液共包埋。根据本发明的一个实施方案，本发明的所述生物聚合物颗粒中包含稀释剂。精子稀释剂通常被用于多个目的-增加体积-标准化AI剂量中的精子数量—起緩冲作用-获得生理环境的克分子渗透压浓度-为所述精细胞提供营养支持-控制微生物的污染(抗生素)，或者在深低温保藏的情况下-保护精细胞免受冻融损伤。基于例如精子的类型(来源)、物种、保藏方法、储存温度、授精方法、兽医卫生要求和国际立法，本领域技术人员熟知如何选择可用于本发明的生物聚合物颗粒中的合适的稀释剂。乳稀释剂和TRIS仅是大量适用的市售精子稀释剂中的几个非限制性的实例。另一种有用的稀释剂为Aalbers,JG，Rademaker，JHM，Grooten，HJGandJohnson,LA，1983:FecundityofboarsemenstoredinBTS，Kiev,ZorlescoandModenaextendersunderfieldconditions.J.Anim.Sci.75(Suppl.1)，314—315和Aalbers，JG，Johnson,LA，Rademaker,JHMandGrootenHJG，1984:UseofboarspermatozoaforAI:fertilityandmorphologyofsemendilutedinBTSandusedforinseminationwithin24hrsor25to48hrsaftercollection.Proc.10thIntCongr.Anim.ReprodandArtif.Insemin.UrbanaIL，Voln，No180，ppl-3中才艮道的稀释剂，通常被称作BTS。BTS可从MinittibiTyskland购得。(MinitiibAbfiil卜undUbortechnikGmbH&Co.KG,Hauptstrasse41，DE-84184Tiefenbach，Germany)。还另一种有用的稀释剂为可从IMV(InstrumentdeMedecineVeterinaire,10，rueGeorgesClemenceau,B.P.81，FR-613021/AIGLECedex，France)购得的TriX-Cell稀释剂。所述各种稀释剂的组成、pH、緩冲能力、克分子渗透压浓度和抗生素是不同的。许多是公开的，而另一些是商业秘密。最简单的稀释剂仅仅由不同的糖溶液例如乳糖和葡萄糖构成。基于精子保藏领域的技术人员的一般知识可以理解，根据本发明可以使用多种稀释剂。根据本发明使用的稀释剂的类型可以不同，这依赖于所述精子的来源、所使用聚合物的类型、保藏方法、储存温度等。在不脱离本说明书和所附权利要求书所公开的发明范围的情况下，如何确定并选择所使用的稀释剂的类型或合适量在本领域技术人员的知识范围内。根据本发明的所述生物聚合物颗粒可以依照现有技术中已知的方法以多种尺寸形成。何种尺寸是适宜的，这依赖于多种因素，例如精子来源、所使用的受精装置的类型和尺寸、所使用精子容器的尺寸和形状等。根据本发明的所述生物聚合物颗粒可以以适合于现有技术中所有的授精技术的直径形成，以使得易于操作、处理、运输和保藏。根据本发明的又一个方面，所述生物聚合物颗粒在容器(例如授精细管)中形成，形成与所述容器尺寸完全相适应的颗粒。因此，对于在容器中形成所述生物聚合物颗粒的情况，可以不需要另外的储存液。根据本发明的一个方面，所述生物聚合物颗粒包含从牛采集的精子。根据本发明的另一个方面，本发明的生物聚合物颗粒包含从猪采集的精子。虽然以包含分别采集自牛和猪的精子的藻酸盐颗粒描述了本发明，但是所述生物聚合物颗粒还可以包埋来自其他动物种的精子。非限制性地，所述生物聚合物颗粒还可以包埋采集自例如马、绵羊、山羊、兔、家禽、宠物例如纯种狗、水生动物和多种濒危物种的精子。