专利名称：一种复合益生素饲料添加剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种饲料添加剂，尤其涉及一种复合益生素饲料添加剂。背景资料近年来，畜牧业生产中大多采用抗生素来防治疾病，这不但使动物肠道正常菌群 失调，而且在畜禽产品中出现大量的药物残留。随着人们生活水平的不断提高和健康意识 的增强，饲用抗生素的药残副作用日益受到人们关注。益生素是通过动物消化道生物竞争 性排斥作用，抑制有害菌群的生长，形成优势菌群或者增强非特异性免疫功能来预防疾病， 从而促进了动物生长、提高了饲料的转化率。益生素饲料添加剂是一种天然的生物活性制 剂，具有无毒、无抗药性、无副作用的特点，作为安全、高效、可替代饲用抗生素又无药残的 产品已成为饲用添加剂的一个发展方向。益生素是具有活性的生物制剂，使用益生素的关键是保证这些微生物被混入饲料 后，能保持活性，直至进入动物肠道的相应位置繁殖。影响益生素活性的因素很多，对于固 体干燥的添加剂而言，其中水分含量稳定在一定的水平至关重要。这样既可以保持其活性， 甚至稍作繁殖，又不至于使其大量繁殖而争夺营养以及代谢物相互拮抗。而且，益生素制剂 在加工过程中，要求菌体与饲料添加剂有一定的粘附能力，这样才便于这些活菌随着添加 剂的加入而被动物采食。动物钙质不足时，会导致生长迟缓、骨骼发育不良，轻者骨脆易折、变形弯曲，形成 软骨症，重者可发展成佝偻病，其临床症状与维生素D缺乏症相似。如能在益生素饲料添加 剂中增加动物易于吸收的有机钙，则可在保留益生素饲料添加剂优点的同时，给动物体补 充钙质。如何能使益生素饲料添加剂中既富含动物容易吸收的有机钙，同时又能使益生素 菌体保持稳定的活性，增强与饲料间的粘合作用而易于被动物采食，从整体上提高益生素 饲料添加剂的功效？象中国专利申请CN200810136835. 4益生素饲料中添加的磷酸氢钙， 仅是单纯补充钙质，并不能从整体上提高益生素饲料添加剂的利用率。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种新型复合益生 素饲料添加剂，该添加剂不但富含动物容易吸收的有机钙，同时益生素菌体能保持稳定的 活性，与饲料间的粘合作用强而易于被动物采食，从而提高益生素的利用率，促进动物生 长，提高养殖经济效益。本发明的另一目的是提供所述复合益生素饲料添加剂的制备方法。本发明提供的一种复合益生素饲料添加剂，所述添加剂包含益生素、填充料和聚 谷氨酸钙，所述聚谷氨酸钙的重量与益生素及填充料混合物的重量比为0.001-0. 005 1。其中的聚谷氨酸钙(Y -PGA-Ga) y -PGA-Ga是聚谷氨酸(Y -PGA)与钙盐鳌合而生 成的。聚谷氨酸是由谷氨酸(Glu)的α-氨基和Y-羧基缩合而成，分子量分布在IOOkDa 到IOOOkDa之间。Y-PGA的生产可以利用纳豆通过生物技术提取，也可以由微生物发酵技术获得，还可以利用生化法进行人工合成。本发明中所用的聚谷氨酸是通过微生物发酵法 生产而得。2007年第28卷第5期《食品研究与开发》，18-20页报道有《、-聚谷氨酸的微 生物发酵法生产及其表征初步分析》。本发明通过在复合益生素饲料中添加重量比0.001-0. 005 1的聚谷氨酸钙，成 功的发明了一种新型复合益生素饲料添加剂，它不但富含动物容易吸收的有机钙，又因聚 谷氨酸钙优良的水溶性和超强的保水性和吸附性，能够显著提高益生素菌体的存活率，增 加添加剂和饲料间的粘合作用，提高益生素的利用率，从而提高动物的抗病能力，改善动物 消化机能，促进动物生长而提高养殖经济效益。进一步，所述聚谷氨酸钙纯度大于90%。进一步，所述益生素干粉与填充料的重量比为1 0. 2 1. 8。进一步，所述的益生素为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、啤酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。进一步，所述三种固体菌粉的重量比为1 0.8-1.2 0.8-1.2。进一步，所述填充料为沸石。本发明还提供所述复合益生素饲料添加剂的制备方法，包括(1)将益生素菌种 进行分离纯化后保藏，并对保藏菌种传代；(2)对保藏的菌种活化，先进行摇瓶培养，再经 过液体发酵罐培养，然后进行固体发酵培养，将固体发酵菌种干燥至水分含量8% -15%, (3)各干燥菌粉按比例混合后加入重量比1 0.2 1.8的填充料混勻，混合物中再加入重 量比1 0.001-0.005的聚谷氨酸钙，(4)混合均勻，分装。