一种中华猕猴桃的组培快繁方法
【专利摘要】一种中华猕猴桃的组培快繁方法，涉及猕猴桃种苗组织培养快速繁殖方法。本发明用当年生幼嫩叶片为外植体，接种在愈伤诱导及丛生芽分化培养基MS+0.3mg/LZT+0.05mg/LNAA上；本发明还提供了改良MS，待丛生芽分化后，转入改良MS+2mg/LZT增殖培养基进行继代，根据苗高转入改良MS+0.015mg/LTDZ增壮培养基中，将符合生根的小苗转入1/2改良MS+0.7mg/LIBA+0.1g/LAC生根培养基中，生根后移栽驯化。本发明愈伤诱导率达96.4%，丛生芽芽高达1.67cm，丛生芽增值系数达3.67，生根率达98.12%，且培养基成本低，繁殖周期短，可实现工厂化生产。
【专利说明】一种中华猕猴桃的组培快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物种苗组织培养快速繁殖方法，尤其涉及中华猕猴桃种苗组织培养快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002]称猴桃(kiwifruit)属称猴桃科(Actinidiaceae)称猴桃属spp.)落叶藤本植物，是一种重要的经济林木和果树。猕猴桃富含Vc、矿物质和花青苷等营养物质(Singletary, 2012),营养价值和药用价值高。近年来,被广泛用于鲜果、饮料、保健用品等食用形式，市场需求量较大(段冬洋等.猕猴桃食疗价值及加工过程中变色机理和控制措施的研究[C].//中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨首届学术研讨会论文集.2006:433-436.)。中华猕猴桃是猕猴桃属的一种，与其它种类的猕猴桃如美味猕猴桃、毛花猕猴桃、葛枣猕猴桃等相比，其抗氧化能力最强，Vc含量更高(宋美晶，不同品种猕猴桃的成分研究[D].辽宁师范大学，2012.)，经济价值高于其它同类产品，市场需求量大，2013年出口价格平均为772.8美元/吨(黄琳琳、新西兰猕猴桃产业发展与营销模式[J].中国果业信息，2013，02:32-34.)，推广种植可满足更多消费者的需求，增加果农的经济收益。然而，其播种繁殖生长周期长、始花年龄长，不利于快速形成猕猴桃的市场价值。
[0003]组织培养是一种无性系快速繁殖方法，具有繁殖周期短、遗传稳定性好、繁殖系数大等特点。已有研究表明，ZT (玉米素)是猕猴桃属植物组培愈伤诱导和增殖的最佳细胞分裂素，已在美味称猴桃( Gonzdilez等，1995)、葛率称猴桃(Takahashi等,2004)、毛花称猴桃(Wu等，2011)中成功诱导出愈伤组织。MS培养基为植物组培通用培养基，无机盐浓度高，但上述文献均未注意能否通过改善MS培养基，降低其硝态盐及钙离子浓度，提高猕猴桃组培苗的生长发育水平。对于猕猴桃丛生芽的增殖，玉米素的综合效应较其他激素好，且变异少。TDZ具有双重效应:低浓度时促进腋芽的增殖，高浓度时促进不定芽和愈伤的增殖(Murthy BNS, Murch S J, Saxena P K.Thidiazuron: A potent regulator ofin vitro plant morphogenesis[J].1n Vitro Cellular & Developmental Biology -Plant, 1998, 34(4): 267-275.)，然而，TDZ浓度未涉及不定芽增壮影响。在猕猴桃生根培养中，IBA综合表现最佳，Wu等(2011)认为诱导毛花猕猴桃(A eriantha)生根最佳的IBA浓度为0.6 mgL' Prado等(2005)提出诱导美味猕猴桃生根的最佳的IBA浓度为0.5mgL'在植物组织培养中，活性炭具有吸附有毒物质和刺激生根的双重作用，多用于生根诱导培养。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种中华猕猴桃的组培快繁方法，该方法根据物种基因型差异性，而与改良MS培养基和不同阶段的组分和浓度联系起来，以提高在各阶段中猕猴桃组培苗的生长发育水平。
[0005]实现上述目的的方法包括叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段，而且:
愈伤诱导及丛生芽分化的培养基为MS +0.3mg/L ΖΤ+0.05 mg/L NAA ；
丛生芽增殖的培养基为改良MS +2mg/L ZT;
丛生芽增壮的培养基为改良MS +0.015mg/L TDZ ；
生根培养的培养基为1/2改良MS +0.7mg/L IBA+0.lg/L AC。
[0006]上述改良MS培养基除具有一般MS培养基的组分外，其无机盐中含400mgr1NH4N03>1010mgr1KN03>320mgr1CaCl2.2H20。
[0007]所述叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段，培养室均可为光照16h/d，光强2000LX，温度24°C，湿度70%。
[0008]所述叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段培养时间根据调查愈伤诱导率及丛生芽分化率、丛生芽增殖率、丛生芽增壮效果和生根率确定。
[0009]本发明所用试剂全称:NAA,1-naphthyla-cetic acid,萘乙酸；IBA,Indole-3-butytric acid,吲哚丁酸；6_BA,6-Benzylaminopurine,6_ 节氨基腺嘌呤；ZT,Zeatin,玉米素；TDZ, Thidiazuron,噻重氮苯基服；AC, Active carbon,活性炭。
[0010]上述改良MS培养基除了无机盐中含^OmgL-1NH4NO3UOlOmgL-1KNOy320mgr1CaCl2.2H20 外， 与一般 MS 培养基的相同组分为 WOmgL-1MgSO4.7H20、170mgL_1KH2P04,22.3mgL_1MnS04.H20,8.6mgL_1ZnS04.7Η20、6.2 mgL_1H3B03,0.83mgL_1KI,0.25mgr1Na2Mo04.2H20、0.025mgr1CoCl2.6H20、0.025mgr1CuS04.5H20、37.SmgL-1Na2-EDTA,27.8 mgL 1FeSO4.7Η20、2 mgL 1 甘氛酸、0.5 mgL 1VB6^0.1 mgL 1VB1^0.5 mgL 1VB3和 100 mgL 1肌醇。
[0011]在本发明中，发明人通过长期观察猕猴桃组培苗的生长发育，发现降低硝态盐及钙离子浓度，更利于其生长。一般MS与本发明改良MS组分对比见表1:
表1 MS与本发明改良MS组分对比表
【权利要求】
1.一种中华猕猴桃组培快繁方法，包括叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段，其特征是: 愈伤诱导及丛生芽分化的培养基为MS +0.3mg/L ΖΤ+0.05 mg/L NAA ； 丛生芽增殖的培养基为改良MS +2mg/L ZT; 丛生芽增壮的培养基为改良MS +0.015mg/L TDZ ； 生根培养的培养基为1/2改良MS +0.7mg/L IBA+0.lg/L AC ； 上述改良MS培养基除与具有一般MS培养基的组分外，其无机盐中含400mg.L_ 1NH4NO3UOlOmg.L^1KNO3>320mg.L-1CaCl2.2H20。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽 增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段，培养室均可为光照16h/d，光强2000LX，温度24°C，湿度70%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述叶片愈伤诱导及丛生芽分化、丛生芽增殖、丛生芽增壮和生根培养四个阶段培养时间分别根据所调查的愈伤诱导率及丛生芽分化率、丛生芽增殖率、丛生芽增壮效果和生根率确定。
【文档编号】A01H4/00GK103548680SQ201310520758
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】张汉尧, 张太奎, 刘小珍 申请人:西南林业大学