另夕卜，无论如何并不表示，本发明的生物聚合物颗粒不能用于保藏人精子并从而用于不育的治疗。因此，需要理解本文使用的所述术语"动物"还涵盖人。另外，在水产养殖产业中也广泛需要精子保藏技术。因此，源自水生动物的精子也可以被包埋于本发明的所述生物聚合物颗粒中，因此这类动物也被涵盖于本文使用的术语"动物"中。将精子固定于生物聚合物凝胶网络中也可以用于一一甚至在雌性的生殖器官内部一一产生对储存精子有利的微环境。这可以用另外的对所述精子、受精程度、动物健康等有利的共包埋溶液实现。例如，在储存过程中增强活力的物质的非限制性实例有抗氧剂或蛋白、激素等。所述精子还可以与对受精能力或动物健康有益的其他试剂或化合物共包埋。这种试剂或化合物可以是例如可用于控制或预防性病的抗生素(如链霉素、新霉素、庆大霉素、青霉素、林可霉素、大观霉素、阿莫西林、泰乐菌素等)、冷冻保护剂、抗体、激素或增加生殖效率的化合物(如从US5，972，592获知的化合物)。因此，还根据本发明的另一个方面，所述生物聚合物颗粒除了包^子之外，还包含对受精能力或动物健康有益的化合物，例如抗氧剂、抗生素、抗体、激素或生殖效率促进剂或者上述物质的组合物。4艮据本发明的一个优选的实施方案，所述生物聚合物颗粒包含抗氧剂例如丙酮酸盐。本发明的所述生物聚合物颗粒可以任选地被储存于公知的精子储存液中，所述溶液例如乳稀释剂、PBS(磷酸盐緩冲盐溶液)、BTS、TriX-Cell、EDTA-稀释剂、Kiev-稀释剂、Modena、MR-A、Androh印、Acromax、Triladyl、Biladyl⑧、Bioxcell、Biociphosplus等，含或不含抗氧剂例如丙酮酸盐、2，2,6，6-四曱基哌免基-1-氧(通常简称为Tempo)、4-羟基2，2，6，6-四曱基嗛^-1-氧(通常简称为Tempol)、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丁羟曱苯(通常简称为BHT)和丁鞋茴醚(通常简称为BHA)。储存液的选择并不是关键的，只要所述储存液不包含可能负面影响所述生物聚合物颗粒特性的化合物。例如，对于藻酸盐颗粒，所述储存液不应包含太多的结合二价离子并因此溶解所述凝胶的螯合剂。在储存过程中，生物聚合物颗粒相对于所述储存液的比例可以变化，这依赖于富含G的藻酸盐的类型和浓度、精子的来源、所使用授精方法等。根据本发明的实例，所述储存液:生物聚合物颗粒的比例为至少1:1，例如至少1:2、至少1:3、至少1:4、至少1:5、至少1:6、至少1:7、至少1:8、至少1:9或至少1:10。根据本发明可以使用上限至至少1:100的储存液生物聚合物颗^立比例。此外，本发明的所述生物聚合物颗粒可任选地被储存于室温(例如18X:或20")、生理温度(37°C)或寒冷条件(例如51C)下。另外，所述生物聚合物颗粒可以经脱水、深低温保藏或冷冻干燥进一步处理。对于深低温保藏的情况，在授精之前则将所述生物聚合物颗粒解冻。通常以液体保藏的精子在包埋于本发明的生物聚合物颗粒中时，可以被储存更长一段时间。根据本发明的另一个实施方案，所述生物聚合物颗粒被直接用于对受者动物授精。任选地，在授精前可以将所述生物聚合物颗粒溶解以释放所述精子。然而，根据另一个实施方案，所述生物聚合物颗粒还可以与游离精子一起或结合使用。虽然结合具体实施方案描述了本发明，但应理解可对本发明作进一步改动。本申请意欲涵盖本发明的任何变体、应用或选择，这些通常依照本发明的原理并包括本文公开内容的变化方案，所述变化方案属于本发明所属
技术领域：
内已知的惯用实践，并可适用于上文公开的以及随附权利要求范围内的基本特征。前文对本发明的多个方面的描述揭示了本发明的一般性质，并且本领域技术人员基于各种应用可通过运用人工授精和育种
技术领域：