进一步，所述益生素菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)和·季L If lif (Lactobacillus ρIantarum) ； Bf Φ tt ^ 芽孢杆菌(Bacillus subtilis)利用营养琼脂培养基进行纯化、保藏及活化，啤酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)利用黄豆芽汁培养基纯化、保藏及活化，植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)利用MRS改良培养基纯化、保藏及活化。其中，营养琼脂培养基为牛肉膏3. 0克，蛋白胨10克，氯化钠5. 0克，琼脂15克， 水1000毫升，调整PH值到7.2-7.6，分装，121°C灭菌30分钟。黄豆芽汁培养基为黄豆芽 100克，琼脂15克，葡萄糖20克，水1000毫升；洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟。用纱布过滤， 滤液中加入琼脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补足水分到1000毫升，分装，121°C灭 菌20分钟。MRS改良培养基为蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠 5g,柠檬酸二铵2g，吐温80 ImL,硫酸镁0. 58g，硫酸锰0. 05g,磷酸氢二钾2g，琼脂15_17g， 水IOOOmL ；灭菌前pH调至6. 12-6. 2，121°C灭菌20分钟。进一步，在摇瓶培养中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)采用肉汤培养基，啤酒 酵母(Saccharomyces cerevisiae)采用改良黄豆芽汁培养基，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)采用MRS改良培养基，摇瓶培养温度分别为枯草芽孢杆菌31_33°C，啤酒酵母 28-30°C，植物乳杆菌36-38°C ；摇床转速为140-150r/min ；当摇瓶培养菌数达到所需活菌 数后接种到液体发酵罐培养，液体发酵培养基与摇瓶培养基相同，液体发酵培养温度与摇 床培养温度相同。其中肉汤培养基为牛肉膏3. 0克，蛋白胨10克，氯化钠5. 0克，水1000毫升，调 整pH值到7. 2 7. 6，分装，121°C灭菌30分钟；改良黄豆芽汁培养基培养基为黄豆芽120克，葡萄糖25克，水1000毫升，洗净黄豆芽，加水煮沸30分钟，用纱布过滤，滤液中加入琼 脂，加热溶解后放入糖，搅拌使它溶解，补足水分到1000毫升，分装，121°C灭菌20分钟；MRS 改良培养基如上述。通常，当摇瓶培养菌数达到IO9CfVmL后接种到液体发酵罐进行培养。进一步，在固体发酵培养时将所述枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌三 种菌的发酵液分别接种于固体培养基上进行固体发酵，固体发酵所用的培养基均为 重量百分比浓度0. 20-0. 15%的尿素溶液中加入麸皮，所述尿素溶液与麸皮的重量比 为1 1.1-1.3，121°C灭菌45-50分钟，三种菌的固体发酵温度均与摇瓶培养温度相 同，定期检测活菌数，达到所需活菌数时，发酵结束；所述三种菌粉干燥后按重量比 1 0. 8-1. 2 0. 8-1. 2 混合。三种菌粉干燥后，酵母活菌数应达到1.0X108cfU/g(检测方法见附录C)以上， 枯草芽孢杆菌的活菌数应达到1.0乂109(^11/^(检测方法见附录幻以上，植物乳杆菌的活 菌数应达到1.0X107Cfu/g(检测方法见附录B)以上。本发明的有益效果在于(1)通过给益生素添加剂中加入具有微环境保水作用的聚谷氨酸钙(Y -PGA-Ga)， 以及添加剂中以麸皮为主原料的营养物质，使益生菌在保存期内能有水分和营养稳定的生 长环境，提高了菌体的存活率。(2)所加入的聚谷氨酸钙(Y -PGA-Ga)螯合有动物易于吸收的有机钙，显著改善 动物因缺钙而引发的疾病，提高养殖动物的抗病能力，降低死亡率，提高出栏率，提高了养 殖效益。(3)所加入的聚谷氨酸钙(Y-PGA-Ga)具有的超强粘附性，增强了益生菌与饲料 间的粘合作用，提高了添加剂的利用率。
