专利名称：来自放线菌的杀虫发酵液的制作方法
来自放线菌的杀虫发酵液与相关申请的交叉引用本申请要求2009年11月6日递交的美国系列号61/258，716和2009年11月9日递交的美国系列号61/259，549的权益，每一个的内容都在此通过引用而并入。关于对在联邦资助的研究或发展之下作出的发明的权利的声明不适用
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背景技术：
昆虫仅在美国就引起超过二百二十亿美元的作物损失。许多广泛使用的杀虫剂是较旧的神经毒性化合物，并且对于新的、更安全的化学品存在大量需求。美国专利号6，682，925中描述的菌株NRRL No. 30232是专利化的鲜黄链霉菌(Streptomycesgalbus)菌株,其产生一组紧密相关的大环内酯称作都奈霉素(dunaimycins),所述都奈霉素显示出杀虫活性，特别是抗鳞翅目(毛毛虫)的杀虫活性。都奈霉素是由放线菌产生的24元大环内酯，其首先在二十世纪90年代早期被Abbott Laboratories的研究组报道。Abbott的研究者阐明了各种都奈霉素品种Al，Cl，C2, D2，D2S，D3和D4S的结构；研究了其抗微生物活性和免疫抑制活性；并且描述了产生性生物体的分类,两种淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)的菌株。Karwowski, T. P.,等人 Tournalof Antibiotics Dec. 1991，p.1312-1317 ；Hochlowski, T.E. Tournal of Antibiotics,Dec. 1991, pp. 1318-1330 ；和 Burres, N. S.,等人，Tournal of Antibiotics, Dec. 1991,PP. 1331-1341。几篇更晚的公开描述了特定都奈霉素的杀虫或杀螨活性。虽然文献描述了特定都奈霉素的纯化并阐明了其结构和活性，缺乏关于各种都奈霉素之间的相互作用、以及比较各种都奈霉素的杀虫活性的公开。此外，虽然需要在克/升的范围内产生含有都奈霉素的发酵液以产生商业上可行的杀虫产品，都奈霉素相关的公开描述的都奈霉素的产生在毫克/升的水平。背景文献没有公开用于增加都奈霉素生产的方法，也没有领会扩大规模的相应挑战。在通过筛选抗生素抗性突变体的文库和优化发酵条件来进行实验，以增加鲜黄链霉菌NRRL No. 30232的都奈霉素生产中，申请人将都奈霉素生产增加到了之前未报道过的水平，即至少2. 5克都奈霉素/升发酵液(浓缩前)。然而，令人惊讶地，申请人发现都奈霉素生产的增加与杀虫活性的增加并不必然是成比例的。申请人更详细地分析了各种都奈霉素之间的相互作用并确定了有杀虫活性的具体都奈霉素品种，而其它的都奈霉素品种没有活性或者对杀虫活性有拮抗性。发明概述因此，本发明涉及含有放线菌培养物的组合物，其具有杀虫活性都奈霉素与无杀虫活性都奈霉素之间的优化的比率。在一个实施方案中，此类培养物含有克/升水平的都
奈霉素。本发明还涉及用于产生富含杀虫活性都奈霉素的发酵液的方法，其中通过在优化的培养基中培养能够产生活性和无活性都奈霉素两者的放线菌直到产生至少约I克总都奈霉素/I升发酵液。在一个实施方案中，所述优化的培养基含有C N比按重量为至少10 I的碳源和氮源。可基于总体发酵培养基混合物中C和N的质量通过已知的方法来计算C N的重量比。因此，多种组分可向每个C和N部分添加不同的量，但是混合物中的总体比率将具有所示的比率。本发明还涵盖用于产生含有都奈霉素的发酵产品的方法，其中使用上述方法和标准的纯化技术来获得纯的或半纯的、富含 杀虫活性都奈霉素的发酵产品。本发明的另一方面是就杀虫活性而筛选放线菌的方法，其是通过测量过量产生都奈霉素的放线菌文库所产生的活性和无活性都奈霉素的量。在此方法的一个实施方案中，在筛选步骤之前进行这样的步骤其中从过量产生都奈霉素的亲本菌株产生过量产生都奈霉素的放线菌的突变体文库。