中的一般知识(包括本文中引用的参考文献的内容)，不需要大量实验并且不偏离本发明的主旨和附属权利要求的范围即可容易地改良和/或改变本发明生物聚合物颗粒以及它们的制备和用途。因此，基于本文给出的教导和指导，这种改变或改良意欲在本文公开的实施方案的等价方案的含义范围内。需要理解，本文使用的术语是为了描述而不是为了限制的目的。因此，本说明书的术语可由本领域技术人员在结合其知识的基础上依据本文给出的教导和指导进行解释。以下的非限制性实施例将进一步解释本发明。实施例^磁辦i掙橫f窗定在褒凝i尹材料和方法材料使用了以下的化学试剂来自RiedeldeHagn(Seelze，Germany)的CaCl2.H20、K2HP04、NaH2P04、NaCl和柠檬酸钠；来自NorskMedisinaldepot(Oslo,Norway)的一水葡萄糖；FMCBiopolymerA/S(Drammen，Norway)提供的藻酸钠(PR0TANALLF10/60);精子来源牛精子在Hallsteing各rd，Trondheim，Norway的Geno实验场(Genofacility)采集。公猪精子在Hamar，Norway的Norsvin实验场采集。在射精后不久将牛精子以1+2稀释于乳稀释剂中。公猪精子以1+4稀释于TRIX-CEIX(IMVTechnologies,I/AigleCedex，France)中。该稀释度或稀释緩冲液的选择对于所述固定化操作或者所述精子在被固定后的长期存活不是至关重要的，而仅仅是为了有助于将所述精子储存直至被进一步处理。緩沖液使用了以下的培养基。改良的IVT:3gP葡萄糖、20g1-1柠檬酸钠、2.1g1_1NaHC03、1.16g「1NaCl、3g1—1EDTA,pH7.35。BTS(含3mMCa):37g1_1葡萄糖、0.44gT1CaCl2、4.5gI—1柠檬酸钠、1.25gl1Na跳、1.25gr1EDTA、0.74gl1KC1、1g1_1新霉素，pH7.2。珠子胶凝溶液7.3g1_1CaCl2、5.96gI—1NaCl。乳稀释剂110g1_1Molico脱脂乳、120ml1_1蛋黄、6.25g1_1链霉素、1.5百万(mill)I.E"青霉素。固定细胞在Geno或Norsvin实验场采集精子细胞并如上述进行稀释。在固定前将所述精子经离心浓缩(800g，20min，200。在每批中去除的上清液的量根据在成品珠子中所需的精子浓度而定。在去除多余的上清液之后，通过温和振摇使细胞沉淀轻轻地再悬浮。然后将所述细胞悬液与6%(w/v)的无菌藻酸钠溶液轻轻地混合。将所述藻酸盐溶液以2份细胞悬液比1份藻酸盐溶液的体积比加入(已经研究了大量的藻酸盐浓度、藻酸盐溶液和细胞悬液的体积比的不同组合。本文给出的是典型的数值和操作)。将藻酸盐和细胞的混合物逐滴添加至珠胶凝溶液中(见上文)。为了产生具有3mm直径的珠子，通过内径0.5mm的注射器针头加入所述溶液。为了产生更小直径的珠子(小至小于lmm的直径)，使用了一种体系，所述体系基于应用气流以限制在所使用针尖上形成小滴的尺寸。在所述胶凝溶液中使用氯化钠是为了保证多糖在所有珠子中的浓度均匀(Smidsr0d,0.andSkjak-Braek，G.(1990)Alginateasimmobilizationmatrixforcells.TrendsinBiotechnology8，71-78)。为了限制所述珠子中的Ca"量，将所述珠子在所述珠子胶凝溶液中搅拌不超过8min。在环境温度下进行整个固定化操作。在环境温度下体外储存固定的精子固定化操作的一个目的是延长所述精子在授精前可以储存的时间。因此进行了在环境温度下于緩冲液中体外储存所述精子的实验。在所有实验中都包括来自同次射精的非固定精子的参比样品。通过在储存过程的不同时间点测定活率来评估所述精子的质量。