专利名称：毛花猕猴桃组培快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种猕猴桃科猕猴桃属植物毛花猕猴桃的组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
毛花猕猴桃"cftV^/aer/a^/zaBenth.)，别名白毛猕猴桃、毛冬瓜，是我国特有的一个猕猴桃种，主要分布于我国长江以南。毛花猕猴桃果实富含维生素C和多种活性物质，其维生素C含量高达568.9 1137.0 mg/100g.FW，并具有降低血脂、抗脂质过氧化、清除活性氧自由基、抑制肿瘤细胞及提高免疫力等功能；同时，与其它猕猴桃种相比其果皮极易剥离，上述优良的综合性状已引起猕猴桃研究者和商业生产者的广泛重视。但当前该品种的供苗量不足已成为当前发展的限制因素之一，因此，该品种苗木的快速繁殖方法已受到了广泛的重视。传统生产中多使用嫁接苗或者少量扦插苗，现尚无成熟的可以用于大量生产毛花猕猴桃的组织培养育苗方法。但通过嫁接繁殖优良苗木的速度较慢，而扦插繁殖成活率相对较低并易使植株带菌，种子播种繁殖的实生苗其性状不稳定极不适合园艺作物商业化栽培，同时，长期进行上述常规繁殖会造成品种退化。毛花猕猴桃的研究至今尚在起步阶段，是目前正在开发的新一代猕猴桃，可供参考的资料很少，如张远记，母锡金，蔡起贵等.毛花猕猴桃原生质体再生植株[J].植物学报,1995,37(1): 48-52;张远记，钱迎倩，蔡起贵等，毛花猕猴桃原生质体再生植株根尖染色体数目变异与细胞多核现象[J].植物学报,1997,39(2):102-105，他们经原生质体培养途径获得再生植株；又如WANGT，ATKINSON RG JANS SEN BJ. The choice of Agrobacteriuim strain fortransformation of kiwifruit[J]. Acta Horticulturae, 2006(a), 753-759; WANG T， RANY， ATKINSON RG， GLEAVE AP, GOHEN D. Transformation of Actinidia eriantha:A potential species for ftmctional genomics studies in Actinidia[J]. Plant Cell Rep,2006(b), 25: 425~431;他们的研究虽然也获得了毛花猕猴桃遗传转化植株，但它们的研究目的、使用的外植体及培养再生途径与本发明完全不同。
猕猴桃属植物共有54个种，其中21个种下又有分类群，种与种间差异极大，其中，不同种猕猴桃组织培养研究中较为成功的有美味猕猴桃种和中华猕猴桃种，但即使在同一种内不同分类群或品种其培养方式也各不相同，例如，田娜，徐子勤，何近刚.猕猴桃高频直接再生体系的建立[J].武汉植物学研究，2007, 25 (1) : 79 83;秦永华，张上隆，朱道圩.猕猴桃的组织培养和遗传转化研究进展[J].细胞生物学杂志，2004， 26(1): 57 61;兰大伟，刘永立，原田隆.狗枣猕猴桃叶片离体培养的器官、体细胞胚形成与植株再生[J].果树学报2007, 24( 2) : 218 222;胡家金，熊兴耀，张秋明，甘霖.美味猕猴桃原生质体培养及植株再生技术研究[J].湖南农业大学学报，1998， 24(3): 184-190;朱道圩，秦永华，郅玉宝，易明林，陈占宽.软枣猕猴桃G4c"m'Aa "rgwto)原生质体培养与细胞团再生的初步研究[J].河南农业大学学报,2001， 35(3): 221-223;在这些研究中多使用了价格昂贵的ZT， GA或者酪氨酸；也有需要暗培养或其它特殊操作程序，如在生根前切下小苗置于50 ppm IBA溶液中浸泡2小时或在2 ppm IBA溶液中浸24小时后，再转入生根培养基上诱导生根的；也有些研究目的是为基因遗传转化或为其它生理研究打基础，为此采用了原生质体、子叶或胚组织等外植体，经脱分化形成愈伤组织后再分化过程获得再生。因此适合美味种与中华种的培养方式并不适合毛花猕猴桃种。
发明内容
本发明目的是，针对毛花猕猴桃传统嫁接繁殖、扦插繁殖及种子播种繁殖分别存在的，繁殖速度较慢和成活率较低、植株易带菌及性状不稳定、易造成品种退化等缺陷，提出一种繁殖系数高，生产周期短、程序简单、成本低廉适于毛花猕猴桃快速繁殖的组织培养方法。