图I提供了本文所描述的都奈霉素的一般结构，其中包括被鉴别为Al，Cl，C2,C2S, D2, D2S, D3, D3S 和 D4S 的那些。图2提供了用于本文所述的都奈霉素的编号方案。图3提供了利福平抗性突变体vs.野生型的阶段I筛选测定的生物活性结果。图4提供了利福平抗性突变体vs.野生型的阶段3筛选测定的生物活性结果，含有LD50数据。图5提供了对于利福平抗性突变体阶段3筛选的Al比率的HPLC测定结果。图6提供了本文所指的都奈霉素的具体结构。图7提供了图表，其中显示了以野生型进行的AQ6047的典型批次方法的大环内酯生产。图8提供了图表，其中显示了以野生型进行的AQ6047的典型补料批次方法的大环
内酯生产。图9提供了图表，其中显示了以突变体进行的AQ6047的典型补料批次方法的大环
内酯生产。图10提供了图表，其中显示了补料批次发酵中M1064的都奈霉素生产和相应的生物活性。图11提供了图表，其中显示了通过发酵优化对都奈霉素生产的改进。图12提供了图表，其中显示了 RF 1694和RF 1696的发酵液以及Javelin(苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)产物)、Spintor (基于多杀菌素的产品)和未处理的对照(UTC)抗甜菜夜蛾的生物活性。发明详述本发明涉及杀虫放线菌产生的发酵液以及相关发酵固体，其含有杀虫活性与无杀虫活性都奈霉素的优化比率。术语“发酵液”是指微生物发酵后产生的培养基，并且特别涵盖微生物及其组成部分、未使用的原材料、以及所述微生物在发酵过程中所产生的代谢物。如本文中所使用的，术语“发酵固体”是指浓缩的和/或干燥的发酵液。如本文中所使用的，术语“粗制提取物”是指发酵液的有机提取物，例如乙酸乙酯提取物。如本文中所使用的，术语“半纯化的”是指从发酵液分离的代谢物，其为约50%至约90%纯。如本文中所使用的，术语“纯化的”是指从发酵液分离的代谢物，其为约91%至约100%纯。发酵液中的放线菌产生有杀虫活性和无杀虫活性的都奈霉素，并且可以是链霉菌属(Streptomyces)的菌株。数种之前鉴别的链霉菌属的菌株产生多种都奈霉素。此类菌株包括鲜黄链霉菌NRRL No. 30232 (在美国专利号6，682，925中描述)和淀粉酶产色链霉菌菌株 AB1691Q-321 和 AB1711J-452 (在 Karwowski, J. P.,等人,Tournal of AntibioticsDec. 1991, p. 1312中描述)。此外，可使用本文中所描述的和本领域中已知的技术就产生活性和无活性都奈霉素的能力容易地筛选链霉菌属的菌株。产生都奈霉素的放线菌还可以是产生都奈霉素的亲本菌株(例如分离的野生型菌株)的突变体。可通过本领域中已知的物理和化学方法来获得突变体。例如，可通过用化学品(例如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍)处理来获得突变体菌株。可不有意使用诱变剂而获得自发突变体，通过例如经典方法，例如在亲本对其敏感的某些抗生素的存在下培养所述亲本菌株并就改进的生物学活性或者-在本申请中-与亲本相比都奈霉素的过量生产来测试任何抗性突变体。也可通过产生生产都奈霉素的菌株的原生质融合而获得突变 体，其中使用 Keiser, T.,等人 Practical Streptomyces Genetics, 2000,pp. 57-58 中所描述的技术。产生的都奈霉素多于亲本菌株的突变体在本文中称作“过量产生都奈霉素的菌株”。在一些实施方案中，与亲本菌株相比，此类过量产生都奈霉素的菌株产生约2至约20倍更多的都奈霉素。在一个实施方案中，此类突变体是鲜黄链霉菌M1064。这种突变体是通过筛选抗生素抗性的、过量产生都奈霉素的鲜黄链霉菌NRRLNo. 30232突变体而获得的，如实施例I中所详细描述的。