具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。实施例1 对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)利用营养琼脂培养基进行纯化、保藏及 活化，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)利用黄豆芽汁培养基纯化、保藏及活化，植 物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)利用MRS改良培养基纯化、保藏及活化。进一步摇 瓶培养，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)采用肉汤培养基，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)采用改良黄豆芽汁培养基，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)采用MRS 改良培养基，摇瓶培养温度分别为枯草芽孢杆菌33°C，啤酒酵母28°C，植物乳杆菌37°C ； 摇床转速为140-150r/min ；当药瓶培养菌数达到109cfu/mL时接种到50L液体发酵罐培养， 液体发酵培养基与摇瓶培养基相同，液体发酵培养温度与摇床培养温度相同。将上述枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌三种菌的发酵液分别接种于固体培 养基上进行固体发酵，培养基均为重量百分比浓度为0.2%的尿素溶液中加入麸皮，尿素 溶液与麸皮的重量比为1 1. 3，121°C灭菌45-50分钟，三种菌的固体发酵温度均与摇瓶 培养温度相同，定期检测活菌数，达到所需活菌数时，发酵结束，实验室用干燥箱58°C吹风 干燥到水分含量为13. 5%，各自得到固体菌粉100kg。
将三种固体菌粉按照1 1 1的比例混合后，用稀释涂布法分别对三个菌 种计数，酵母活菌数为2.0X108cfU/g(检测方法见附录C)，枯草芽孢杆菌的活菌数为 2. OX 109cfu/g (检测方法见附录A)，植物乳杆菌的活菌数为1. 6 X 107CfU/g (检测方法见 附录B)。将混合后的固体菌粉按照1 1的比例加入300kg沸石粉，再加入纯度为90%的 聚谷氨酸钙(购自浙江省嘉兴市海宁紫金港生物科技有限公司)3. 0kg，混合均勻，得到本 发明的复合益生素饲料添加剂。实施例2与实施例1基本相同，所不同之处在于枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌三 种菌50L发酵液作为一级种子按10%的比例分别接种于500L液体发酵罐。将上述枯草芽 孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌三种菌的500L发酵液分别接种于固体培养基上进行固体 发酵，培养基均为重量百分比浓度为0. 2%的尿素溶液中加入麸皮，尿素溶液与麸皮的重 量比为1 1. 2，121°C采用诸城市强大机械厂生产的单锅卧式全不锈钢700型杀菌锅，灭 菌50分钟，再各自接种后，转入固体发酵池，发酵池为固体通风制曲池，发酵池体积为宽 1. 2mX长3mX高1. 5m,固体发酵结束，采用无锡市轻大化工机械设备厂生产的DGS2000型 低温干燥机58°C干燥到水分含量13. 0%，各自得到固体菌粉1吨。将三种固体菌粉按照1 1 1的比例混合后，用稀释涂布法分别对三个菌 种计数，酵母活菌数为1.8X108cfU/g(检测方法见附录C)，枯草芽孢杆菌的活菌数为 1. 5 X 109CfU/g (检测方法见附录A)，植物乳杆菌的活菌数为1. 2X 107cfu/g (检测方法见 附录B)将混合后的固体菌粉按照1 1的比例加入3吨沸石粉，再加入纯度为90%的聚谷 氨酸钙(购自浙江省嘉兴市海宁紫金港生物科技有限公司)12kg，用江苏东台粮油输送机 械德州总部生产的型号为DSH/SLH 6的混合机混合均勻，得到复合益生素制剂，分装。实施例3 将实施例2中的产物与按照实施例2中方法制备但不加入聚谷氨酸钙的益生素饲 料添加剂对照组在18°C下贮存，定期取样测定菌体活菌数。枯草芽孢杆菌采用营养琼脂稀 释培养计数法(见附录A)，植物乳杆菌采用MRS稀释培养计数法(见附录B)，啤酒酵母采 用孟加拉红稀释培养计数法测定活菌数(见附录C)。结果见下表
权利要求
1.一种复合益生素饲料添加剂，其特征在于，所述添加剂包含益生素、填充料和聚谷氨 酸钙，所述聚谷氨酸钙的重量与益生素及填充料混合物的重量比为0.001-0. 005 1。