本发明目的通过以下技术方案得以实现。毛花猕猴桃组培快速繁殖方法，该方法按以卜一步骤进行
(一) 组培培养基的配制包括基本培养基及各阶段培养基的组分与各组分在每升中所含重量为
1) 基本培养基MS或1/2MS培养基，其中，蔗糖或白糖25 35 g/L，琼脂7 9g/L， pH5.0 6.2;
2) 诱导培养基MS+6-BA2.0 5.0mg/L + NAA0.1 0.5mg/L;
3) 增殖培养基MS+6-BA1.0 5.0mg/L + NAA0.1 0.5mg/L或IBA0.1 0.5mg/L;
4) 生根培养基MS或1/2MS + IBA0.05 1.0 mg/L和/或NAA 0.1 0.5mg/L+活性碳1 g/L;
(二) 外植体的选取与灭菌取毛花猕猴桃半木质化茎段为外植体，经自来水冲洗lh、 70%酒精消毒30~40s、 0.1%升汞水溶液灭菌5 10min或2°/。次氯酸钠水溶液灭菌10 15min后，以无菌水冲洗并用无菌滤纸吸去表面水分后，备用；
(三) 诱导培养将灭菌后外植体切成含单芽切段，接种在诱导培养基上，在温度25。C士3。C，光强2000LuX士500LuX，光照时间16h/d的无菌环境下，经30~35天培养至外植体诱导萌发出初代幼芽或丛芽；
(四) 增殖培养将初代幼芽或丛芽接种在增殖培养基上，在同上条件下经25 45天培养至分化形成2 7倍、芽长2 5厘米的继代幼芽或丛芽；
(五) 生根培养将继代幼芽或丛芽接种到生根培养基中，在同上条件下经10~15天培养至幼苗基部长出5~10条毛细根系，再经20 30天培养至根长
3 7厘米；
(六) 组培苗的驯化与移栽当组培苗长3 6厘米时，移至组培室外先将组培瓶盖拧松培养2天，后开盖培养5天，洗清根部培养基移栽入泥炭珍珠岩=4:1的基质中，置于大棚温室中，浇水、保湿至组培苗成苗、出圃。
所述的生根培养与驯化移栽将步骤(四)生长达2 5厘米的继代幼芽或丛芽洗去基部培养基后，把该基部在100 mg/L IBA水溶液中浸蘸1 s~10 s，并用泡开的苔藓包裹后植入穴盘内；或将该洗去培养基后的芽苗基部，用泡开并挤干水分的苔藓包裹、栽入穴盘内，再用0.6 1.0mg/LIBA水溶液浇湿苔藓；将上述两处理的穴盘放置在阴凉处，每天浇水1至2次以保持苔蘚湿润，经7 14天培养至诱导发根，当根长3厘米以上时，去除根部苔藓并栽入由泥炭和珍珠岩按体积4 : 1配制的基质中，并按常规管理至成苗。
本发明的有益效果是-
1) 本发明提出的毛花猕猴桃组织培养基针对性强、适用性好，外殖体初代幼芽的诱导率达80%以上；继代幼芽的增殖率每个培养周期达2 7倍，20 30天苗高可达2 5厘米，组培苗素质提高，生根率达95%以上，移栽成活率95%以上。
2) 本发明达到了仅采用少量外植体材料即能实现大批量扩繁毛花猕猴苗株的目的，该组培周期仅为80~90天就可移栽入温室，并可周年供苗，极大的降低了育苗成本，提高了育苗效率，可实行规模化生产，推动毛花猕猴桃种植业大力发展。
3)本发明在增殖培养至形成继代幼芽或丛芽的基础上，还提供了一种移出培养基直接在室外诱导生根的方法，大大降低了电、培养基及人工成本，并可
縮短育苗周期4 7天。
具体实施例方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。实施伊
1
2
4
实施伊
1
2
3
4
实施伊
1
2
1:(培养基l)
基本培养基MS培养基，其中蔗糖25g/L，琼脂8g/L， pH5.8;诱导培养基MS+6-BA2.0 mg/L + NAA 0.2mg/L;增殖培养基MS+6-BA5.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L;生根培养基MS+ IBA 0.05mg/L + NAA 0.2mg/L 。2 :(培养基2)
基本培养基MS或1/2MS培养基，其中白糖35 g/L，琼脂9 g/L， pH5.0;诱导培养基MS+6-BA5.0 mg/L + NAA0.4mg/L;增殖培养基MS+6-BA2.0mg/L + NAA 0.3mg/L;生根培养基l/2MS+IBA1.0mg/L。
3:(培养基3)
基本培养基MS或1/2MS培养基，其中蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L， pH6.2;诱导培养基MS+6-BA3.0 mg/L +NAA 0.lmg/L;增殖培养基MS+6-BA3.0 mg/L +NAA 0.5mg/L;4)生根培养基l/2MS+NAA0.3mg/L + IBA0.4mg/L。 实施例4:(培养基4)
