专利名称：亨利兜兰种子试管苗的培育方法
技术领域：
本发明涉及植物组织培育技术领域，特别是涉及亨利兜兰种子试管苗的一种无菌培育方法。
背景技术：
亨利兜兰(Paphiopedilum henryanum Braem)是兰禾斗(Orchidaceae)兜兰属(P即hiopedium)植物，是国家一级重点保护濒危物种。《华盛顿公约》(即《濒危野生动植物禾中国际贸易公约》，Convention on Interiiatioiial Trade in Endangered Species ofWild Fauna and Flora, CITES)把所有兜兰属植物列入其附录一名录，受到国际社会的严格保护。兜兰是兰科植物中最具特色的一个类群，也是最奇特的观赏兰花。花形奇特，唇瓣呈兜状，酷似旧时欧洲淑女的拖鞋，故又称拖鞋兰。背萼特别发达，具有艳丽的花纹。兜兰与其他兰花明显不同的地方是2枚能育雄蕊着生在蕊柱的两侧；发达的背萼呈扁圆形或倒心形，在各瓣中最显著。因此，兜兰以其独特魅力和许多优异特性而备受世界花卉爱好者的钟爱。
亨利兜兰分布于中国云南、广西、贵州，越南、缅甸也有分布。花色粉红，上萼片具斑点。花期为夏秋季。亨利兜兰同大多数兰花一样，种子没有胚乳，在自然环境中需与真菌共生才能萌发，且萌发率极低。兰花的传统繁殖方式为分株繁殖，繁殖系数低、速度慢，难以满足保护和开发的要求。兰花的组织培养始于20世纪60年代，之后组培在其它许多兰花上获得了成功。但兜兰人工授粉结实率低，其无菌播种和组织培养难度大，是兰科植物中种子试管培养最困难的属之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供亨利兜兰种子试管苗的一种无菌培育方法，该方法经过对培养基的筛选，优选出适合亨利兜兰种子试管苗培育的培养基，种子萌发率能达到45%以上，成苗率、移栽成活率均在90%以上。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案本发明亨利兜兰种子试管苗的培育方法(1) 种子萌发将亨利兜兰果实灭菌后取出种子，接种于种子萌发培养基上，暗培养3周后转入弱光培养，至种子发育成原球茎，种子萌发培养基为1/4MS + 15% (体积)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%琼脂，PH 5. 2 5. 4;
(2) 增殖分化将原球茎转接到增殖分化培养基上，弱光培养至原球茎分化出芽，增殖分化培养基为1/2MS + 0.5 2.0mg/L 6-BA + 0. 2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+ 15% (V/V)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0.6%琼脂，PH 5. 2 5. 4;
(3) 壮苗生根然后将芽转接到壮苗生根培养基上进行生根培养后即可炼苗移栽，壮苗生根培养基为1/2MS + l.Omg/L NAA + 15% (体积)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+0. 6%琼脂，PH 5. 2 5. 4。
上述增殖分化培养基为1/2MS + 2. Omg/L 6-BA + 0. 2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+15% (体积)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0.6%琼脂，PH 5. 2 5. 4
前述亨利兜兰种子试管苗的培育方法中，所述弱光培养的光照强度为500 1000Lx，培养温度为23 27。C。
进一步的，前述亨利兜兰种子试管苗的培育方法
(1) 种子萌发首先将授粉150天的亨利兜兰果实经表面消毒处理后，在超净工作台上剖开果实，取出种子后接种于种子萌发培养基上，暗培养3周后转入弱光培养，至种子发育成原球茎；
(2) 增殖分化将原球茎转接到增殖分化培养基上，弱光培养至原球茎分化出芽，出芽后10周再继代增殖培养一次；
(3) 壮苗生根然后将芽转接到壮苗生根培养基上进行生根培养，光照强度增加至2000 3000Lx，当苗长至4 5厘米高、根长l. 5 2厘米时即可炼苗移栽。
上述技术方案是通过实验筛选出来的，具体如下
1、实验培养基
种子萌发培养基
(1) MS+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%琼脂，PH 5. 2 5. 4;
