专利名称：硫代巴比妥酸用于抑制黑色素生成及生物杀虫剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)作为酪氨酸酶抑制剂在医药品、化妆品及食品、农业领域的应用。
背景技术：
酪氨酸酶(EC 1. 14. 18. 1，Tyrosinase)是一种含铜的金属酶，广泛分布于微生物、动植物及人体中.酪氨酸酶是皮肤色素合成中具有多重催化功能的重要的酶， 该酶兼有加氧酶和氧化酶的双重功能，在黑色素合成过程中起关键作用，是黑色素合成过程的限速酶。酪氨酸酶属于第三类铜蛋白家族(人Yoon J，Fujii S，Solomon ΕΙ. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Apr 21; 106 (16) :6585-90; 2. Li Y, Wang Y, Jiang H， Deng J. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Oct 6; 106 (40): 17002-6.)，在活性部位 2 个铜离子分别与3个组氨酸相连，并且该2个铜离子与不同的催化反应直接相关，如单酚羟基化为二酚(甲酚酶活性)和二酚氧化为二醌(邻苯二酚氧化酶活性)C . Decker, H. and Tuczek, F. (2000) Trends Biochem. Sci. 25，392-397.)。酪氨酸酶的活性与黑色素合成量密切相关，在人体内的活性增高回导致雀斑、黄褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生 {4. Olivares C，Solano F. Pigment Cell Melanoma Res. 2009 Dec;22 (6) :750-60 ； 5.
Jimbow K，Park JS, Kato F，Hirosaki K，Toyofuku K，Hua C，Yamashita T. Pigment Cell Res. 2000 Aug; 13(4):222-9.)。食物(果蔬、虾蟹等)中的酪氨酸酶会引起食物加工及贮藏过程中的褐变，导致食物变质(6. Kim YJ, Uyama H. Cell Mol Life Sci. 2005 Aug;62(15) 1707-23 ；7. Rescigno A, Sollai F，Pisu B，Rinaldi A, Sanjust Ε. J Enzyme Inhib Med Chem. 2002 Aug; 17(4):207-18.)。酪氨酸酶在昆虫体内也普遍存在， 在昆虫创伤愈合以 Kanost MR, Jiang H, Yu XQ. Immunol Rev. 2004 Apr; 198:97-105； 9. Lai SC，Chen CC，Hou RF. J Med Entomo1. 2002 Mar;39(2):266-74.)琳衰跃I傲 {10. Guerrero, A. and Resell, G. (2005) Curr. Med. Chem. 12，461-469.)中起重要作用。由于酪氨酸酶在医药、化妆品和农业上的潜在应用前景，其活性调控研究成为研究的焦点。迄今为止，已研制出多种类型的酪氨酸酶抑制剂，可作为开发增白剂及生物杀虫剂的候选。目前，已有不少来源于化学合成和天然产物的酪氨酸酶抑制剂作为药品、化妆品或食品添加剂及生物杀虫剂。已普遍应用的酪氨酸酶抑制剂有氢醌、曲酸及其衍生物、壬二酸、熊果苷、黄酮类化合物、Vc及其衍生物、绿茶提取物、甘草提取物等。但现有的酪氨酸酶抑制剂在活性、稳定性或安全性等多方面存在着不同程度的缺陷，因此继续寻找活性高、安全性好、性质稳定的酪氨酸酶抑制剂仍然具有十分重要的意义。硫代巴比妥酸(TBA)是一种抗氧化剂，作为血浆和组织内脂质过氧化反应和氧化压力的指数频繁应用，称为TBARS鉴定分析(从Y.J. Garcia e t al. /Journal of Neuroscience Methods 144 (2005) 127-135； 12. Gutteridge JM，Halliwell B.Trends Biochem Sci (1990) 15:129-34 ； 13. Janero DR/ Free Radic Biol Med (1990) 9: 515-40.)