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约及其下的实施细则(布达佩斯条约)，将M1064于2009年11月5日保藏在USDA的农业研究机构保藏中心(位于 1815N. University Street Peoria, 111. 61604U. S. A) (NRRL)，并且保藏编号为 No. NRRL50334。此菌株是在下述条件下被保藏的确保在此申请的未决过程中可获得对培养物的接触。然而，应理解此保藏物的可获得性不构成通过政府行为损害专利权而实施本发明的许可。都奈霉素的一般性结构和各种都奈霉素显示在图I中。如本文中所使用的，术语“活性都奈霉素”是指有杀虫活性的那些都奈霉素种类。在一个实施方案中，经纯化的活性都奈霉素种类在少于约IOOOppm的浓度时至少对于一些昆虫是有杀虫活性的；在另一个实施方案中，以少于约500ppm的浓度；在另外的实施方案中，以少于约200ppm的浓度。活性都奈霉素包括D3S，C2S，D2，D2S，D4S和C2。如本文中所使用的，术语“无活性都奈霉素”是指无杀虫活性的那些都奈霉素种类。经纯化的无活性都奈霉素种类不显示对于一些或全部昆虫的杀虫活性，并且在直至约IOOOppm时是无活性的。无活性的都奈霉素包括Al和Cl。在一个实施方案中，杀虫活性是通过抗鳞翅目的活性确定的。在另一个实施方案中，如下区分有活性和无活性的都奈霉素以200ppm或更少的LD50，每一种显示出抗甜菜夜蛾的杀虫活性的能力。在一些实施方案中，活性都奈霉素在位置C18-C19处具有插烯烯醇醚或半缩醛或乙缩醛部分，如025，025，02，025和02所具有的。都奈霉中的碳编号素显示在图2中。在这种实施方案中，无活性的都奈霉素缺少这些部分而在位置C19处具有酮，如Al和Cl所具有的。无意被任何特定的理论所束缚，申请人相信需要插烯烯醇醚或半缩醛或乙缩醛部分的存在用于生物学活性，而图2中所显示的位置R2处的氨基糖部分存在与否对于活性不是必需的但是其增加分子的水溶性。另外一个考虑是，活性都奈霉素能动地(即作为活化剂)结合昆虫中特定的蛋白靶标，而无活性的都奈霉素竞争性地抑制活性种类的结合，但是它们自己在这些蛋白靶标上仅显示出弱的效果。在一个实施方案中，发酵液包括至少约O. 5g总都奈霉素/升。在另一个实施方案中，其包括至少约I克总都奈霉素/升。在另一个实施方案中，其包括至少3克总都奈霉素/升培养液。在另外的实施方案中，其包括至少7克总都奈霉素/升培养液。在另一个实施方案中，发酵液包括约I克至约7克总都奈霉素/升培养液。在一个实施方案中，活性与无活性都奈霉素的优化的比率为至少约I : I。在另一个实施方案中，活性与无活性都奈霉素的优化的比率为至少约2 I。可基于都奈霉素的摩尔比或重量比来计算所述比率。例如，都奈霉素Al和Cl不具有糖组分，而都奈霉素D2S和D3S具有连接的糖。含有糖的都奈霉素比没有糖的那些重约10% (按重量)并且不明显地影响活性与无活性都奈霉素的总体比率。
本发明的组合物包括上文所描述的发酵液，其可被原样使用、经干燥使用和/或经浓缩使用。可用一种或多种载体配制所述发酵液或发酵固体。视最终应用的需要，可在配制前通过加热、化学或辐射手段处理所述发酵液以灭活微生物。载体是加入发酵液中以改善回收、效力、或物理特性和/或有助于包装和施用的惰性制剂成分。可单独地或组合加入此类载体。在一些实施方案中，所述载体是抗结块剂、抗氧化剂、填充剂和/或保护剂。有用的载体的实例包括多糖(淀粉，麦芽糊精，甲基纤维素，蛋白质例如乳清蛋白，肽，胶)，糖(乳糖，海藻糖，蔗糖)，脂质(卵磷脂，植物油，矿物油)，盐(氯化钠，碳酸钙，柠檬酸钠)，和硅酸盐类(粘土，无定形硅，煅制二氧化硅/沉淀的二氧化硅，硅酸盐)。在一些实施方案中，在浓缩发酵液之后和在干燥过程之中和/或之后加入所述载体。在一个实施方案中，所述组合物包括发酵固体，其被配制为可湿性粉剂或水可分散的颗粒，其中发酵固体以约1%至约90% (按重量)的浓度存在。