专利名称：：一种生产乳酸的方法及其专用植物乳杆菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种生产乳酸的方法及其专用植物乳杆菌。
背景技术：
：随着石油资源的不断减少以及不可再生资源价格的节节攀升，开发利用对环境更友好的生物基产品已成为转变经济增长方式、保障生态链良性循环和实现经济社会可持续发展的战略需求。乳酸是一种重要的、多用途的生物基平台化合物，能够广泛应用于食品、医药、化工、纺织、环保和农业等诸多领域，其中最重要、最广泛的工业应用是用于生产可降解聚合物-聚乳酸(PLA)。聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性以及优良的机械性能和物理性能，因而被产业界认为是新世纪最有发展前途的新型可再生材料，是石油基产品的重要替代品之一。聚乳酸是一类脂肪族聚酯，主要包括聚L-乳酸(PLLA)、聚D-乳酸(PDLA)和聚DL-乳酸(PDLLA)三种，其中使用规模最广泛的是PLLA，PLLA目前已广泛应用于医学、纺织、农业和食品等领域。聚乳酸作为大规模应用的工业材料，需要有合适的热稳定性，以防止其降解。然而由于同型聚乳酸热变形温度低，导致聚L-乳酸作为工业塑料的应用受到限制。2003年，Yamane等发现聚L-乳酸和聚D-乳酸的立体共聚物比单纯的聚L-乳酸有更高的熔点，聚L-乳酸的熔点(rm)大约为18(TC，而聚L-乳酸和聚D-乳酸的立体共聚物的熔点能够达到230°C，这一实验结果使工业界对D-乳酸的生产产生了巨大的兴趣。相对于对L-乳酸生产菌株的研究的高度关注，D-乳酸发酵生产的研究仍然处于起步阶段。根据国内外文献和专利的报道，目前只有德氏乳杆菌a."e/6n^c^)、嗜酸芽孢杆菌(iS/ora/actokc/〃ws/"w/z>ms)禾口棒状乳杆菌(丄.cw7m/0rm/s)等有限的几种天然乳酸菌用于生产D-乳酸，这极大地限制了D-乳酸在工业领域的应用，阻碍了聚乳酸市场的开拓。因此有必要筛选更优良、应用潜力更高的产D-乳酸的菌株，才能从根本上解决问题，满足市场的要求。植物乳杆菌是典型的同型发酵乳酸菌，具有较强的乳酸生产能力和耐盐性，是潜在的工业应用菌株，然而已发现的植物乳杆菌主要用于生产DL-乳酸，因而不能满足市场对D-乳酸的要求。
发明内容本发明的目的是提供一株生产乳酸的植物乳杆菌a.p/anton^)SMB-2。本发明所提供的植物乳杆菌a孑/a"ton^)SMB-2是从发酵食品-云南泡菜中筛选得到的，鉴定为植物乳杆菌(丄./7/a"tow附)。植物乳杆菌a.p/朋tomm)SMB-2已于2008年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC処2566。植物乳杆菌(Z./7/aWan^z)SMB-2CGMCCJVfe2566为革兰氏阳性菌，菌落较小、圆形、淡乳白色、边缘整齐光滑，电镜观察发现，SMB-2营养细胞的菌体大小为(0.5~0.6)pmX(0.93.0)Mm,菌株单生、成对生或短链状排列，兼性厌氧，无芽孢。以上述植物乳杆菌a.p/awtomm)SMB-2CGMCCJVT22566为活性成分制备的生物菌剂也属于本发明的保护范围。上述生物菌剂在具体应用时，可根据需要在其中添加其他的辅料。本发明的第二个目的是提供一种利用植物乳杆菌(丄.;/a"towm)SMB-2CGMCC掀2566生产乳酸的方法。本发明所提供的生产乳酸的方法，是发酵植物乳杆菌a.p/wton^)SMB-2CGMCCWs2566得到乳酸。所述植物乳杆菌a.p/朋torwm)SMB-2CGMCCJV22566的发酵培养基的组成为葡萄糖120~150g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸钠2g/L、MgS04.7H200.58g/L、MnS04'4H200.25g/L、Tween-801ml/L和用于控制发酵液pH值的中和剂。发酵过程中控制pH范围在5.5~6.2。上述发酵培养基中的中和剂为Ca(OH)2或氨水，优选为Ca(OH)2，所述Ca(OH)2的浓度为296g/L。所述植物乳杆菌a.//朋torwm)SMB-2CGMCCW2566的发酵条件为35~39°C静置培养48小时。所述发酵培养方式为分批补料发酵培养，每12小时补加60mL1000g/L的葡萄糖一次。本发明利用植物乳杆菌a.;/朋tomm)SMB-2CGMCCJV22566发酵生产乳酸，结果表明，发酵48小时时，发酵液中总乳酸的浓度为18%，D-乳酸的光学纯度为84-86%，发酵产率为3.75g/L*h。且该植物乳杆菌a""o^"7/wp/""torwm)SMB-2CGMCCW2566易于沉降到发酵罐底部进行生长，有利于工业生产中菌-液的分离纯化，可以降低乳酸工业生产的成本，具有重要的工业应用价值。图1为植物乳杆菌a.//a"toww)SMB-2的具体筛选流程图2为植物乳杆菌(丄.p/flw/an^)SMB-2的扫描电镜照片图3为植物乳杆菌a.p/a"far臓)SMB-2种子液的沉降效果图4为植物乳杆菌a.//朋tor謂)SMB-2发酵液的沉降效果具体实施例方式下述实施例中所述方法，如无特别说明均为常规方法。下述实施例中所述百分含量，如无特别说明均为质量百分含量。