在每个时间点，分析样品并记录所述固定精子的活率及对照样品的活率。为了将所述实验体系最佳化，已经研究了储存体积和细胞密度的大量组合(数据未显示)。下文描述的实验条件是一般性的，并被用于下文报道的实验中。在用牛精子的实验中，将约2ml固定有精子的珠子转移至13ml离心管中并以1+2的体积比加入乳稀释剂溶液。通过在13ml的离心管中以1+15的总稀释度制备了具有游离悬浮的精子的对照样品(在所有管中使用约6ml的体积)。在以前的实验中，已经显示出该稀释度对于所述参比样品储存过程中活率的保持几乎是最佳的(数据未显示)。在用公猪精子的实验中，在181C下将所述精子储存于BTS(含3mMCa)中。在下文报道的实验中，在所有实验中以1+IO稀释所述对照样品，得到在50ml离心管中20ml的总体积(先前已经显示出该稀释度对于储存过程中活率的保持是最佳的)。将包含固定精子的珠子转移至50ml离心管中并以1+3的比例加入BTS(含3mMCaCl2)。在转移至储存液之前用所述储存液冲洗包含固定精子的珠子。在371C下储存固定的精子为了评估所述精子在生理温度下的存活率，在37X:下储存在精子的过程中记录了所述精子的活率。在37X:下的储存实验之前将牛精子转移至緩冲液中。如上文所述，每个实验中包括了来自同次射精的参比样品。在13ml的离心管中以每管8ml总体积进行了所述测试。将参比样品以l+4稀释于储存液中。为了固定精子，将3ml包含精子的珠子加至6ml緩沖液中并储存在13ml离心管中。使用相似的方式处理公猪精子，不同之处是使用了常规BTS(含3mMCa)。评估活率通过显微镜估计评估所述精子的活率。从所述储存容器中取样(一般1ml)并转移至l.5mlEppendorf管中。在评估前将所述管在371C的微量恒温仪(heat-block)中预热最少15分钟。在测量时，将2.5ja1样品加至预热的显微镜栽玻片上，然后立即用光学显孩i镜检查。以上下5%的区间估计每个样品中有活动能力的精子数量。如果实际可能，在评估过程中不让操作人员知道是何种样品。在估计活率之前必须将固定的精子从所述珠子释放。为了溶解所述藻酸盐珠子，在13ml的离心管中将l份珠子加入至3份IVT溶液中。然后在评估前将所述管置于试管旋转器(tube-tumbler)上，使之混合大约30min。结果和讨论固定精子的存活率对于牛精子和公猪精子，图1中显示了来自参比样品(含非固定的精子)和含固定精子的样品的精子储存实验的数据。对于公猪精子，显示了来自2种不同尺寸的珠子的数据。其原因是，为了使用适于用现有装置进行子宫内授精的珠子，所述珠子的尺寸必须小于lmm。如从图1中呈现的数据可以观察到的，所述固定的精子在固定化后不久似乎具有比所述参比样品中的精子稍低的活率。这种活率的差异可以由所述固定化操作或所述溶解操作引起，因为在活率评估之前必须将包含固定精子的所述珠子溶解。然而，在授精前不需要将所述珠子溶解，因为所述珠子会在生理条件下慢慢地溶解(数据未显示)。参比样品和固定的精子之间的活率差异在储存过程中会缩小，这是因为所述参比样品中的活率似乎比所述固定样品中的下降得快，尤其对于公猪精子。对于固定的公猪精子，在这个具体的实验中，在3mm直径的珠子中储存5天后记录到大约50%的活率。此时，在参比样品中记录到10%的活率。这些结果表明，固定化影响细胞或所述细胞的局部环境的方式使得有利于它们耐受在181C下体外储存的能力。对于牛精子，所述参比样品和所述固定的精子之间的活率在所示实验的后期没有显著的差异。然而，对所述储存条件和固定化操作的进一步优化可延长固定的牛精子的储存时间。对固定的牛精子和参比样品中非固定精子的葡萄糖消耗和乳酸盐产生进行的测定表明，储存于藻酸钓凝胶网络中的精子代谢率降低(参见实施例2)。