在另一个实施方案中，所述组合物可以被配制为可乳化的浓缩物，其中将经浓缩的发酵液溶解在惰性载体中，所述载体为水易混合的溶剂或水不混溶的有机溶剂与乳化剂的混合物。浓缩的发酵液以约10%至约90%的浓度存在。在另一个实施方案中，所述组合物可被配制为水性悬浮液，其中浓缩的发酵液或发酵固体以约0.1%至约50% (按重量)范围内的浓度被分散在水性媒介中。某些方法可用于制备具有活性与无活性都奈霉素的优化比率的发酵液。在本发明的一个方面中，上述发酵液是通过在合适的培养基中培养产生都奈霉素的放线菌而产生的，所述培养基经优化以增加活性都奈霉素的产生和使无活性都奈霉素的产生最小化。可通过调节氮源与碳源之间的比率，从而使得培养基中可获得的氮多于碳，以获得合适的培养基。在一个实施方案中，碳与氮的比率为约I : I至约200 I。在另一实施方案中，所述比率为约10 I至约30 I。在另一个实施方案中，所述比率为约20 I。如上文的概述中所述的，所示的比率是源中C和N的相对重量。在一个实施方案中，进行了批次方法，其中在分批(batching)过程中(开始发酵之前)设置所述比率并且在发酵过程中不对其进行调节。在另一个实施方案中，监测C和N源的消耗并且在所述方法中向发酵培养基中进行添加。也可采用选择特定的碳和氮源来优化活性与无活性都奈霉素的比率。合适的碳源包括单糖、二糖和多糖，例如葡萄糖、果糖、鹿糖、糖蜜、麦芽糊精和淀粉，以及源自植物的月旨肪酸和油(例如豆油和棉籽油)。合适的氮源可以是源自微生物、动物和植物的蛋白质和氨基酸或者含有蛋白质的物质。在一个实施方案中，氮源来自源自大豆的产品，例如豆面，大豆消化液，大豆水解产物和大豆磨粒(grit)。在另一个实施方案中，氮源包括源自棉籽的产品例如 PROFLO (Traders Protein, Lubbock, Texas)和 martone (Marcor DevelopmentCorporation, Carlstadt, NJ),玉米衆粉,麦芽提取物以及马铃薯提取物。在另一个实施方案中，氮源是源自动物的，例如源自酪蛋白的产品(脱脂乳，酪蛋白胨，酪蛋白水解产物，酪蛋白氨基酸)以及蛋白胨。在另一个实施方案中，氮源是源自微生物的，例如酵母提取物或全酵母。生物体生长发育所需的其它必要元素也应被包括在培养基中并且将是本领域技术人员所熟知的。可使用常规的监测碳和/或氮源的方法来进行对发酵培养基中C和N水平的监测。例如，可使用Beckman葡萄糖分析仪来监测葡萄糖水平，可使用酶促(转化酶)法来监测蔗糖，而可在对发酵培养基等分试样进行酸水解后通过色度还原糖法来分析更复杂的源(例如糖蜜和麦芽提取物)。可使用常规的大规模微生物培养方法来培养产生都奈霉素的放线菌，所述方法包括深层发酵，固态发酵，或液体表面培养。当在约20°C至约32°C的温度下培养时，产生都奈霉素。在一个实施方案中，将发酵液的pH保持在约6至约8之间。在一个实施方案中，培养产生都奈霉素的放线菌，直至产生至少约I克都奈霉素/升发酵液；或者在另一个实施方案中，直至产生至少约2克都奈霉素/升；或者在另一个实施方案中，直至产生至少约3克都奈霉素/升；或者在另一个实施方案中，直至产生至少约I克-约7克都奈霉素/升。在发酵过程中可通过测试培养液的抽取物而追踪都奈霉素的产生。用于追踪产生的一种方法是通过高压液相色谱(HPLC)分析抽取物。在一个实施方案中，上述用于生产具有活性与无活性都奈霉素的优化比率的杀虫发酵液的方法包括进一步通过常规工业方法浓缩所述培养液的步骤，所述常规工业方法为例如离心，膜过滤，切线流过滤，深度过滤和蒸发。在一些实施方案中，清洗经浓缩的发酵液(例如通过膜透析或超滤方法)以去除残余发酵液。在另一个实施方案中，可通过加入或不加入载体而使用常规干燥过程或方法来干燥发酵液或培养液浓缩物，所述常规干燥过程或方法为例如喷雾干燥、冷冻干燥、托盘干燥、流动床干燥或转筒干燥。可进一步加工所产生的发酵固体(例如通过研磨或粒化)以产生特定的粒度或物理形式。