。它可以分析丙二醛，并且用作确定食物中油脂自由基氧化的变化α么 Guilllen-Sans R/ Crit Rev Food Sci Nutr. (1998) 38:力 )。TBA 还被用于筛选艾滋病毒整合酶抑制剂(75 S. Rajamake et al./Bioorg. Med. Chem. Lett. 19 (2009) 3615-3618~)。.因此，我们提出TBA对酪氨酸酶的抑制作用，并提出一种抑制动力学研究和计算机预测TBA在酪氨酸酶催化反应中作用研究相结合的研究途径。
发明内容
本发明的目的在于克服上述存在的不足，提供一种克服现有酪氨酸酶抑制剂在稳定性、安全性的缺陷，提供一种新的稳定性好、细胞毒性非常微小的酪氨酸酶抑制剂，从而抑制黑色素细胞中的黑色素生成的应用。本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，本发明所用的酪氨酸酶(M.W. 128 kDa)购自于 Sigma-Aldrich 公司。本发明所用的硫代巴比妥酸Q-Thiobarbituric acid, TBA)，分子量144. 15，微黄色或微橙红色粉状结晶，溶于沸水、碱液中，常温贮存，其化学结构式如公式1
1.酪氨酸酶活性分析
酪氨酸酶活力的测定采用分光光度法。我们以L-DOPA作为底物，采用 Lineweaver-Burk 法测得酪氨酸酶 Km = 0. 51 士 0.03 mM (Vmax = 0. 3 士 0. 01)。反应采用典型的Iml反应底物体系加入IOml酶溶液来测量酪氨酸酶活性。在本研究中通过Perkin Elmer Lambda Bio紫外可见分光光度计检测吸收值来计算酶活性，即用在492nm处每分钟吸光值变化来指示ν值。2.酪氨酸酶非竞争性抑制动力学分析
非竞争性抑制动力学分析的Lineweaver-Burk方程如公式2 公式3 以[I]为横坐标，1/Vmax为纵坐标进行二次作图，如得到一条直线，说明在单一位置或同类位置发生抑制。3.内源和外源荧光测定
荧光发射光谱由Jasco FP750荧光光谱仪用Icm光径比色皿检测。激发波长在^Onm 检测色氨酸荧光，检测波长范围在300至410nm。酶溶液中加入终浓度为40M ANS孵育30min 后检测酪氨酸酶液的外源荧光强度变化情况。外源荧光测定时激发波长为390nm，检测波长范围在400至520nm。所有动力学反应和检测均采用50 mM磷酸钠缓冲溶液(pH 7. 0)。4.硫代巴比妥酸(TBA)与酪氨酸酶结合常数和结合位点数量的检测
根据先前的报道(彬.M.X. Xie, XY. Xu, Y. D. Vang, Biochim. Biophys. Acta. 1724 (2005)力)，当小分子等价结合到大分子上时，自由分子和结合分子的平衡方程如下，可用于计算结合常数(K)和结合位点数量(η)，公式4中，Ftl和F分别为无荧光猝灭剂和有荧光猝灭剂时反应达到平衡时的相对荧光强度。⑴]是荧光猝灭剂(TBA)的浓度。 基于方程[3]作图得到截距和斜率，可用来计算K和η的值。5.酪氨酸酶的同源性模型
根据以往的报道进行蘑菇酪氨酸酶3D结构的预测(77. Guo L, Lu ZR, Park D, Oh SHf Shi L, Park SJf Bhak J，Park YD，Ren ZL, Zou F. J Biomol Struct Dyn. 2008Dec ；26 (3) :395-402 ； 18. Lu ZR, Shi L, Wang J, Park D, Bhak J, Yang JM，Park YD， Zhou HWf Zou F. Appl Biochem Biotechnol. 2010 Apr; 160 (7): 1896-908.)，％_觅基予同源性模拟的软件M0DELLER9vl生成包含556个氨基酸的酪氨酸酶三维模型(19. John, B. and Salif Α. (2003) Nucleic Acids Res. 31，3982-3992.)