(2) 1/2MS+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%琼脂，PH 5. 2 5. 4;
(3) 1/4 MS+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%琼脂，PH 5. 2 5. 4;原球茎增殖及分化培养基
(4) 1/2MS+2. Omg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +28/1^胰蛋白胨+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+ "/1^舌性炭+0. 6%琼脂，PH 5. 2 5. 4;(5) 1/2MS+1. 0mg/L 6-BA+0. 5 mg/L NAA +28/1^胰蛋白胨+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+ "/1^舌性炭+0. 6%琼脂，PH 5. 2 5. 4;
(6) 1/2MS+0. 5mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA +28/1^胰蛋白胨+15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+ "/1^舌性炭+0. 6%琼脂，PH 5. 2 5. 4;
生根壮苗培养基
(7) 1/2MS +1.0 mg/L NAA +15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%琼脂，PH5. 2 5. 4
(8) 1/2MS +1.0 mg/L NAA +6-BAO. 5mg/L +15% (V/V)椰乳+20g/L蔗糖+lg/L活性炭+0. 6%琼脂，PH 5. 2 5. 4。
2、实验方法
2. l人工授粉温室大棚里人工驯化栽培的亨利兜兰自然结实率低，需经人工进行自花或异花授粉，这也是选育新品种的主要手段。
2.2种子灭菌取授粉150d的果实用自来水净后，用75%的酒精表面消毒303，再用O. 1%升汞液消毒15min，无菌水冲洗5次，再浸入95。/。的酒精ls，取出后于酒精灯上点燃，烧尽表面酒精后，在超净工作台上剖开果实，取出种子接种于种子萌发培养基(1) 、 (2) 、 (3)上。进行暗培养3周，转入弱光培养(500 1000Lx)，培养温度(25±2) °C ， 7周左右发育成原球茎。培养基(1)的种子几乎没有萌发；培养基(2)上种子萌发率10%;培养基(3)种子萌发率达45%。可见低盐浓度有利于种子萌发。
2.3原球茎增殖与分化将原球茎转接到原球茎继代增殖分化培养基(4) 、 (5) 、 (6)上，弱光培养(500 1000Lx)，培养温度(25±2) °C 。原球茎均能迅速分化出芽，其中培养基(4)上效果最好，10周左右可继代增殖1次。结果表明细胞分裂素与生长素的比例以10: l效果最佳。
2.4壮苗生根培养将小苗分成单株后转接到壮苗生根培养基(7) 、 (8)上，进行生根培养，光照增加至2000 3000Lx，其中培养基(7)上根系生长较好。当苗长至4 5cm高，根长1.5 2.0cm，可进行炼苗移栽。
2.5炼苗移栽将培养瓶置于大棚中炼苗l周后，取出小苗，洗净培养基，先种植于苔藓中(苔藓用1000倍多菌灵消素)，2个月后转于树皮基质中(用1000倍多菌灵消素)，成活率90%以上。
与现有技术相比，本发明通过对培养基的筛选，优选出了适合亨利兜兰种子萌发、增殖分化和壮苗生根的培养基，种子萌发率可达到45%以上，成苗率、移栽成活率均在90%以上
6，为亨利兜兰的快速繁殖、杂交选育、保护和开发应用提供了一种有效的培育方法。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
详细说明本发明。
(1) 种子萌发首先将亨利兜兰果实灭菌，取授粉150天的亨利兜兰果实用自来水洗净 ，用75%酒精表面消毒30秒，再用O. 1%升汞液消毒15分钟，无菌水冲洗5次，再浸入95%酒 精1秒，取出后于酒精灯上烧尽果实表面的酒精，在超净工作台上剖开果实，取出种子后接 种于种子萌发培养基上，暗培养3周后转入弱光培养，至种子发育成原球茎，种子萌发培养 基的组成为1/4MS + 15% (体积)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%琼脂，PH 5.2 5.4;这里选择低盐浓度的培养基，有利于种子的萌发，萌发率在45%以上。
