专利名称：一种获得叶片皱缩芸薹属突变体的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得叶片皱縮芸薹属突变体的方法。
背景技术：
突变体资源在作物遗传育种、品种改良、基因的定位、克隆、分离、表达及调 控等研究领域中具有重要的意义。 一些曾被认为是无意义的突变，现在已经受到越 来越多的关注。叶片突变体在植物品种改良中具有重要的应用价值， 一方面通过基 因突变可以创造出新的种质资源，增加物种的遗传多样性；另一方面叶片突变体在 杂种一代制种中作为标记性状，可辅助辨别亲本和杂交一代，大大提高种子纯度和 质量。
目前，创建突变体的方法主要有自发突变、物理诱变(快中子、g射线)、化 学诱变(EMS或DES)以及T-DNA、转座子和反转座子插入等。
人工诱发突变多为辐射诱变和在组织培养中发生的突变。辐射诱变是造成变异 的有效手段，虽然辐射诱变的突变方向不确定，但这种诱变方法具有操作简单、处 理量大和成本低等优点。目前，航天育种技术的研究、开发与利用，进一步拓宽了 辐射诱变育种的研究领域，将为诱变技术带来新的生长点和创新点。
植物细胞经过组织培养发生变异是一种常见的现象，采用这种方法诱导和获得 突变体也是进行植物品种改良的有效手段之一。芸薹属作物的小孢子具有较高的胚 胎发生能力，这为通过组织培养方式获得突变体提供了极大的可能。在游离小孢子 培养过程中，姊妹染色单体可以进行重组、交换，同时又因为小孢子的数量极大， 增加了变异发生的概率，这些都为通过游离小孢子培养获得多种类型的突变体提供 了条件。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得叶片皱縮芸薹属突变体的方法。
本发明所提供的获得叶片皱縮芸薹属突变体的方法，包括以下步骤
1)培养芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12的游离小孢子获得
再生植株；所述芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12的保藏登记号为
CGMCC Ns 2553;2)将上述步骤1)获得的再生植株置于4一5。C低温条件下处理15-20天或自 然慢慢通过低温处理30 — 40天，即获得叶片皱縮突变体；
所述自然慢慢通过低温是指夜间平均最低温度为11一13"C。
实验证明，2006-2007年，采用匕述方法进行四次重复实验，结果每次都能获 得一定数量的叶片皱縮突变体，叶片皱缩突变体的最高发生频率平均为2. 29%。
芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12已于2008年6月18日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京 市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCW2553。芸 薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12具有如下稳定遗传的表型性状株 型高，心叶略带紫色，叶片绿色、有缺刻、附着蜡粉，茎部略有紫色、附着蜡粉， 腋芽并发性强，花瓣为黄色，花药和柱头正常，结实性好，种荚细长，种子较大、 呈黑褐色。
本发明的获得叶片皱縮芸薹属作物突变体的方法具有操作简便、快速、经济、 高效的特点，获得的再生植株为DH纯系， 一旦获得DH纯系自交后代的种子，便是 稳定遗传的繁殖材料。同时，由于在获得的再生植株上并发的两个以上的分支同出 于一个母体，它们只在叶片皱縮的单一性状上表现差异，而其它的遗传背景完全一 致，因此它们是很好的野生型和突变型材料，这将为研究叶片皱縮突变体的遗传规 律，定位、克隆和分离叶片皱縮基因以及研究叶片铍縮基因的表达与调控，并探讨 叶片皱縮性状在育种中作为标记性状的应用等提供了可能。
图1为本发明具体的技术路线
图2为芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12再生植株的叶片皱縮 突变体的苗期表型
图3为芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12再生植株的叶片皱縮 突变体的成熟植株表型
图4为芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12再生植株的叶片皱縮
突变体的花期表型
图5为生长在同一母体上的叶片皱縮突变体和野生型
具体实施例方式
本发明的具体技术路线如图1所示。实施例1、叶片皱縮芸薹属突变体的获得
1、 芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12的游离小孢子培养 以芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12 CGMCC2553为供试材
料，采用游离小孢子培养技术获得芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12 的再生植株，具体方法如下