在本发明的另一个方面中，对通过上述方法产生的杀虫发酵液进行化学处理，以修饰无活性的都奈霉素，从而使得它们不能就生物学相关的结合位点或靶标干扰活性都奈霉素或与其竞争，或者从而使得它们被转化为活性都奈霉素。在一个实施方案中，可从混合物中去除所选择的都奈霉素。例如，可通过使所有都奈霉素的全部混合物通过含有悬垂氨 基官能团(例如伯胺、肟，氨基脲或肼)的树脂而实现去除都奈霉素Al和Cl。存在于Al和Cl中的C19-酮基将优先与所述悬垂氨基反应而可通过用适当的溶剂简单清洗而从柱子中去除其余的都奈霉素。可通过使都奈霉素混合物通过阳离子交换树脂而去除含有例如糖胺糖部分的都奈霉素。糖胺糖上存在的氨基将帮助具有糖的活性都奈霉素分子保留在柱子上，并允许无活性的都奈霉素通过。然后，可用碱性缓冲液将活性糖胺糖都奈霉素从树脂上洗脱掉。在另一个实施方案中，可通过遗传操作放线菌菌株以特异性地敲除无活性都奈霉素的表达(通过经典遗传学或通过分子手段)而减少混合物中的无活性都奈霉素。在本发明的另一个方面中，使通过上述方法产生的杀虫发酵液经受标准的纯化技术，以将活性都奈霉素与无活性都奈霉素分离，并获得半纯化或纯化的都奈霉素。本发明还涵盖用于就优先产生活性都奈霉素的能力筛选放线菌的方法。在一个实 施方案中，目的放线菌所产生的活性都奈霉素与无活性都奈霉素的比率大于约I : I。在另一个实施方案中，不产生无活性都奈霉素。在本发明的另一个方面中，在筛选步骤之前产生过量产生都奈霉素的菌株文库。例如，实施例I和2描述了产生突变体文库以及使用色谱法来鉴别过量产生都奈霉素的那些。其它用于快速筛选过产生都奈霉素的突变体的方法包括产生色度报告菌株。本发明的组合物可用于控制昆虫。因此，本发明的另一方面针对的是用于控制昆虫的方法，其通过向昆虫的部位施用有效量的本发明的组合物。如本文中所使用的，术语“控制(control) ”或“控制(controlling) ”是指杀死昆虫或减少可存活昆虫卵的数目。术语“部位”是指昆虫在其中生活的环境或者它们的卵存在的地方，例如昆虫可能食用或栖息的植物部分或植物周围区域。“有效量”是引起被处理的昆虫的可测量的减少所需的量。在一些实施方案中，获得了超过约50%的控制，在其它实施方案中超过约60%;在其它实施方案中超过约70% ;在其它实施方案中超过约75% ;在其它实施方案中超过约80%。在一个实施方案中，使用了约IOOppm至约IOOOOppm的发酵固体/英亩的比率。在另一个实施方案中，应用了约I至约50g配制的发酵固体/英亩。在一个实施方案中，所述组合物用于控制鳞翅目，例如烟芽夜蛾(Heliothisvirescens),甜菜夜蛾(Spodoptera exigua),甘蓝银纹夜蛾(Trichoplusia ni)和小菜蛾(Plutella xylostella)。其它典型的鳞翅目包括埃及棉叶虫,斜带卷叶虫,夜盗虫,褐卷叶虫，苹果蠹蛾，草地贪夜蛾和棉铃虫。
实施例实施例I-突变体的产生QST6047 (Steptomyces galbus NRRL No. 30232)是鲜黄链霉菌的野生菌株，其产生一系列都奈霉素。QST6047产生的都奈霉素具有抗鳞翅目的杀虫活性。为了增加都奈霉素生产和生物活性，通过抗生素抗性突变体筛选程序从野生菌株QST6047产生了过量产生都奈霉素的突变体M1064，在所述筛选程序中产生了对单独的抗生素(庆大霉素，利福平，链霉素，巴龙霉素或妥布霉素)有抗性的突变体文库。下面详细描述了产生和筛选利福平抗性文库，从其中最终选择了过量产生都奈霉素的菌株用于进一步的开发。将来自S. galbus QST6047 的 SFM (甘露醇 20g/L，豆面 20g/L，琼脂 20g/L)板培养物的孢子(悬浮在20%甘油中)在50°C水浴中热激10分钟。将100 μ I的孢子悬浮液涂板在补充了 5 μ Ι/ml利福平的GYM(葡萄糖4g/L，酵母提取物4g/L，麦芽提取物10g/L和琼脂12g/L)上。涂布足够的孢子悬浮液从而具有至少300个单菌落用于分离、纯化和筛选。