为了评估固定精子在生理条件(即所述精子的活度应该最大时的条件)下是否存活，在37匸的温度下进行储存实验。来自在371C下体外储存的牛精子和公猪精子的实验的数据显示于图2中。如在环境温度下体外储存的实验中所观察到的，所述参比样品和藻酸盐固定精子的样品之间的活率在所述样品制备后有差异。然而，在37。C下储存的过程中，牛精子和公猪精子在含非固定精子的参比样品中的活率都降低得相当快。在含固定精子的样品中，所述活率的降低显著较慢。在371C下体外储存15小时后，公猪精子在两种尺寸的珠子中的活率都仍大于50%。事实上，在37匸下储存60小时后，3mm直径的珠子中，所述活率仍为大约30%。在该实验体系中，牛精子的活率似乎比公猪精子下降得更快。然而，如使用公猪精子一样，在该实验中，牛精子在储存过程中活率的下降速率间也存在显著差异。在储存24小时后，固定的牛精子仍有45%的活率，而在所述参比样品中没有记录到活率。需要牢记的是，在图2中呈现的数据是使用人工实验体系得到的，所述体系不代表雌性动物的体内环境。然而，在图2中呈现的数据的确表明了，牛精子和公猪精子在被固定于藻酸钧凝胶网络中的时候，甚至在生理温度下也可存活并能够在相当长时间内保持活率。这些数据还可以表明，为了在生理温度下的储存过程中维持精子的活率，可以使用藻酸钩凝胶网络固定。这可能是特别重要的，因为为了得到好的受精结果，授精的时间十分关键。因为在授精后精子的存活时间有限，所以授精时间至关重要。因此，所述结果可表明，为了延长从授精至受精的时间段，可以使用精子固定法并结合授精后的可控释放。授精试验在一个共9只母猪的猪群中进行了授精试验。直接从上一窝小猪断奶开始挑选母猪，而且挑选持续至授精后的大约4周。在屠宰场，在取出内脏后直接收集生殖器官并在15分钟内进行检查。计算并记录卵巢中黄体的数目以及子宫角中胚胎(如果有)的数目。通过在该妊娠早期阶段进行干预，使得观察到所有存在的(甚至退化的)胚胎的可能性相对较高。通过观察足月生产的小猪的数目，认为其有较高失去大百分比的胚胎的危险，这是因为在骨化前任何死亡的孕体和胚胎都将被母体系统再吸收，最终会看不出痕迹。从受孕至成骨多达30%的受精猪卵可能死亡并消失。在我们的试验中，可以通过计得每只母猪4周时胚胎的数目和黄体的数目来计算可靠的受精率估计值。进行授精的时间可在正常时间至比正常时间早一天不等，并进行了单次授精和两次授精。这些授精试验的结果显示于表l中。4厶'授精试验中授精母猪的数目、妊娠率和(妊娠的动物中的)受<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>i第1天=采集精子当天还用牛精子进行了授精试验。由于没有大量可用的实验动物，不易于用这些试验定量。在一个有20头可用青年母牛的牛群中进行了这些实验。在授精前将所述青年母牛的动情期同步化。使用固定的牛精子已经得到了良好的受精率。在所述研究中，用储存24小时的固定精子授精的12头青年母牛中有6头受精，这通过妊娠对照得到确证。所述精子被固定于藻酸盐中，在环境温度下固定储存不同的时间段，溶解后或不溶解进行授精。进行授精的时间在正常时间至比正常时间早一天不等，并只进行了单次授精。在授精后5-7周通过直肠检查确认妊娠动物。这些试验的结果显示于表2中。4,在牛中的授精试验所使用的方法、授精青年母牛的数目和妊娠率。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>这些数据显示，固定于藻酸钓珠子中的精子不仅可保持活率，而且还可保持受精所必需的所有功能特性。因此，Geno和Norsvin已经证明，固定于藻酸钓凝胶中的精子可用于授精，并且可造成牛和猪的受精。^磁辨2库定橫子^雜#瀠為不拘囿于一种具体的理论，认为固定精子导致精子消耗的能量的减少，这对于存储期和它们的受精能力是有益的。