2.按照权利要求1所述的复合益生素饲料添加剂，其特征在于，所述聚谷氨酸钙纯度 大于90%。
3.按照权利要求1所述的复合益生素饲料添加剂，其特征在于，所述益生素与填充料 的重量比为1 0.2 1.8。
4.按照权利要求1所述的复合益生素饲料添加剂，其特征在于，所述的益生素为枯 草芽孢杆菌Bacillus subtilis、啤酒酵母Saccharomyces cerevisiae和植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum。
5.按照权利要求4所述的复合益生素饲料添加剂，其特征在于，所述三种固体菌粉的 重量比为1 0. 8-1. 2 0. 8-1. 2。
6.按照权利要求1所述的复合益生素饲料添加剂，其特征在于，所述填充料为沸石。
7.按照权利要求1所述的复合益生素饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述制备 方法包括(1)将益生素菌种进行分离纯化后保藏，并对保藏菌种传代；(2)对保藏的菌种 活化，先进行摇瓶培养，再经过液体发酵罐培养，然后进行固体发酵培养，将固体发酵菌种 干燥至水分含量8% -15%, (3)各干燥菌粉按比例混合后加入重量比1 0. 2 1. 8的填 充料混勻，混合物中再加入重量比1 0. 001-0. 005的聚谷氨酸钙，(4)混合均勻，分装。
8.按照权利要求7所述的复合益生素饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述益生 素菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)利用 营养琼脂培养基进行纯化、保藏及活化，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)利用黄豆 芽汁培养基纯化、保藏及活化，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)利用MRS改良培养 基纯化、保藏及活化。
9.按照权利要求7所述的复合益生素饲料添加剂的制备方法，其特征在于，在摇瓶 培养中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)采用肉汤培养基，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)采用改良黄豆芽汁培养基，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)采用MRS 改良培养基，摇瓶培养温度分别为枯草芽孢杆菌31-33°C，啤酒酵母28-30°C，植物乳杆菌 36-38°C;摇床转速为140-150r/min ；当摇瓶培养菌数达到所需活菌数后接种到液体发酵罐 培养，液体发酵培养基与摇瓶培养基相同，液体发酵培养温度与摇床培养温度相同。
10.按照权利要求7所述的复合益生素饲料添加剂的制备方法，其特征在于，在固体发 酵培养时将所述枯草芽孢杆菌、啤酒酵母和植物乳杆菌三种菌的发酵液分别接种于固体培 养基上进行固体发酵，固体发酵所用的培养基均为重量百分比浓度0. 2-0. 15%的尿素溶 液中加入麸皮，所述尿素溶液与麸皮的重量比为1 1. 1-1.2，121°C灭菌45-50分钟，三 种菌的固体发酵温度均与摇瓶培养温度相同，定期检测活菌数，达到所需活菌数时，发酵结 束；所述三种菌粉干燥后按重量比1 0. 8-1.2 0.8-1. 2混合。
全文摘要
本发明公开了一种复合益生素饲料添加剂，所述添加剂包含益生素、填充料和聚谷氨酸钙，所述聚谷氨酸钙的重量与益生素及填充料混合物的重量比为0.001-0.005∶1。其中益生素是枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和啤酒酵母。其中聚谷氨酸钙(γ-PGA-Ga)是由谷氨酸(Glu)的α-氨基和γ-羧基缩合而成的一种高分子量聚合物钙盐，具有优良的水溶性和超强的保水性和吸附性，它不但能提供动物容易吸收的有机钙，还能显著提高益生素菌体的存活率，增加添加剂和饲料间的粘合作用，提高益生素的利用率，从而提高动物的抗病能力，促进动物生长，提高养殖经济效益。
文档编号A23K1/16GK101999525SQ20101052789
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者孙国杰, 李丹丹, 李兴峰, 杜超, 王英泽, 陈卫锋, 韩雪, 魏景芳 申请人:河北科技大学