1) 基本培养基:MS或l/2MS培养基，其中蔗糖25g/L，琼脂7.5g/L ，pH5.8;
2) 诱导培养基MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L;
3) 增殖培养基MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.4mg/L;
4) 生根培养基1/2MS + IBA 0.6mg/L +活性碳1 g/L。 实施例5:(培养基5)
1) 基本培养基MS或1/2MS培养基，其中蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L， pH5.5;
2) 诱导培养基MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.5mg/L;
3) 增殖培养基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L;
4) 生根培养基1/2MS+IBA0.8mg/L。 实施例6:(培养基6)
1) 基本培养基MS培养基，其中白糖30g/L，琼脂7g/L， pH6.0;
2) 诱导培养基MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L;
3) 增殖培养基MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.5mg/L;
4) 生根培养基MS+ NAA 0. lmg/L + IB A 0.2mg/L +活性碳1 g/L 。 实施例7:(培养基7)
1) 基本培养基MS培养基，其中蔗糖"g/L，琼脂7.5g/L ， pH6,2;
2) 诱导培养基MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.3mg/L;
3) 增殖培养基MS+6-BA4.0mg/L+IBA0.4mg/L;
4) 生根培养基MS+IBA0.1mg/L。
实施例8:(培养基8)
1)基本培养基MS或1/2MS培养基，其中蔗糖30 g/L，琼脂7 g/L， pH6.0;
92) 诱导培养基MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.5mg/L;
3) 增殖培养基MS+6-BA5.0mg/L+IBA0.3mg/L;
4) 生根培养基1/2MS+NAA0.5mg/L。 实施例9:(培养基9)
1) 基本培养基MS或1/2MS培养基，其中白糖25g/L，琼脂7g/L， pH5.8;
2) 诱导培养基MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.5mg/L;
3) 增殖培养基MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.2mg/L;
4) 生根培养基1/2MS+NAA0.4mg/L。 实施例10:(培养基IO)
1) 基本培养基MS或1/2MS培养基，其中蔗糖30 g/L，琼脂8 g/L， pH5.8;
2) 诱导培养基MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.5mg/L;
3) 增殖培养基MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L;
4) 生根培养基1/2MS + NAA0.3mg/L+活性碳1 g/L。
实施例ll:(毛花猕猴桃组培快速繁殖方法l) 按以下步骤进行
1) 基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例1;
2) 外植体的处理与消毒采用毛花猕猴桃优良单株的茎尖和茎段(一年中抽 生的新梢都可作为外植体)，用洗涤剂和自来水冲洗干净后，经70%酒精浸泡30s， 再用0.1%升泶溶液浸泡灭菌10min后，无菌水冲洗并用无菌滤纸吸去表面水分，
切成含单芽切段，备用；