实施例l、植物乳杆菌a.;/fl"^謂)SMB-2的分离、纯化及鉴定植物乳杆菌a.//flwtorwm)SMB-2的具体筛选流程如图1所示。1、菌种的分离和纯化将发酵食品-云南泡菜浸泡于无菌的生理盐水中充分洗涤，然后取上述洗涤液加入到MRS液体培养基中，37匸厌氧富集培养48小时，获得pH〈4.0的富集液；取上述富集液，10倍梯度稀释后涂布于含4。/。CaCO3的MRS固体培养基上，37。C厌氧培养24小时，挑取透明圈较大的单菌落分别接种于MRS液体培养基中厌氧培养24小时，观察是否产气，筛选得到不产气的菌株，即同型发酵乳酸菌；将上述筛选得到得同型发酵乳酸菌分别接种于复筛培养基上，37。C厌氧培养48小时，通过高效液相色谱检测总乳酸的产量，获得高产的乳酸菌；将上述获得的乳酸菌通过乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测D-乳酸的光学构型，最终从发酵食品-云南泡菜中得到一株D-乳酸光学纯度为84~86%的菌株，即植物乳杆菌a.;/fl"tor訓)SMB-2，经多次传代后发酵测试，总乳酸产量、D-乳酸的纯度没有明显变化。植物乳杆菌a./7/a"torMW)SMB-2筛选中所用的MRS液体培养基为葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，柠檬酸二铰2g/L，乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgS04'7H200.58g/L，MnS04'4H200.25g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5~6.2。115。C条件下灭菌20分钟。植物乳杆菌a.p/fl"towm)SMB-2筛选中所用的含4Q/oCaC03的MRS固体培养基为葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgS04*7H200.58g/L,MnS044H200.25g/L，CaC0340g/L，琼脂15g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5~6.2。。115。C条件下灭菌20分钟。植物乳杆菌(丄.//awtowm)SMB-2筛选中所用的复筛培养基为葡萄糖120g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgS04'7H200.58g/L，MnS04'4H200.25g/L，CaC0340g/L。发酵过程中控制pH范围在5.56.2。115。C条件下灭菌20分钟。D-乳酸光学纯度二D-乳酸浓度/总乳酸浓度。2、菌株的鉴定将上述步骤l筛选得到的植物乳杆菌a.;/awtonw2)SMB-2进行形态特征、生理生化试验、API试剂盒和16SrDNA序列鉴定，具体结果如下该菌株菌落较小、圆形、淡乳白色、边缘整齐光滑，.电镜观察发现，SMB-2营养细胞的菌体大小为(0.5-0.6)MmX(0.9~3.0)pm，菌株的电镜扫描照片如图2所示。菌株单生、成对生或短链状排列，革兰氏染色呈阳性，无芽孢。具体的生理<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>表中结果"+"表示结果为阳性，"-"表示结果为阴性。利用API试剂盒(购自法国梅里埃公司)对上述步骤1筛选得到的植物乳杆菌(丄.；/cmton^)SMB-2进行鉴定，结果如表2所示。表2API快速鉴定试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上表中对照指不含碳源的培养基植物乳杆菌(丄.//fl"tor"w)SMB-2的16SrDNA的核苷酸序列如序列表中序列1所示。菌株SMB-2的16SrDNA与植物乳杆菌a.;/朋torwm)A12-li(DQ0564191.1)的同源性最高，其同源性为98%，与其它乳酸菌的同源性较低。基于以上特征，将本株D-乳酸生产菌SMB-2鉴定为植物乳杆菌a.p/朋towm)，并于2008年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCW22566。实施例2、利用植物乳杆菌a.;/a"torwm)SMB-2CGMCC炝2566发酵生产乳酸该实施例中所用培养基的组成如下MRS液体培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，拧檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgS04'7H200.58g/L，MnSO4，4H2O0.25g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5~6.2。115°。条件下灭菌20分钟。、发酵培养基葡萄糖135g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸钠2g/L、MgS04'7H200.58g/L、MnS(V4H200.25g/L、Tween-801ml/L，Ca(OH)2296g/L。恒定pH5.8，115。C条件下灭菌20分钟。