将含有利福平抗性细菌的琼脂塞用于接种含有31-3C培养基(Proflo 20g/L，麦芽提取物20g/L，KH2P04单碱6g/L，K2HP04 二碱4.8g/L)的培养管并在28°C下培养6天。然后将培养液系列稀释并如下使用甜菜夜 蛾卵生物测定(BAW Egging Bioassay)就生物活性进行测试。将测试样品分配在含有甜菜夜蛾(BAW)卵的96孔微量滴定板中。微量滴定板的每个孔含有膳食和大约已知数目的甜菜夜蛾卵。在最佳条件下孵育微量滴定板使卵孵出。七天后，计数仍然存活的虫的数目并且给出中断点评定。记录相对于野生型中断点的突变体中断点。每个中断点代表相对于野生型的2X活性增加。然后在摇瓶中培养任何显示出超过野生型的生物活性的突变体。在所筛选的300种突变体中，20种显示出增加的生物活性(图3)。在I-L三角瓶中培养所选的具有更高生物活性和在琼脂板上的孢子生成能力的突变体并随后扩大规模至含有31-3C培养基的20-L生物反应器。对于每种突变体测量生物活性(图4)和都奈霉素产生(图5)。令人惊讶地，虽然突变体产生了比野生型更高水平的都奈霉素，生物活性没有成比例地增加。实施例2-鉴别各种都奈霉素生物活性的效力差异(HPLC鉴别和生物测定)从称作M1064的突变体或野生型(鲜黄链霉菌QST6047)分离出各种都奈霉素用于活性分析。使用上文所描述的培养基，使M1064或野生型在2L摇瓶中生长。用IL乙酸乙酯将全培养液抽提两次并在降低的压力下浓缩合并的有机抽提物。将粗制提取物加载到在己烷中平衡的硅胶柱上，并用己烷和之后的己烷-乙酸乙酯分步溶剂梯度洗脱所述柱子。通过分析HPLC反相C8柱子和BAW卵生物测定确定含有都奈霉素的级分。使用制备性反相C8 柱[Zorbax Exclipse XDB-C8, 5 μ m ;9· 4x25cm,流速为 2. OmL/min，且在220nm处进行UV检测。洗脱溶剂系统由水(IOmM NH4OAc)甲醇混合物组成]进一步分级活性级分，这产生了纯的都奈霉素。使用UV和质谱证实了所有分离的都奈霉素。所鉴别的都奈霉素的结构显示在图6中。然后，如下就抗甜菜夜蛾卵的生物活性测试经分离、鉴别的都奈霉素。作为各种半纯化的都奈霉素(单独的或组合的)的15%含水乙醇溶液提供储液。为了参照的目的，称取Javelin WDG(苏云金芽孢杆菌克氏(Kurstaki)亚种；ThermoTrilogy Inc)并稀释以提供IOOOppm的储液(正化学标准)。将这些储液转移到深孔微量滴定板中将I. 4ml的每种储液置于顶行的2ml孔中(A孔1-12)。然后,Packard Multiprobe II液体处理系统(PerkinElmer Inc.)运行稀释程序，首先将700 μ I的DI H2O加入其余的84个孔(B-H 1-12)中。然后，四个枪头(tip)臂实行一系列的抽吸和分配步骤以混合样品，然后将它们转移到相邻的孔中以给出含有700 μ I/孔的八种50%系列稀释的样品。然后，机器人使用转移程序来将所有系列稀释的样品移液到经标记的96孔板中。将含有40 μ I每种稀释液的等分试样分配到微量滴定板上的6个孔中(所述微量滴定板含有约200 μ I的人工膳食/孔)。在每个96孔板上测试两种样品；样品I以储液浓度在孔Α1-6中；样品2在孔Α7-12中。B行含有50%稀释液系列或1/2Χ样品I的溶液在B彳丁孔1_6中而样品2在B彳丁孔7-12中。每组中的最后两种样品是化学标准和含有DI水的未处理的对照。在加压气流下使样品在室温快速干燥，然后，使用重复移液在每个孔中放置5-10个琼脂中的同步化的甜菜夜蛾卵。在加压气流下使卵琼脂混合物干燥并用多孔的聚脂薄膜覆盖所述平板。将平板在28°C下、在16 8的光照黑暗循环中孵育。5-7天后，对每行中的活昆虫数目制表。将死亡率记录为死去的数目比所处理的数目，并表示为经对照校正的百分比死亡率。将数据从Excel
