专利名称：一种无糖箱式植物组织的培养方法
技术领域：
本发明涉及一种植物组织的培养技术，尤其是涉及一种无糖培养技术。
植物组织的培养技术，从本世纪30年代开始研究，已被广泛地应用于植物体的快速繁殖、脱毒和种质资源的保存，从而促进了生物育种技术的飞跃发展。长期以来传统的植物组织培养方法，是以糖作为植物体的碳源，并补充相应的有机物质。常规的方法存在着培养过程中污染率高，试管苗生根率低，过渡苗成活率低，生产成本高等缺陷。
现有的无糖组织培养技术(参考文献1．Kozait,Fujiwarak,Hagashim.Collected papers on Environmaental Control in MicropropagationVolumel.JoPan:Chiba Vniversity press,1991；2．肖玉兰等。非洲菊无糖组织培养技术的应用研究。园艺学报，1998,25(4))是采用瓶子作培养容器，具有污染率低，植株健壮，过渡苗成活率高的优点。但瓶子由于空间太小，气体循环不畅，即使补充了CO2，也只有通过封口膜上的透气孔才能进入瓶内供植株吸收，CO2的供给量仍然不够，植株生长速度缓慢，且操作困难，成本较高。
本发明的目的是消除现有技术的缺陷，提供一种用培养箱代替瓶子作培养容器，采用无糖培养基，适当光照和通入CO2的培养方法，可有效地克服现有技术的上述问题，操作简便，能促进植株快速生长，进一步降低生产成本，提高经济效益。
本发明提供的无糖箱式植物组织培养方法包括下列步骤一、制作培养箱采用有机玻璃制作培养箱，有机玻璃的厚度可为3～5毫米，箱体的尺寸长×高×宽=500～1000毫米×200～250毫米×500毫米。
二、培养环境的调控给培养箱配置二氧化碳通气系统，光照系统，温控系统和湿控系统，便于调节控制培养条件。
三、配制培养基1、配制培养液①本发明对现有技术中的MS培养液作了重要的改进，采用本发明特别配制的无糖MS培养液，即配方中不添加糖、有机物和维生素，保留了其它成份，无糖MS培养液的配方(单位毫克/升)为NH4NO31650KNO31900KH2PO4170MgSO4·7H2O370CaCl·2H2O 440MnSO4·H2O 22.3ZnSO4·7H2O8.6H3BO36.2KI0.83NaMoO4·2H2O 0.25CuSO4·5H2O0.025FeSO4·7H2O27.8Na2·EDTA 37.3②本发明以无糖培养液为基础配制增殖培养液，其配方(单位毫克/升)为MS(不加糖、有机物和维生素)+(0～0.5)6-苄基氨基嘌呤③本发明以无糖培养液为基础配制生根培养液，其配方为(单位毫克/升)MS(不加糖、有机物和维生素)+(0～0.1)萘乙酸+(0～5000)活性碳。
2、培养基基质种类根据所培养植物的生物学特性，可分别选择下列物质作为基质①琼脂②珍珠岩③砂④蛭石；3、培养基的制作程序①按配方将培养液配制好；②如选择琼脂作为培养基质，可将琼脂溶解后加入培养液，经消毒后，放入培养箱内待用；③如选择珍珠岩或砂或蛭石作基质时，则需要分别消毒，再把培养液加入基质中待用。
四、消毒
1、培养室消毒称量6克高锰酸钾放入一个容器内，再加10毫升甲醛进行熏蒸，紫外灯照射；2、培养箱消毒先把培养箱清洗干净后，用75％的乙醇进行箱体内壁擦拭消毒，然后再使用6克高锰酸钾和10毫升甲醛进行熏蒸消毒；3、培养基消毒①培养液+琼脂经120℃,20分钟高压灭菌消毒或在有盖的容器中煮沸消毒；②培养液+珍珠岩或砂或蛭石的消毒培养液经120℃,20分钟高压消毒或在有盖的容器中煮沸20分钟；珍珠岩、砂、蛭石用一容器装好经120℃,30分钟的高压灭菌。
五、无糖箱式培养1、在无菌条件下，将试管苗分段或分株转接到已装好培养基的培养箱内；2、弱光照时期为7～10天(时间长短根据植物种类或生长情况确定)，其照度为2500～2700勒克斯，每天光照时间10～12小时，培养温度为22～25℃；3、强光照时期从第8～11天开始，其照度调整为6000～8000勒克斯，每天光照14～16小时；4、第8天输入CO2，输入CO2的时间和光照同步进行，其浓度为2000～3500PPm5、湿度控制0～3天或0～5天培养箱内的湿度为100％以后逐渐降为75～85％,20天后为70％；20～25天则可出苗，可直接移栽到苗床和营养袋中，18～25天便可成为商品苗。