发酵培养基中加入Ca(OH)2的目的是作为中和剂以控制发酵液的pH值。将上述实施例1筛选得到的植物乳杆菌a.;/a"to^w)SMB-2CGMCCW2566接种到MRS液体培养基中，37'C厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到1091011cfu/mL,得到发酵种子液。在装有3L上述发酵培养基的7L发酵罐中按照10%的体积比接入上述发酵种子液，发酵过程中，每12小时补加60mL1000g/L的葡萄糖一次，37"C静置培养48小时，恒定pH5.8，结束发酵。发酵过程结束后，通过高效液相色谱检测发酵液中总乳酸的产量。具体的检测条件如下:采用AgilentIIOO液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，进样量20uL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度4(TC。D-乳酸的含量通过D-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。实验设3次重复，3次重复的平均值如表3所示。_表3植物乳杆菌SMB-2在不同发酵时间下的总乳酸产量_发酵时间(h)_总乳酸产量(g/L)_D-乳酸光学纯度124886%2412084%3615886%48_^_^_按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、D-乳酸的光学纯度和发酵产率。总乳酸的浓度-(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)X标准样品质量浓度D-乳酸的光学纯度^D-乳酸浓度/总乳酸浓度发酵产率=总乳酸浓度/发酵总时间结果表明，植物乳杆菌(丄.户/a"torwm)SMB-2CGMCC她2566具有良好的发酵性能，在48小时内总乳酸的产量为180g/L，发酵液中总乳酸的浓度为18%，D-乳酸的光学纯度为84-86%，发酵产率为3.75g/L*h。实施例3、利用植物乳杆菌a.//fl"torww)SMB-2CGMCC2566发酵生产乳酸该实施例中所用培养基的组成如下MRS液体培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L,K2HP042g/L，拧檬酸二铵2g/L,乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgS04*7H200.58g/L，MnSO4*4H2O0.25g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5~6.2。115'C条件下灭菌20分钟。发酵培养基葡萄糖150g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸钠2g/L、MgS04.7H200.58g/L、MnS04.4H200.25g/L、Tween-801ml/L，Ca(OH)2296g/L。培养基的初始pH值为6.2。115。C条件下灭菌20分钟。发酵培养基中加入Ca(OH)2的目的是作为中和剂以控制发酵液的pH值。将上述实施例1筛选得到的植物乳杆菌(Z./7/""ton^)SMB-2CGMCC処2566接种到MRS液体培养基中，37"厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到109~10"cfu/mL，得到发酵种子液。在装有3L上述发酵培养基的7L发酵罐中按照10%的体积比接入上述发酵种子液，发酵过程中，每12小时补加60mL1000g/L的葡萄糖一次，39"C静置培养48小时，恒定pH6.2，结束发酵。发酵过程结束后，通过高效液相色谱检测发酵液中总乳酸的产量。具体的检测条件如下:采用AgilentIIOO液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量O.5ml/min，进样量20uL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度4(TC。D-乳酸的含量通过D-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。实验设3次重复，3次重复的平均值如表4所示。表4植物乳杆菌SMB-2在不同发酵时间下的总乳酸产量发酵时间(h)_总乳酸产量(g/L)_D-乳酸光学纯度124686%2411585%3614985%48_^_^_按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、D-乳酸的光学纯度和发酵产率。总乳酸的浓度=(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)X标准样品质量浓度D-乳酸的光学纯度^D-乳酸浓度/总乳酸浓度发酵产率二总乳酸浓度/发酵总时间结果表明，植物乳杆菌(丄.；/flntorwm)SMB-2CGMCC処2566具有良好的发酵性能，在48小时内总乳酸的产量为172g/L，D-乳酸的光学纯度为85-86%，发酵产率为3.58g/L'h。