输出到Polo PC(LeOra Software1987)中并使用自然响应和95%置信区间计算LC 10,50和90s。结果显不在表I中。表I :纯化的都奈霉素及组合的生物活性
权利要求
1.包含来自放线菌的杀虫发酵液或发酵固体的组合物，其中所述发酵液或发酵固体包含活性都奈霉素与无活性都奈霉素的优化比率。
2.权利要求I的组合物，其中活性都奈霉素与无活性都奈霉素的优化比率是至少约1 1。
3.权利要求2的组合物，其中活性都奈霉素和无活性都奈霉素的浓度为至少约lg/L发酵液。
4.权利要求2的组合物，其中活性都奈霉素和无活性都奈霉素的浓度为至少约3g/L发酵液。
5.权利要求2的组合物，其中活性都奈霉素和无活性都奈霉素的浓度为至少约7g/L发酵液。
6.权利要求2的组合物,其中所述放线菌是链霉菌属(Streptomyces)的种的菌株,其能够产生活性都奈霉素和无活性都奈霉素两者。
7.权利要求6的组合物,其中所述链霉菌属的种的菌株是鲜黄链霉菌(Streptomycesgalbus)。
8.权利要求6的组合物，其中所述链霉菌属的种的菌株是链霉菌属的种M1064。
9.权利要求I的组合物,其还包含载体。
10.权利要求I的组合物，其中所述活性都奈霉素在位置C18-C19处具有插烯烯醇醚或半缩醛或こ缩醛部分且所述无活性都奈霉素在位置C19处具有酮。
11.权利要求10的组合物，其中所述活性都奈霉素是C2，C2S，D2，D2S和D3S的ー种或多种且所述无活性都奈霉素是Al和Cl的ー种或多种。
12.用于产生富含杀虫活性都奈霉素的发酵产品的方法，所述方法包括在含有碳源和氮源的培养基中培养产生活性都奈霉素和无活性都奈霉素的放线菌，直至产生至少约O. 5毫克的活性都奈霉素/升培养基，其中碳与氮源的比率为至少约10 I按重量。
13.权利要求12的方法，其中所述碳源选自来自植物或动物材料的单糖，ニ糖，多糖和复合糖。
14.权利要求12的方法，其中所述碳源选自蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉、麦芽糊精、糖蜜和麦芽提取物。
15.权利要求12的方法，其中所述氮源选自来自植物或动物的蛋白质和氨基酸，豆面，大豆消化液，蛋白胨，大豆水解产物，大豆磨粒，棉籽粉，玉米浆粉和马铃薯提取物。
16.权利要求12的方法，其中所述碳源是葡萄糖且所述氮源是豆面。
17.权利要求12的方法，其中所述碳源是葡萄糖且所述氮源是棉籽粉和豆面的组合。
18.权利要求12的方法，还包括筛选过量表达都奈霉素的放线菌文库以产生活性都奈霉素和无活性都奈霉素的初始步骤。
19.权利要求12的方法，还包括从发酵液和生物质中纯化活性都奈霉素。
20.权利要求12的方法，还包括浓缩发酵液和生物质。
21.权利要求20的方法，还包括干燥发酵液和生物质。
22.权利要求12的方法，其中活性都奈霉素与无活性都奈霉素的比率为至少约I: I。
23.通过权利要求12-16中任ー项的方法产生的发酵产品。
24.就提高的杀虫活性筛选放线菌的方法，所述方法包括产生过量产生都奈霉素的放线菌文库，培养所述过量产生都奈霉素的放线菌，測量由所述过量产生都奈霉素的放线菌所产生的活性和无活性都奈霉素的量，以及选择产生的活性都奈霉素多于无活性都奈霉素的、过量产生都奈霉素的放线菌。
25.权利要求24的方法,其中放线菌是鲜黄链霉菌(Streptomycesgalbus)。
26.权利要求24的方法,其中放线菌是链霉菌属(Streptomyces)的种的菌株。
全文摘要
提供了用于制备杀虫组合物的方法和组合物。
文档编号A01N43/90GK102665419SQ201080049354
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月4日 优先权日2009年11月6日
发明者C·泰勒, J·希门尼斯, J·马戈利斯, M·吉亚贝尔-戈雅, 朱宏 申请人:阿格拉奎斯特公司