(2) 增殖分化将原球茎转接到增殖分化培养基上，弱光培养至原球茎分化出芽，出 芽后10周再继代增殖培养一次；优选增殖分化培养基组分为1/2MS + 2.0mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+ 15% (体积)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%琼脂 ,PH 5.2 5.4。
(3) 壮苗生根然后将芽转接到壮苗生根培养基上进行生根培养，光照强度增加至 2000 3000Lx，当苗长至4 5厘米高、根长l. 5 2厘米时即可炼苗移栽，壮苗生根培养基为 :1/2MS + 1.0mg/L NAA + 15% (体积)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0. 6%琼脂，PH 5. 2 5. 4。
(4) 炼苗移栽将培养瓶置于大棚中炼苗l周后，取出小苗，洗净培养基，先种植于苔 藓中(苔藓用1000倍多菌灵消素)，2个月后转于树皮基质中(用1000倍多菌灵消素)，成 活率90%以上。
上述具体实施方式
中的弱光培养的光照强度为500 1000Lx，培养温度为23 27。C。
权利要求
1.亨利兜兰种子试管苗的培育方法，其特征在于(1)种子萌发将亨利兜兰果实灭菌后取出种子，接种于种子萌发培养基上，暗培养3周后转入弱光培养，至种子发育成原球茎，种子萌发培养基为1/4MS+15％(体积)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％琼脂，PH 5.2～5.4；(2)增殖分化将原球茎转接到增殖分化培养基上，弱光培养至原球茎分化出芽，增殖分化培养基为1/2MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L胰蛋白胨+15％(V/V)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％琼脂，PH 5.2～5.4；(3)壮苗生根然后将芽转接到壮苗生根培养基上进行生根培养后即可炼苗移栽，壮苗生根培养基为1/2MS+1.0mg/L NAA+15％(体积)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％琼脂，PH 5.2～5.4。
2.按照权利要求l所述亨利兜兰种子试管苗的培育方法，其特征在于:步骤(2)中所述的增殖分化培养基为1/2MS + 2. Omg/L 6-BA + 0. 2mg/L NAA + 2g/L胰蛋白胨+ 15% (V/V)椰乳+ 20g/L蔗糖+ lg/L活性炭+ 0.6%琼脂，PH 5. 2 5. 4。
3.按照权利要求l所述亨利兜兰种子试管苗的培育方法，其特征在于:所述弱光培养的光照强度为500 1000Lx，培养温度为23 27。C。
4.按照权利要求1至3任一项所述亨利兜兰种子试管苗的培育方法，其特征在于(1) 种子萌发首先将授粉150天的亨利兜兰果实经表面消毒处理后，在超净工作台上剖开果实，取出种子后接种于种子萌发培养基上，暗培养3周后转入弱光培养，至种子发育成原球茎；(2) 增殖分化将原球茎转接到增殖分化培养基上，弱光培养至原球茎分化出芽，出芽后10周再继代增殖培养一次；(3)壮苗生根然后将芽转接到壮苗生根培养基上进行生根培养，光照强度增加至2000 3000Lx，当苗长至4 5厘米高、根长l. 5 2厘米时即可炼苗移栽。
全文摘要
本发明公开了一种亨利兜兰种子试管苗的培育方法，包括种子萌发、增殖分化和壮苗生根，种子萌发培养基为1/4MS+15％(体积)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％琼脂，pH 5.2～5.4；增殖分化培养基为1/2MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2g/L胰蛋白胨+15％(V/V)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％琼脂，pH 5.2～5.4；壮苗生根培养基为1/2MS+1.0mg/L NAA+15％(体积)椰乳+20g/L蔗糖+1g/L活性炭+0.6％琼脂，pH 5.2～5.4。本发明方法的种子萌发率可达到45％以上，成苗率、移栽成活率均在90％以上。
文档编号A01H4/00GK101558744SQ20091030291
公开日2009年10月21日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者罗晓青 申请人:贵州省亚热带作物研究所