。我们从蛋白质数据库 Protein Data Bank (PDB) (http://www. pdb. org)检索已知的酪氨酸酶同源结构，发现4 个条目(PDB entry: lwxc, lxom, 2oic, 2oid)为适用的结构模板(平均26%序列一致)， 与酪氨酸酶具有部分同源性。采用MODELLER程序包的ALIGN2D校准酪氨酸酶与模板的序列。基于该序列校准，酪氨酸酶的3D结构构成具有很高的置信水准。随之，我们采用作为稳定性度量标准的离散优化蛋白质能量(DOPE)评分计算了酪氨酸酶结构模型的结构能。6.计算机模拟酪氨酸酶和TBA的对接
在所有用于蛋白质-配体对接的计算机模拟应用工具中，AutoDock4和D0CK6由于其自动对接性能应用最为广泛。该程序利用一套预设的目标蛋白3D网格完成配体的连接，AutoDock 采用随机的搜索技术(湖.Huey, R., Morris, G. Μ.，Olson，A. J., and Goodsell, D. S. (2007) J. Comput. Chem. 28，)而 DOCK 采用系统的搜索技术{21. Moustakas, D. Τ.，Lang, P. Τ., Pegg, S., Pettersen, Ε.，Kuntz, I. D., Brooijmans, N., and Rizzo, R. C. (2006) J. Comput. Aided MoL Des. 20, 601-619.).因此，我们采用两种稍有不同的途径评估酪氨酸酶和TBA的结合。原始的 TBA 结构源自于 PubChem 数据库(Compound ID 2723628) (http //www. pubchem. org) {22. Xie, Z Q. and Chen, J. Z. J. (2008) Chem. Inf. Model 48，465-475.)。对接步骤之前需进行1) 2D结构转换为3D结构，2)估算电荷，3)添加氢原子，4)凹陷区域定位。以上步骤中我们使用J-Chem软件包(http://驟w. chemaxon. com/)中的转化程序和 OpenBabel (http//openbabel. sourceforge. org)。7. HaCaT细胞培养和MTT分析
HaCaT细胞系是一种能无限次传代的常用角质细胞0 ". Boukamp P, Petrussevska RT, Breitkreutz D, Hornung J，Markham A, Fusenig NE. J Cell Biol. 1988 Mar; 106(3) :761-71.)。该细胞在含有10%胎牛血清FBS和1%抗生素-抗霉剂(Gibco， Rockville, MD)的细胞培养基中培养。用Sigma-Aldrich公司购买的MTT试剂盒分析 HaCaT细胞中TBA的细胞毒性，操作过程根据供应商的说明进行。本发明将在结构特征方面，TBA属于硫醇类化合物，我们的结果与之前报道的硫醇类化合物对酪氨酸酶的显著抑制现象类似。我们发现TBA在不同温度的水溶液中均非常稳定，且对皮肤角质化细胞毒性非常微小。TBA抑制代表了不同于铜离子螯合剂抑制酪氨酸酶活性的另一种模式。与之前报道的铜离子螯合剂抑制酪氨酸酶活性相比，TBA诱发抑制反应的机理不同，主要有两个理由一、TBA并非直接连接于活性位点的铜离子上，因此，不存在与L-DOPA的竞争。二、活性位点的两个铜离子共享源自生物体的酪氨酸酶残基，但作为抑制剂的连接残基存在于活性位点处的不同连接部位。TBA能引起酪氨酸酶的完全失活，不伴随三级结构的变化。TBA未引起酪氨酸酶三级结构的调整现象反映TBA只是连接在与L-DOPA催化作用相关的特定残基上，该位置存在于酪氨酸酶活性部位，因此该抑制作用没有伴随显著的结构变化。由于抑制类型为非竞争性抑制方式，在活性位点内部，TBA结合部位区别于L-DOPA的结合位点。TBA并非直接与L-DOPA竞争，但影响了一系列的催化过程，暗示TBA结合位置与L-DOPA的连接位点非常接近。基于以上结果，我们进一步进行了计算机模拟预测与TBA 连接的氨基酸，以证明我们预测的TBA抑制作用机理。