实施例4、利用植物乳杆菌a.;/fl"toww)SMB-2CGMCCJvf22566发酵生产D-乳酸该实施例中所用培养基的组成如下MRS液体培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L,牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠2g/L，吐温801mL/L，MgS04*7H200.58g/L，MnS04*4H200.25g/L。发酵过程中控制pH范围在5.5~6.2。。115。C条件下灭菌20分钟。发酵培养基葡萄糖120g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸钠2g/L、MgS04'7H200.58g/L、MnS04'4H200.25g/L、Tween-801ml/L，Ca(OH)2296g/L。恒定pH5.5，115。C条件下灭菌20分钟。发酵培养基中加入Ca(OH)2的目的是作为中和剂以控制发酵液的pH值。将上述实施例1筛选得到的植物乳杆菌a.//a"tonwOSMB-2CGMCCW2566接种到MRS液体培养基中，35"C厌氧培养到对数生长期，使菌液浓度达到1091011cfu/mL，得到发酵种子液。在装有3L上述发酵培养基的7L发酵罐中按照10%的体积比接入上述发酵种子液，发酵过程中，每12小时补加60mL1000g/L的葡萄糖一次，35"C静置培养48小时，恒定pH5.5，结束发酵。发酵过程结束后，通过高效液相色谱检测发酵液中总乳酸的产量。具体的检测条件如下采用AgilentIIOO液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)测定总乳酸的含量，有机酸分离柱HPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流动相为0.0005mol/L硫酸，流量0.5ral/min，进样量20yL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度4(TC。D乳酸的含量通过D-乳酸检测试剂盒(购自德国拜尔公司)检测。标准乳酸样品购买自Sigma公司。实验设3次重复，3次重复的平均值如表5所示。_表5植物乳杆菌SMB-2在不同发酵时间下的总乳酸产量_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>按照下述公式计算出发酵液中总乳酸的浓度、D-乳酸的光学纯度和发酵产率。总乳酸的浓度=(总乳酸所占面积/标准样品所占面积)X标准样品质量浓度D-乳酸的光学纯度=D-乳酸浓度/总乳酸浓度'发酵产率==总乳酸浓度/发酵总时间结果表明，植物乳杆菌(Z.p/a"tonwz)SMB-2CGMCCJV22566具有良好的发酵性能，在48小时内总乳酸的产量为174g/L，D-乳酸的光学纯度为84-86%，发酵产率为3.62g/L'h。实施例5、植物乳杆菌a.p/fl"toraw)SMB-2CGMCCWs2566的沉降实验将筛选得到的植物乳杆菌SMB-2进行沉降效果的比较，结果如图3和图4所示。图3为植物乳杆菌SMB-2的种子液的沉降效果，图4为植物乳杆菌SMB-2在发酵液中的沉降效果。结果发现，在生长过程中，植物乳杆菌SMB-2易于沉降到发酵罐底部进行生长，这一特性有利于工业生产中菌-液的分离纯化，可以降低乳酸工业生产的成本，具有重要的工业应用价值。序列表〈160>1<210>1〈211〉1440<212〉DNA〈213〉植物孚L杆菌(丄acto6acz7/M/7/a",ar"m)<棚>1gtcccacctt鄉cggctggttcct肪aaggttaccccaccgactttgggtgttacaaac60tctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccggg雄gtattcaccgcggcatgctg120atccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaact180gagaatggctttaagagattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtaccatccat240tgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccacctt300cctccggtttgtcaccggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaactgataa360taagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaac420catgcaccacctgtatccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgcatagt480atgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgct540tgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcgga600atgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcattcat660cgtttacggtatggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttcgagcct720cagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacg780catttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttc840cgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgc900tcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctg960gcacgtagttagccgtggctttctggttaaataccgtcaatacctgaacagttactctca1020gatatgttcttctttaacaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggc1080gttgctccatcagactttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggag1140tttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcaggtcggctacgtatcat1200tgccatggtgagccgttacctcaccatctagctaatacgccgcgggaccatccaaaagtg1260atagccgaagccatctttcaaactcggaccatgcggtccaagttgttatgcggtattagc1320atctgtttccaggtgttatcccccgcttctgggcaggtttcccacgtgttactcaccagt1380tcgccactcactcaaatgtaattcatgatgcaagcaccaatcattaccagagttcgttcg1440权利要求1、植物乳杆菌(L.plantarum)SMB-2，其保藏号为CGMCC№2566。2、一种生产D-乳酸的方法，是发酵植物乳杆菌(A.p/朋tomm)SMB-2CGMCCWs2566得到D-乳酸。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述植物乳杆菌a.p/^7towm)SMB-2CGMCC処2566发酵培养基的组成为葡萄糖120~150g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸钠2g/L、MgS04'7H200.58g/L、MnS04.4H200.25g/L、Tween-801ml/L和用于控制发酵液pH值的中和剂。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中的中和剂为Ca(0H)2或氨水，优选为Ca(OH)2。5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述Ca(OH)2的浓度为296g/L。6、根据权利要求3-5所述的方法，其特征在于:所述发酵培养基的pH为5.5-6.2。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述发酵条件为35-39'C静置培养48小时。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述发酵的培养方式为分批补料发酵培养。9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述分批补料发酵为每12小时补加60mL1000g/L的葡萄糖。10、以权利要求1所述的植物乳杆菌a.//朋torwm)SMB-2CGMCC她2566为活性成分制备的生物菌剂。全文摘要本发明公开了一种生产D-乳酸的方法及其专用植物乳杆菌。本发明所提供的植物乳杆菌是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SMB-2CGMCC№2566。在35-39℃的条件下静置培养植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SMB-2CGMCC№256648小时即可得到D-乳酸。发酵液中总乳酸的浓度为18％，D-乳酸的光学纯度为84-86％，发酵产率为3.75g/L·h。且该植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SMB-2CGMCC№2566易于沉降到发酵罐底部进行生长，有利于工业生产中菌-液的分离纯化，可以降低乳酸工业生产的成本，具有重要的工业应用价值。文档编号A01N63/02GK101302488SQ20081011619公开日2008年11月12日申请日期2008年7月4日优先权日2008年7月4日发明者张延平,徐洪涛,寅李申请人:中国科学院微生物研究所