本发明利用无糖培养污染率低的优势，采用大的箱式培养容器进行培养，以利于植株对CO2的充分吸收和气体交换，可有效地促进植株的快速生长，进一步降低生产成本，经对彩星，康乃馨，马铃薯，非洲菊，玫瑰和绿巨人等多种植物进行了多次试验，重现性好，具有良好的推广应用前景。
实施例及对比试验供试材料彩星(Limonium latifolium)、马铃薯(Potato)试管苗培养容器①瓶子(容积250毫升)②培养箱(1000毫米×500毫米×250毫米)
试验处理1号样 无糖+瓶子+CO22号样 无糖+培养箱+CO2具体操作在转苗之前，首先对培养箱和培养室进行严格的消毒处理，然后把配制好的培养基倒入培养箱内，待培养基冷却后进行接苗。彩星每箱插苗1500株，马铃薯剪成一叶一个茎段，每箱插3000苗，不论是彩星还是马铃薯都挑均匀一致的苗进行转接。采用瓶子培养，每种植物接种100瓶，彩星每瓶插10苗，马铃薯插18苗。瓶子培养均采用透气封口膜，透气孔面积为157mm2。
无糖培养10天内，光照量2700勒克斯，时间每天12小时；10天后光照量增加为8000勒克斯；光照时间为彩星每天14小时，马铃薯每天16小时；补充CO2的农度3920毫克/mm3，补充CO2的时间和光照同步进行。无糖箱式培养直接把CO2输入到培养箱中。无糖瓶子培养10天内放在培养架上培养，10天后把瓶子放入培养箱内，再输入CO2。马铃薯培养20天后出苗，彩星培养28天后出苗。出苗后直接把苗栽到营养土上，进行过渡炼苗，20天后调查成活率。
试验结果1、培养容器的大小对植株生长的影响极为明显。就培养箱和瓶子而言，瓶子由于空间太小，气体循环不畅，即使补充了CO2，但只有通过封口膜上的透气孔才能进入瓶内供植株吸收，CO2的供给量仍然不够，植株生长缓慢。从表1可以看出同是无糖培养并通入CO2，用培养箱培养的植株的高明显高于用瓶子培养的。彩星平均高出1.97厘米，马铃薯平均高出9.03厘米，而且植株健壮，各项生长指标均优于用瓶子培养的。其中马铃薯的差别尤为明显。原因在于培养箱空间大，便于气体交换，CO2吸收充分。但培养箱只能用于无糖培养，有糖培养只能用于瓶子，因为有糖培养随着培养容器的增大，污染率逐渐增高。只有无糖培养对培养容器体积的大小适应性广。
2、CO2是影响植株生长的重要因素。碳素营养是植物的生命基础，植株要吸收CO2进行光合作用，有糖培养靠糖作为植株的碳源，无糖培养必须补充CO2和增强光照，使植株自身进行光合作用制造有机物。所以CO2的供给是至关重要的。如果只靠空气中的CO2补充远远不能满足植株的需要。从表1可以看出，即使在大型的培养容器中，在8000LX的强光照射下，如果不补充CO2，植物仍然生长不好。在同样的培养条件下，补充CO2可使彩星重量增加35％，株高增加14％，叶片数增加31％，叶面积增加66％，马铃薯生长量增加更多，重量增加303％，株高增加147％，叶片数增加82％，叶面积增加11.91倍。可见CO2对植株生长的重要性。
3、有糖培养和无糖培养成本分析表2表明采用本发明的无糖培养成本分析，彩星平均每株成本降低0.038元，马铃薯降低0.028元，具有良好的经济效益。