专利名称：半滑舌鳎三倍体的诱导方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类的养殖方法，特别是涉及一种三倍体半滑舌鳎的生产方法， 该技术属于海洋生物技术领域。
背景技术：
半滑舌鳎味道鲜美、口感爽滑，是我国海水养殖业近年开发的养殖品种，具有很高的经济价值。但半滑舌鳎雌雄生长差异大，雌性明显快于雄性。雄性生长速度缓慢，经二年的培育也难达到商品鱼规格，养殖者常在半年后把雄鱼逐渐淘汰掉，而只留下雌鱼养殖到商品规格。因此，实际成活率相当于雌鱼的比例。人工育苗所获得的鱼苗中，雄性比例一般在60%以上，有时能多达到70%。50%以上的尾数在养殖半年以上后才被淘汰掉，使养殖成本大幅提高，养殖效益大幅度下降，严重地影响了养殖者的积极性。为解决这些问题，研究者们进行了许多有益的尝试，主要集中在雌性单性化诱导及养殖环境的优化方面，但是至今没有明显的效果。但从国内外水产动物研究的趋势来看， 三倍体技术是具有潜力的一种方法。三倍体水产动物由于具有不育性的特点，即性腺不能发育成熟或发育畸形，而不能繁殖后代，因此没有性成熟或繁殖方面的能量损耗，避免了繁殖阶段的生长停止或高死亡率。目前，三倍体水产动物在控制过度繁殖、加快生长速度等方面都显示了良好的效果。因此根据半滑舌鳎的特性，开发一种诱导方法，获得三倍体半滑舌鳎，回避雄性生长速度缓慢的缺点，以改善半滑舌鳎的生长速度，提高其经济效益和社会效益是养殖业者的共同期盼。
发明内容
本发明旨在提供一种半滑舌鳎三倍体的诱导方法。本发明的步骤为1)选取性腺成熟的半滑舌鳎雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；2)将精液与卵粒均勻混合，室温静置2min，加入海水进行人工受精；3)三倍体获得将受精后2-lOmin的受精卵转移至0-10°C海水浴中进行冷休克 15-55min，抑制第二极体的形成及其排出，使染色体组加倍。4)、解除休克将卵移至常温海水中孵化，按照普通半滑舌鳎苗种生产方法管理，培育半滑舌鳎三倍体鱼苗。在步骤2)中，海水水温为20-25°C。在步骤3)中，海水中起始冷休克的时间为受精后2-8min;冷休克持续时间为 15-55min ；冷休克温度为3_8°C。在步骤4)中，海水孵化的温度为20_25°C。更优选地，步骤3)中，海水中起始冷休克的时间为受精后6-8min;冷休克持续时间为20-40min，冷休克温度为4-6°C ；步骤4)中，海水孵化的温度为22°C。 采用上述方法诱导，能够得到较高的诱导率。本发明的进一步方案为诱导得到三倍体半滑舌鳎后，利用染色体核型分析、流式细胞仪等技术测定上述鱼体的染色体倍数，鉴别、筛选出三倍体半滑舌鳎进行培育。本发明的有益效果在于1.本发明通过利用低温休克方法进行诱导，并通过控制诱导持续时间，抑制第二极体释放，从而大大提高三倍体半滑舌鳎的诱导率，据实验统计，所获得的三倍体半滑舌鳎的人工诱导率可达80%以上。2.本发明工艺简单，成本低，可操作性强，避免了化学方法进行诱导带来的污染。3.采用本发明所述方法培育的三倍体半滑舌鳎，具有生长速度快、个体规格大、养殖成活率高，抗病能力强等优点，具有良好的经济效益和社会效益。在半滑舌鳎三倍体诱导中，其中最优选的诱导条件为，选取性腺成熟的半滑舌鳎雌鱼和雄鱼，分别采集成熟卵和精液，人工受精，受精后 Smin用4°C的海水浴冷休克处理30min，抑制第二极体排出，然后在22°C的海水中孵化，完成冷休克法的三倍体诱导。采用该条件进行半滑舌鳎的三倍体诱导，实验结果表明，受精率=34. 1%，孵化率 =82. 45%，三倍体率达88%。三倍体半滑舌鳎诱导中，孵化率较低影响了三倍体诱导率的进一步提高，即使在本发明的实验条件下，一般孵化率也只在50%左右，然而该条件下诱导，并不影响其孵化率。
图1半滑舌鳎二倍体鱼苗细胞DNA荧光分布直方2半滑舌鳎三倍体鱼苗细胞DNA荧光分布直方图