计算机模拟表明TBA能够直接与酪氨酸酶残基形成配基结合复合物。在TBA结合的第一步，这些氨基酸残基非常重要。结合位点在活性部位内，TBA和L-DOPA底物存在下的非竞争性抑制作用不引起酪氨酸酶构象的显著变化。综上所述，本发明研究的结果总结如下1) TBA配基与酪氨酸酶结合，弓丨发对酪氨酸酶的非竞争性抑制，抑制效果明显；2)即使在高浓度的TBA存在下，也未发生酪氨酸酶的三级结构变化；3)通过计算机模拟酪氨酸酶与TBA的结合，预测出结合位点的氨基酸，且这些残基位于活性部位内；4) TBA对酪氨酸酶的抑制作用代表了抑制酪氨酸酶活性的新类型，为开发治疗皮肤色素沉着的新的抑制剂和生物杀虫剂提供研究基础。
图1是公式1:
图2是公式2 图3是公式3 图4公式4
图5是TBA对酪氨酸酶的抑制影响图； 图6是ν和[E图]; 图7是Lineweaver-Burk双倒数图8是不同温度下长期存放时TBA对酪氨酸酶的抑制影响图； 图9不同TBA浓度下酪氨酸酶的荧光强度变化图； 图 10 是 Ftl/(Ftl-F) vs. Κ Γ1 双倒数图； 图11不同浓度TBA中酪氨酸酶外源荧光的变化12酪氨酸酶与TBA结合的计算机模拟图； 图13人HaCaT角质化细胞的TBA毒性试验图。
具体实施例方式实施例1
TBA对酪氨酸酶活性的影响抑制动力学
酪氨酸酶的活性以剂量依赖的方式被TBA显著抑制(图5)。当TBA浓度高于40 mM, 酪氨酸酶的活性完全被抑制。测得的IC5tl值为8.0 士 1.0 mM。为了分析TBA抑制的可逆性，以剩余酶活力与[E]作图(图6)。图示结果得到4条通过原点的直线，表明TBA对酪氨酸酶的抑制作用为可逆过程。为评估抑制类型，用Lineweaver-Burk双倒数法作图(图7)。结果显示，表面Vmax发生变化，而Km值不变，说明TBA对酪氨酸酶的抑制类型为非竞争性抑制。使用Eq. [2]计算Ki值为14. 0 士 8. 5 mM。实验数据拟合符合预计方程。接着，为评估TBA水溶液的稳定性，我们分别选用-20，4和25°C三个温度条件保存 TBA水溶液，并检测经不同温度条件长期保存后TBA对酪氨酸酶的抑制变化情况(图8)。结果表明，TBA在这三个温度下长期保存后均能显著抑制酪氨酸酶活性，证明TBA是一种稳定的抗氧化剂。实施例2
TBA对酪氨酸酶三级结构的影响荧光光谱分析
酪氨酸酶在TBA存在下的三级结构变化由内源荧光和ANS结合的外源荧光检测。我们发现TBA引起了酪氨酸酶内源荧光的猝灭，随TBA浓度增加荧光强度峰值降低，但峰值处波长没有出现位移(图9)。荧光强度峰值对TBA浓度作图显示线性关系(图10)。从以上数据，根据Eq. [3].，我们计算出结合常数K = 16.37 士 1. 3 χ IO3 Μ—1，成键数η = 2. 12 士 0.9。这些结果表明，在不含底物的体系中，TBA对酪氨酸酶有很强的结合力，可能的结合位点有2个。下一步，我们检测了 TBA存在下，酪氨酸酶疏水性的变化(图11)。在TBA存在下， 甚至其浓度达到80mM时，酪氨酸酶的外源荧光强度无明显变化，证明在TBA作用下酪氨酸酶的疏水表面并未暴露。一般而言，ANS作为一种荧光染料能与疏水性氨基酸残基结合，因此可用于检测在抑制剂存在下酶三级结构的破坏情况。我们的结果表明即使在较高的TBA 抑制剂浓度下(从图5可知该浓度下酶活性已被明显抑制)，ANS结合的外源荧光仍无变化， 说明TBA没有引起酪氨酸酶三级结构的显著变化。实施例3
计算机预测酪氨酸酶的3D结构和与TBA对接模拟
由于酪氨酸酶的晶体结构还未阐明，我们从PDB蛋白质数据库中分别选择序列一致性为25%，29%, 26%和25%的lwxc, lxom, 2oic和2oid作为结构模板模拟酪氨酸酶的3D 结构。在酪氨酸酶的预测结构中，我们将结合部位放大为496 wxc 3，如图12中黄色区域所示。酪氨酸酶与TBA的结合模拟非常成功(AutodoCk4所得结合能-4. 75 kcal/mol, Dock6结合能-23. 07 kcal/mol)。采用Autodock4和Dock6，我们在酪氨酸酶上搜索与TBA 的结合残基，这些残基在位置上非常靠近。用Aut0d0Ck4我们发现酪氨酸酶上与TBA结合非常重要的残基是 PHE170, THR175, VAL177, GLY251, PHE261 和 ASP536，而用 Dock6 为 GLU250和ASP536 (图13中红框部分)，两程序中均发现的位点为ASP536。计算机对接模拟鉴定了酪氨酸酶上TBA的结合残基并对结合区域进行了定位，为 TBA通过非竞争性抑制方式作用于酪氨酸酶的机制研究提供证据。而且，D0CK6模拟结果与图5中内源荧光测得结果一致结合位点为1个或者2个非常相似的位点。实施例4