处理 Trea tment 鲜重 株高 叶片数 叶面积移栽苗数 成活数 移栽成活率试材 培养基糖 培养容器 CO2FreshShoot Leaf number leaf areatransplant live numbertransplantplantlets diumSucrocseVesselweight length numberlive percent(％) (mg/m3)(mg/Pant) (cm) (leaf/plant) (cm3/plant) (Plants) (Plants) (％)彩星MS3 瓶子 559 5.6811.10 17.65 950 831 87.5％(Limonium MS0 (bottle) 3920 561 5.71 9.83 18.35 978 881 90.1latifolum) MS0培养箱 563 7.54 9.77 18.101418 1270 89.6MS0 box3920 758 8.57 12.8 30.081497 1424 95.1马铃薯 MS3 瓶子 135 6.76 6.15 0.731600 1450 90.6Poaoto MS0 (bottle) 3920 113 6.11 6.01 0.711358 1153 84.90MS0培养箱 127 6.12 5.92 0.712245 2018 89.8MS0 box 3920 512 15.1410.81 8.462972 2970 99.9*转苗时调查植物重量 株高 叶片数叶面积(mg/株) (cm) (叶/株) (cm2/株)彩星237 5.527.144.67马铃薯22 1.101.000.12表1．不同的培养方式对植株生长的影响
表2．生产成本对照
权利要求
1．一种无糖箱式植物组织的培养方法，包括①制作培养容器；②培养环境的调控；③配制培养基；④消毒；⑤无糖培养，其特征在于①培养容器为箱体式；②配制培养基所用的MS培养液不添加糖、有机物和维生素；③将二氧化碳输入培养箱。
2．按照权利要求1的方法，其中所述的培养容器是采用有机玻璃制作培养箱，有机玻璃的厚度可为3～5毫米，箱体的尺寸长×高×宽=500～1000毫米×200～250毫米×500毫米。
3．按照权利要求1的方法，其中所述的无糖MS培养液进一步配制成增殖培养液，其配方(单位毫克/升)为MS(不加糖、有机物和维生素)+(0～0.5)6-苄基氨基嘌呤；进一步配制生根培养液，其配方为(单位毫克/升)MS(不加糖、有机物和维生素)+(0～0.1)萘乙酸+(0～5000)活性碳。
4．按照权利要求1的方法，其中所述的培养基的基质可为琼脂或珍珠岩或砂或蛭石。
5．按照权利要求4的方法，其中所述的培养基的制作程序为①按配方将培养液配制好；②如选择琼脂作为培养基质，可将琼脂溶解后加入培养液，经消毒后，放入培养箱内待用；③如选择珍珠岩或砂或蛭石作基质时，则需要分别消毒，再把培养液加入基质中待用。
6．按照权利要求1的方法，其中所述的消毒包括①培养室消毒称量6克高锰酸钾放入一个容器内，再加10毫升甲醛进行熏蒸，紫外灯照射；②培养箱消毒先把培养箱清洗干净后，用75％的乙醇进行箱体内壁擦拭消毒，然后再使用6克高锰酸钾和10毫升甲醛进行熏蒸消毒；③培养基消毒培养液十琼脂经120℃,20分钟高压灭菌消毒或在有盖的容器中煮沸消毒；培养液十珍珠岩或砂或蛭石的消毒培养液经120℃,20分钟高压消毒或在有盖的容器中煮沸20分钟；珍珠岩、砂、蛭石用一容器装好经120℃,30分钟的高压灭菌。
7．按照权利要求1的方法，其中所述的无糖培养工序包括①在无菌条件下，将试管苗分段或分株转接到已装好培养基的培养箱内；②弱光照时期为7～10天，其照度为2500～2700勒克斯，每天光照时间10～12小时，培养温度为22～25℃；③强光照时期从第8～11天开始，其照度调整为6000～8000勒克斯，每天光照14～16小时；④第8天输入CO2，输入CO2的时间和光照同步进行，其浓度为2000～3500PPm；⑤湿度控制0～3天或0～5天培养箱内的湿度为100％以后逐渐降为75～85％，20天后为70％；20～25天则可出苗，可直接移栽到苗床和营养袋中，18～25天便可成为商品苗。
全文摘要
本发明涉及植物组织的培养方法。用培养箱代替瓶子作培养容器,以利于植株对CO
文档编号A01H4/00GK1214858SQ9812186
公开日1999年4月28日 申请日期1998年11月20日 优先权日1998年11月20日
发明者肖玉兰, 赵家聪, 朱云霞, 韩亚平 申请人:昆明市环境科学研究所