3) 诱导培养在温度25°C±3°C，光强2000LuX士500LuX，光照时间16h/d 的无菌条件下经30天诱导培养，直接从外植体诱导出初代幼芽或丛芽；
4) 增殖培养将初代幼芽或丛芽接种在增殖培养基上，在同上条件下增殖培养35天至分化出大量的继代幼芽或丛芽；
5)生根培养将继代幼芽或丛芽接种到生根培养基上，在同上条件下生 根培养35天至诱导芽苗基部长出根系；
6)组培苗驯化、移栽当组培苗生长达3-5厘米以上，并长出发达根系时，
先将组培瓶移至常温下拧松瓶盖培养2天后，开盖培养5天，取出组培苗，洗
去根部培养基后移栽入泥炭珍珠岩=4: l基质中，最初两周适当遮阴后置大棚 温室中，浇水、保湿至组培苗成苗、出圃。 实施例12:(毛花猕猴桃组培快速繁殖方法2)
本例中，步骤l)基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例2;步骤2) 外植体经70%酒精浸泡40s，再用0.P/。升汞溶液浸泡5min进行消毒；步骤3) 的诱导培养为35天；步骤4)的增殖培养为25天；步骤5)的生根培养为30 天；其余步骤工艺同于实施例11。 实施例13:(毛花猕猴桃组培快速繁殖方法3)
本例中，步骤l)基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例3;步骤2) 外植体经70%酒精浸泡35s，再用0.1%升汞溶液浸泡8min进行消毒；步骤3) 的诱导培养为32天；歩骤4)的增殖培养为30天；步骤5)的生根培养为40 天；其余步骤工艺同于实施例11。 实施例14:(毛花猕猴桃组培快速繁殖方法4)
本例中，步骤l)基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例4;步骤2) 外植体酒精浸泡30s，再用2%次氯酸钠水溶液浸泡15min进行消毒；步骤3) 的诱导培养为30天；步骤4)的增殖培养为40天；步骤5)的生根 养为45 天；其余歩骤工艺同于实施例11。 实施例15:(毛花猕猴桃组培快速繁殖方法5)本例中，步骤1)基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例5;步骤2)
外植体酒精浸泡40s，再用2%次氯酸钠水溶液浸泡10min进行消毒；步骤3) 的诱导培养为35天；步骤4)的增殖培养为45天；步骤5)与6)将生长达2 5厘米的继代幼芽或丛芽洗去基部培养基后，把该基部在100 mg/L IBA水溶液 中浸蘸ls，并用泡开的苔藓包裹后植入穴盘内，放置在阴凉处，每天浇水l至 2次以保持苔藓湿润，经7 14天培养至诱导发根，当根长3厘米以上时，去除 根部苔藓并栽入由泥炭和珍珠岩按体积4 : l配制的基质中，并按常规管理至成 苗；其余步骤工艺同于实施例11。 实施例16:(毛花猕猴桃组培快速繁殖方法6)
本例中，步骤1)基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例6;步骤2) 外植体酒精浸泡35s，再用2。/。次氯酸钠水溶液浸泡12min进行消毒；步骤3) 的诱导培养为32天；步骤4)的增殖培养为35天；步骤5)与6)将生长达2 5厘米的继代幼芽或丛芽洗去基部培养基后，把该基部在100 mg/L IBA水溶液 中浸蘸5s;其余步骤工艺同于实施例15。 实施例17:(毛花猕猴桃组培快速繁殖方法7)
本例中，步骤1)基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例7;步骤2) 至步骤4)同于例11;步骤5)与6)将生长达2 5厘米的继代幼芽或丛芽洗去 基部培养基后，把该基部在100 mg/L IBA水溶液中浸蘸10s;其余步骤工艺同 于实施例15。
实施例18:(毛花猕猴桃组培快速繁殖方法8)
本例中，步骤1)基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例8;步骤2) 至歩骤4)同于例12;步骤5)与6)将牛长达2 5厘米的继代幼芽或丛芽洗去 基部培养基后，用泡开并挤干水分后的苔藓包裹、栽入穴盘基质内，再用0.6 mg/LIBA水溶液浇湿苔藓，将上述处理的穴盘放置在阴凉处，每天浇水1至2次以 保持苔藓湿润；其余步骤工艺同于实施例11。 实施例19:(毛花猕猴桃组培快速繁殖方法9)