因此，为了研究这个理论，将牛精子以约150xI06精子/ml的浓度固定于藻酸盐颗粒中，并加入至2倍于所述珠子体积的乳稀释緩冲液中从同次射精制备了含游离悬浮的精子的参比样品，该参比样品在每个乳稀释緩沖液总体积中含有相同的总精子浓度。在20X:下，储存之前，在N2气流的无氧条件制备所述样品。在储存过程中对所述乳稀释緩沖液取样，并且通过HPLC测量所述精子在所述样品中产生的乳酸盐。所述结果示于表3中表3:固定的精子和游离悬浮的精子在环境温度下储存过程中产生的乳酸盐。数值以每350百万个精子产生的乳酸盐的纳摩尔数给出。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>将来自3只雄性成年银狐(赤狐)的上等品质的混合精液在EDTA稀释剂中稀释至每ml中含228x106精细胞，并运输至实验室中。在采集和稀释后3小时，将等分试样的精液以2000rpm离心10min。将沉淀物与藻酸盐(LF10/60)混合，并如本专利申请中所述形成珠子。将所述珠子在181C下储存于改良的Biladyl中。将剩余精液于181C储存于EDTA中作为对照。在48小时后将所述珠子溶解。将所述溶出的精液和对照精液都加热至35。C达20分钟，然后在加热板上在381C下通过相差显微术在10x和25x的放大倍数下以活动精子的百分率形式来评估活率。表4:固定储存的和非固定的(对照)银狐精液的活率初始活率储存48小时后的活率对照精液75%45-50%固定的精液(溶出后)55-60%,滋辨《'"#磁_#窗定^^、^^;#濕卓^子^^炎;J^^义^AJW小根据本发明处理了来自3只成年公猪的混合精液，并且将所述珠子用于母猪的子宫内授精，之后，母猪在足月妊娠后产小猪。在2007年2月8日将所述母猪的前一窝仔断奶，并于在2007年2月12日用固定于藻酸盐珠子中的精液进行一次授精。所述母猪在2007年6月10日产下16只胎生小猪。所述猪仔中无死产小猪，并且所有小猪经临床检查正常。,磁辨》摔A孚橫濕塚定f漠虔i尹用人工阴道从两只AI公羊采集精液并在10分钟内送到实验室中。在添加藻酸盐前将所述精液以l+3稀释于基于脱脂乳的稀释剂中(CurtisPG,ForteathAD，PolgeC.Survivalofbullspermfrozeninmilkdiluentscontainingvaryingconcentrationsofglycerolandfructose.ProcIVthIntCongrAnimR印rod1961;3:952-956)，并如专利申请0613288.0实施例1中所述形成珠子。将所述珠子在5X:下或者在环境温度下储存于基于脱脂乳的稀释剂中。在固定24小时和48小时后，将固定的精子从所述珠子释放，然后通过显微镜以活动精子细胞的百分率来评估活率。由于现实原因，在本研究中没有包括对照。然而，在液态的公羊精液于5t;或20"C下储存30小时的过程中，包括活率在内的活力参数将会变差(PaulenzH，SoderquistL，Perez-PeR，BergKA.Effectofdifferentextendersandstoragetemperaturesonspermviabilityofliquidramsemen.Theriogenology2002:57(2):823_36)。表5固定的公羊精液在不同温度下储存24小时和48小时的活率<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>权利要求1.用于保藏精子的生物聚合物颗粒，其中所述精子被包埋于一个生物聚合物凝胶网络中，并且其中包埋所述精子的所述生物聚合物包含富含古洛糖醛酸的藻酸盐。2.根据权利要求1的颗粒，其中包埋所述精子的所述生物聚合物包含藻酸化3.