具体实施例方式以下实验例和实施例将对本发明做进一步的说明。实验例1半滑舌鳎三倍体的倍性鉴定采用德国Partec公司Cystain DNA 1 st印染液一步法染色，通过流式细胞仪测定细胞DNA含量来鉴定倍性。1、组织细胞悬液制备及测定采用随机抽取方式对60日龄半滑舌鳎三倍体进行鉴定，每次以4尾二倍体作为对照。(1)组织细胞提取及DNA荧光染色取每一尾鱼的活体尾鳍约1mm3，放入1. 5mL微量离心管中，加入Cystain DNA 1 st印染液0. 5ml，剪碎尾鳍组织至肉眼看不见块状物， 再轻轻研至均浆状；用300目德国Partec公司生产的细胞过滤网过滤，再向滤液中加入 CystainDNA 1 st印染液0. 5ml，进一步染色。(2)流式细胞仪测定PARTEC为德国Partec Gmbh公司生产，型号PA，该机激发光源为负离子激光器。测量前，用鞘液调整细胞浓度在IX 106个/ml左右，测量时保持测量速率在200 300个/S。选正常二倍体细胞悬液为对照样品。(3)检测控制测定前调校流式细胞仪使管道畅通，喷嘴清洁，仪器处于最佳状态，进行FL0WCHECK校正，使各通道的变异系数(CV)稳定在3%以下，DNA含量由仪器自动检出。通过控制流速保持细胞分离纯度。2、检测原理与表示方法以二倍体对照组细胞为参考计算二倍体和三倍体频率，细胞DNA含量以DNA指数 (DNAindex, DI)表示。DI =处理组细胞G0/1峰值道数/对照组细胞G0/1峰值道数均值以DI = 1. 0士0. 1为DNA 二倍体的判断标准。如果DI = 1. 5士0. 1，则为三倍体。对三倍体处理组与二倍体对照组的DNA进行分析(表1)，结果表明二者细胞DNA 的G0/1峰值道数差异显著。流式细胞仪给出的对照组与三倍体处理组细胞DNA含量荧光分布直方图见图1和图2。表1三倍体处理组与二倍体对照组的DNA比较(均值士标准差)
权利要求
1.一种半滑舌鳎三倍体的诱导方法，其特征在于包括如下步骤1)选取性腺成熟的半滑舌鳎雄鱼和雌鱼，分别采集精液和成熟卵子；2)将精液与卵粒均勻混合，搅拌后室温静置2min，加入海水进行人工受精；3)三倍体获得将受精后O-IOmin的受精卵转移至2-10°C海水浴中进行冷休克处理 15-55min,使染色体组加倍。4)解除冷休克将卵移至海水中孵化，按照普通半滑舌鳎苗种生产方法管理，培育半滑舌鳎三倍体鱼苗。
2.如权利要求1所述的半滑舌鳎三倍体诱导方法，其特征在于步骤2)中，海水水温为20-25 °C。
3.如权利要求1所述的半滑舌鳎三倍体诱导方法，其特征在于海水中起始冷休克的时间为受精后2-8min ；冷休克持续时间为15-55min ；冷休克温度为 3-8"C。
4.如权利要求1所述的半滑舌鳎三倍体诱导方法，其特征在于步骤4)中，海水孵化的温度为20-25°C。
5.如权利要求1所述的半滑舌鳎三倍体诱导方法，其特征在于海水中起始冷休克的时间为受精后6-8min ；冷休克持续时间为20-40min，冷休克温度为 4-6 °C ；
6.如权利要求1所述的半滑舌鳎三倍体诱导方法，其特征在于步骤4)中，海水孵化的温度为22°C。
7.如权利要求1所述的半滑舌鳎三倍体诱导方法，其特征在于选取性腺成熟的半滑舌鳎雌鱼和雄鱼，分别采集成熟卵和精液，人工受精，受精后 2-10min用3°C的海水冷休克处理18min，抑制第二极体排出，然后在22°C的海水中孵化。
8.如权利要求1所述的半滑舌鳎三倍体诱导方法，其特征在于选取性腺成熟的半滑舌鳎雌鱼和雄鱼，分别采集成熟卵和精液，人工受精，受精后4min 用8 V的海水浴冷休克处理25min，抑制第二极体排出，然后在22°C的海水中孵化，完成冷休克法的三倍体诱导。
9.如权利要求1所述的半滑舌鳎三倍体诱导方法，其特征在于选取性腺成熟的半滑舌鳎雌鱼和雄鱼，分别采集成熟卵和精液，人工受精，受精后Smin 用4°C的海水浴冷休克处理30min，抑制第二极体排出，然后在22°C的海水中孵化，完成冷休克法的三倍体诱导。
全文摘要
一种半滑舌鳎三倍体的诱导方法，该技术属于海洋生物技术领域。其主要步骤为选取发育成熟的半滑舌鳎雌鱼和雄鱼，分别采集成熟卵和精液，人工受精，受精后2-10min用2-10℃的海水冷休克处理15-55min，然后在20-25℃的海水中孵化，完成冷休克法的三倍体诱导。本方法发明工艺简单，成本低，可操作性强，并且大大提高三倍体半滑舌鳎的诱导率，据实验统计，所获得的三倍体半滑舌鳎的人工诱导率可达80％以上，三倍体半滑舌鳎的人工诱导率最高可达88％，具有良好的经济效益和社会效益。
文档编号A01K61/00GK102246708SQ201010175409
公开日2011年11月23日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者侯吉伦, 刘永新, 刘海金, 张晓彦, 杨立更, 王玉芬, 赵文江 申请人:中国水产科学院研究院, 中国水产科学院研究院北戴河中心实验站