本例中，步骤1)基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例9;步骤2)
至步骤4)同于例13，步骤5)与6)将生长达2 5厘米的继代幼芽或丛芽洗去 基部培养基后，用泡开并挤干水分后的苔藓包裹、栽入穴盘基质内，再用0.8mg/L IBA水溶液浇湿苔藓；其余步骤工艺同于实施例18。 实施例20:(毛花猕猴桃组培快速繁殖方法10)
本例中，步骤l)基本培养基和各阶段培养基配方同于实施例10;步骤2)
至步骤4)同例14;步骤5)与6)将生长达2 5厘米的继代幼芽或丛芽洗去 基部培养基后，用泡开并挤干水分后的苔藓包裹、栽入穴盘基质内，再用1.0mg/L IBA水溶液浇湿苔藓；其余步骤工艺同于实施例18。
本发明采用上述组培培养基及与之配套的快繁方法后，外殖体初代幼芽的 诱导率达80%以上；继代幼芽的增殖率每个培养周期达2 7倍，20 30天苗高 可达2 5厘米，组培苗素质提高，生根率达95%以上；移栽成活率90%以上。
权利要求
1、毛花猕猴桃组培快速繁殖方法，其特征在于该方法按以下步骤进行(一)组培培养基的配制包括基本培养基及各阶段培养基的组分与各组分在每升中所含重量为1)基本培养基MS或1/2MS培养基，其中，蔗糖或白糖25～35g/L，琼脂7～9g/L，pH5.0～6.2；2)诱导培养基MS+6-BA2.0～5.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L；3)增殖培养基MS+6-BA1.0～5.0mg/L+NAA 0.1～0.5mg/L或IBA0.1～0.5mg/L；4)生根培养基MS或1/2MS+IBA0.05～1.0mg/L和/或NAA 0.1～0.5mg/L+活性碳1g/L；(二)外植体的选取与灭菌取毛花猕猴桃半木质化茎段为外植体，经自来水冲洗1h、70％酒精消毒30～40s、0.1％升汞水溶液灭菌5～10min或2％次氯酸钠水溶液灭菌10～15min后，以无菌水冲洗并用无菌滤纸吸去表面水分后，备用；(三)诱导培养将灭菌后外植体切成含单芽切段，接种在诱导培养基上，在温度25℃±3℃，光强2000LuX±500LuX，光照时间16h/d的无菌环境下，经30～35天培养至外植体诱导萌发出初代幼芽或丛芽；(四)增殖培养将初代幼芽或丛芽接种在增殖培养基上，在同上条件下经25～45天培养至分化形成2～7倍、芽长2～5厘米的继代幼芽或丛芽；(五)生根培养将继代幼芽或丛芽接种到生根培养基中，在同上条件下经10～15天培养至幼苗基部长出5～10条毛细根系，再经20～30天培养至根长3～7厘米；(六)组培苗的驯化与移栽当组培苗长3～6厘米时，移至组培室外先将组培瓶盖拧松培养2天，后开盖培养5天，洗清根部培养基移栽入泥炭∶珍珠岩＝4∶1的基质中，置于大棚温室中，浇水、保湿至组培苗成苗、出圃。
2、按权利要求1所述的组培快速繁殖方法，其特征在于所述的生根培养与 驯化移栽将步骤(四)生长达2 5厘米的继代幼芽或丛芽洗去基部培养基后， 把该基部在100 mg/L IBA水溶液中浸蘸1 s~10 s，并用泡开的苔藓包裹后植入 穴盘内；或将该洗去培养基后的芽苗基部，用泡开并挤干水分的苔藓包裹、栽 入穴盘内，再用0.6 1.0mg/LIBA水溶液浇湿苔藓；将上述两处理的穴盘放置在 阴凉处，每天浇水1至2次以保持苔藓湿润，经7 14天培养至诱导发根，当根 长3厘米以上时，去除根部苔藓并栽入由泥炭和珍珠岩按体积4 : 1配制的基质 中，并按常规管理至成苗。
全文摘要
本发明公开了毛花猕猴桃组培快速繁殖方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括(一)组培培养基的配制；(二)外植体的选取与灭菌；(三)诱导培养；(四)增殖培养；(五)生根培养；(六)组培苗的驯化与移栽等步骤。该方法培养基针对性强、适用性好，外殖体初代幼芽的诱导率达80％以上；继代幼芽的增殖率达2～7倍，20～30天苗高可达2～5厘米，组培苗素质提高，生根率达95％以上，移栽成活率95％以上。本发明可在果树苗木企业中推广应用。
文档编号A01H4/00GK101647393SQ20091015297
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月24日 优先权日2009年9月24日
发明者吴延军, 宋根华, 张慧琴, 徐红霞, 鸣 谢, 陈俊伟, 隆前进 申请人:浙江省农业科学院