采用MTT检测TBA对HaCaT细胞系的毒性
采用不同浓度TBA培养HaCaT细胞后，进行MTT测试。我们应用TBA作用于HaCaT细胞，检测TBA对皮肤细胞的毒性。结果表明TBA对HaCaT角质化细胞没有毒性影响。该结果预示着TBA作为酪氨酸酶的抑制剂能作为一种有效的增白剂，应用于缓解色素合成失调 (如色素沉着过度)。图5所示取三次数据平均和拟合。酪氨酸酶与不同浓度的TBA混合2小时后，加入到含有相应浓度的TBA测试体系中。L-DOPA和酶的终浓度分别为2 mM和4 g/ml。图6所示·λ值代表在492nm波长处每分钟吸光值的变化。1至4号TBA浓度分别为0，5，10禾Π 15 mM。体系中L-D0PA的终浓度为2 mM。
图7所示体系中TBA浓度为0 10 (+)，20和27 mM。酪氨酸酶终浓度为4 g/ ml ο图8所示χ轴分别为25 (a)，4 (b)和_20°C (c)体系的存放时间。体系中L-D0PA 和酪氨酸酶的终浓度分别为2 mM和4 g/ml。图9所示内源荧光变化；图10是F。/(Ftl-F) vs. Κ Γ1双倒数图。(A)内源荧光变化。测试前，酪氨酸酶和TBA共同孵育3小时。标签0表示空白状态。标签1至6表示TBA浓度分别为0.02，0. 03, 0. 04, 0. 05, 0. 08和0. 1 mM。(B) F0/(F0-F) vs. [Q]-1双倒数图。F。，空白荧光强度峰值。F，试样荧光强度峰值。Q，猝灭剂TBA。数据来自于(A)。体系中酪氨酸酶的终浓度为4 g/ml。图11所示测试前酪氨酸酶中加入ANS (终浓度40 M)并于暗室孵育30分钟， 用于标记疏水表面。体系中酪氨酸酶的终浓度为4 g/ml。图12所示蘑菇酪氨酸酶3D结构的预测基于先前的报道。黄色区域指示活性部位，红色框指示假定的TBA结合部位。浅蓝色部分表示Aut0D0Ck4程序下TBA的结合，粉色表示Docli6程序下TBA的结合。
权利要求
1.硫代巴比妥酸作为酪氨酸酶抑制黑色素生成的应用，酪氨酸酶活力的测定采用分光光度法，我们以L-DOPA作为底物，采用Lineweaver-Burk法测得酪氨酸酶Km = 0. 51 士 0. 03 mM ,反应采用典型的Iml反应底物体系加入10 1酶溶液来测量酪氨酸酶活性，在本研究中通过Perkin Elmer Lambda Bio紫外可见分光光度计检测吸收值来计算酶活性，即用在492nm处每分钟吸光值变化来指示ν值。
2.根据权利要求1所述硫代巴比妥酸作为酪氨酸酶抑制黑色素生成的应用，其特征在于所述的荧光发射光谱由Jasco FP750荧光光谱仪用Icm光径比色皿检测。
3.硫代巴比妥酸用于生物杀虫剂，应用TBA作用于HaCaT细胞，检测TBA对皮肤细胞的毒性。
全文摘要
硫代巴比妥酸用于抑制黑色素生成及生物杀虫剂，酪氨酸酶活力的测定采用分光光度法，我们以L-DOPA作为底物，采用Lineweaver-Burk法测得酪氨酸酶Km=0.51±0.03mM，反应采用典型的1ml反应底物体系加入10ml酶溶液来测量酪氨酸酶活性，在本研究中通过PerkinElmerLambdaBio紫外可见分光光度计检测吸收值来计算酶活性，即用在492nm处每分钟吸光值变化来指示v值；所述硫代巴比妥酸作为酪氨酸酶抑制黑色素生成的应用，所述的荧光发射光谱由JascoFP750荧光光谱仪用1cm光径比色皿检测。
文档编号A01N43/54GK102232954SQ20111000272
公开日2011年11月9日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者严莉, 吕志荣, 周海梦, 朴龙斗 申请人:浙江清华长三角研究院