根据权利要求1或2的颗粒，其中所述生物聚合物包含低粘度的藻酸盐。4.根据权利要求1-3任一项的颗粒，其中所述藻酸盐浓度为至少0.1%。5.根据权利要求4的颗粒，其中所述藻酸盐浓度为至少0.1%至6%的藻6.根据权利要求5的颗粒，其中所述藻酸盐浓度为至少1%。7.根据权利要求4的颗粒，其中所述藻酸盐浓度为至少2%。8.根据权利要求4的颗粒，其中所述藻酸盐浓度为6%。9.根据权利要求1-8任一项的颗粒，所述颗粒具有至少0.1x106精子/ml的精子浓度。10.根据权利要求9的颗粒，所述颗粒具有至少100x106精子/ml的精子浓度。11.根据权利要求9的颗粒，所述颗粒具有至少2.5xl(f精子/ml的精子浓度。12.根据权利要求l-ll任一项的颗粒，所述颗粒被储存于溶液中。13.根据权利要求12的颗粒，其中所述储存液:生物聚合物颗粒的比例为至少1:1至1:100。14.根据权利要求12-13的颗粒，其中所述精子与一种或多种抗氧剂共包埋。15.根据权利要求14的颗粒，其中所述抗氧剂选自丙酮酸盐、2，2，6，6-四曱基哌^-l-氧、4-羟基-2，2，6，6-四曱基哌^-1-氧、超氧化物歧化酶、过氧化氬酶、谷胱甘肽过氧化物酶、丁羟曱苯和丁羟茴醚。16.根据权利要求1-15任一项的颗粒，其中所述颗粒被包被。17.根据权利要求16的颗粒，其中所述包衣选自多聚赖氨酸、壳聚糖、硫酸纤维素、羟丙基曱基纤维素和聚二烯丙基二曱基氯化铵。18.根据权利要求1-17任一项的颗粒，其中所述精子还与对受精能力和/或动物健康有益的化合物或试剂共包埋。19.根据权利要求18的颗粒，其中所述精子与一种或多种选自以下的化合物或试剂共包埋稀释剂、冷冻保护剂、抗生素、抗体、抗氧剂、蛋白和激素。20.根据权利要求1-20任一项的颗粒，其中所述精子源自选自以下的动物猪、牛、马、绵羊、山羊、兔、家禽、例如纯种狗的宠物、皮毛动物、水生动物和濒危动物种。21.根据权利要求20的颗粒，其中所述精子采集至选自以下的动物猪、牛、皮毛动物和马。22.根据权利要求1-21任一项的颗粒，其中所述精子包含在精液中。23.根据权利要求l-22任一项的颗粒，其中所述颗粒经脱水、深低温保藏或冷冻干M—步处理。24.根据权利要求1-22任一项的颗粒，其中所述颗粒在精液容器中直接形成。25.用于制备根据权利要求1-24任一项的颗粒的方法，其中将藻酸盐和精子的混合物添加至胶凝溶液中。26.根据权利要求25的方法，其中所述胶凝溶液包含一种或多种选自以下的离子钩、钠、钡和镁。27.根据权利要求26的方法，其中所述胶凝溶液包含钓离子和钠离子。28.根据权利要求25-27任一项的方法，其中所述颗粒经脱水、深低温保藏或冷冻干;^ii一步处理。29.根据权利要求1-24任一项的生物聚合物颗粒在动物育种中的用途。30.根据权利要求29的用途，其中所述颗粒用于选自以下的动物的育种猪、牛、马、绵羊、山羊、兔、家禽、例如纯种狗的宠物、皮毛动物、水生动物和濒危动物种。31.根据权利要求29或30的用途，其中所述颗粒被直接授精。32.根据权利要求29或30的用途，其中在授精前溶解所述颗粒。33.根据权利要求29或30的用途，其中所述颗粒与游离的精子一起使用。34.动物受精的方法，其中将保藏于根据权利要求1-24的颗粒中的精子导入受者雌性动物中。全文摘要本发明涉及用于保藏精子的生物聚合物颗粒，其中所述精子被包埋于所述生物聚合物颗粒中。本发明还关于一种精子的保藏、储存和受控的送递/释放的方法，以及本发明的生物聚合物颗粒在育种中的用途。文档编号A01N1/02GK101616578SQ200780025213公开日2009年12月30日申请日期2007年7月3日优先权日2006年7月4日发明者E·科米斯拉德,G·科林肯博格,P·O·霍夫莫申请人:斯博姆维透公司