选取芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12 CGMCC W 2553的大小 为2.0mm-3.5mm的健康花蕾，经表面消毒后，在盛有B5液体培养基的研钵中轻轻 挤压花蕾，游离出小孢子；将含有小孢子的悬浮液经过3次离心收集小孢子，最后 将收集到的小孢子悬浮在1/2NLN液体培养基中培养，培养游离小孢子，使其密度 达至IJ lXl。5个/ml。
将上述小孢子先在32. 5。C黑暗条件下培养1天，然后转至25。C条件下继续暗 培养14天，获得各阶段的胚。将子叶胚转接到B5固体培养基中，经过3次继代于 B5固体培养基上进行生根后，获得再生植株，将再生植株移栽到营养钵中，经过驯 化后移栽成活。
2、 叶片铍縮突变体的获得
将上述步骤1获得的再生植株置于4一5r低温条件下处理15-20天，然后定植 到日光温室，即获得叶片皱縮突变体。
通过本发明方法获得的芸薹属异源六倍体(AABBCC， n=27)秋引2005-12再生 植株叶片皱縮突变体苗期的表型如图2所示，其成熟植株的表型如图3所示，花期 的表型如图4所示。从以上各幅图中可以看出，突变体的叶片明显变形，出现类似 瘤状的结构，而供试材料(芸薹属异源六倍体(AABBCC，『27)秋引2005-12 CGMCC W2553)叶片则表现正常，且叶片皱縮突变体后期可以正常开花。
生长在同一母体上的叶片皱縮突变体和野生型的表型如图5所示，可见，在同 一母体上长出3个同时萌发的分枝，其中1个分枝为突变体的枝条。
2006年-2007年，采用上述方法进行两次重复实验，结果每次都能获得叶片皱 縮突变体。重复实验1在栽种的67株再生植株中，有l株为叶片皱縮突变体，叶 片皱縮突变体的平均发生频率为1. 49%;重复实验2在栽种的55株再生植株中，有 l株为叶片皱縮突变体，叶片皱縮突变体的平均发生频率为1.82%。
培养上述叶片皱縮突变体植株， 一部分可以获得叶片皱縮突变体的种子，另外 一部分叶片皱縮突变体由于染色体的不配对或倍性的变化等原因而没有花粉或花粉很少，最终没有收获到种子。突变体种子的平均获得率为50%。 实施例2、叶片皱縮芸薹属突变体的获得
将按照上述实施例1步骤1的方法获得的再生植株在北京地区于1月份定植到 日光温室后，自然慢慢通过低温(夜间平均最低温度为11_13°C)处理30 — 40天， 获得叶片皱縮突变体。
2006年-2007年，采用上述方法进行两次重复实验，结果每次都能获得叶片铍 縮突变体。重复实验1在栽种的175株再生植株中，有4株为叶片铍縮突变体，叶 片皱縮突变体的平均发生频率为2. 29%;重复实验2在栽种的105株再生植株中， 有2株为叶片皱縮突变体，叶片皱縮突变体的平均发生频率为1.90%。
培养上述叶片皱縮突变体植株， 一部分可以获得叶片皱縮突变体的种子，另外 一部分叶片皱縮突变体由于染色体的不配对或倍性的变化等原因而没有花粉或花 粉很少，最终没有收获到种子。突变体种子的平均获得率为50%。
采用本发明方法获得的叶片皱縮突变体为DH纯系，因此可以稳定遗传。所获 得的再生植株具有很强的分枝并发能力，每个再生植株在根部均可以同时发出2个 以上的分枝，且各腋芽也可以同时萌发多个分枝，因此，再生植株在苗期多表现为 丛生状态。在叶片皱縮突变体植株母体根部同时出现的2个以上分枝中，均会出现 叶片皱縮的分枝。
权利要求
1、一种获得叶片皱缩芸薹属突变体的方法，包括以下步骤1)培养芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)秋引2005-12的游离小孢子获得再生植株；所述芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)秋引2005-12的保藏登记号为CGMCC №2553；2)将上述步骤1)获得的再生植株置于4-5℃低温条件下处理15-20天或自然慢慢通过低温处理30-40天，即获得叶片皱缩突变体；所述自然慢慢通过低温是指夜间平均最低温度为11-13℃。
2、 权利要求l所述的方法在植物育种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种获得叶片皱缩芸薹属作物突变体的方法。该方法包括以下步骤1)培养芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)秋引2005-12的游离小孢子获得再生植株；所述芸薹属异源六倍体(AABBCC，n＝27)秋引2005-12的保藏登记号为CGMCC № 2553；2)将上述步骤1)获得的再生植株置于4-5℃低温条件下处理15-20天或自然慢慢通过低温(夜间平均最低温为11-13℃)处理30-40天，即获得叶片皱缩突变体。实验证明，2006-2007年，采用上述方法进行四次重复实验，结果每次都能获得一定数量的叶片皱缩突变体，叶片皱缩突变体的最高发生频率平均为2.29％。
文档编号A01H1/06GK101627726SQ20081011669
公开日2010年1月20日 申请日期2008年7月15日 优先权日2008年7月15日
发明者张凤兰, 张德双, 徐家炳 申请人:北京市农林科学院