专利名称：拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗病毒型抗脂多糖因子，尤其是涉及一种拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子及其制备方法与应用。
背景技术：
白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)不仅是危害对虾的主要病毒性病原，而且能够感染其他许多甲壳类十足目动物，而这其中包括许多重要水产经济养殖品种。WSSV病害自1993年发生以来，给全球水产养殖业造成了巨大经济损失，近20年来，国内外学者在WSSV侵染和水生甲壳动物抗WSSV免疫研究方面取得了一些关键性进展， 遗憾的是，至今尚无针对此病毒的有效防治方法。众所周知，与脊椎动物相比，虾、蟹等无脊椎甲壳动物缺乏后天免疫应答系统，它们仅依靠非特异性免疫来抵御微生物入侵感染。已有研究表明病毒感染对虾、蟹后能够激活宿主的免疫识别信号传导通路，如NF-kappaB信号通路[1’2]、肿瘤坏死因子受体相关因子 6(TRAF6)信号通路[3]和STAT信号通路M等，从而引发一系列免疫应答反应，包括抗菌肽的合成与释放[3’5]、细胞吞噬[6]和细胞凋亡[7]等，这些免疫应答反应在甲壳类动物抵御外界病原微生物感染过程中发挥重要作用。值得一提的是，近年来陆续有一些抗病毒活性物质得以分离鉴定，诸如血蓝蛋白[8]、溶菌酶[9]、抗菌肽[5’1(Η13]等，这些研究报道为虾、蟹等水产养殖病毒病的有效防治提供了重要理论依据。抗脂多糖因子首次发现于鲎[14’15]体内，该因子具有抗凝血作用，能够抑制细菌脂多糖(LPQ引发的凝集反应，故命名为抗脂多糖因子。研究表明，ALF对LPS具有高亲和力， 能够结合LPS的类脂A部位并中和其生物学活性，对于抵抗内毒素血症和内毒素休克具有重要作用；此外，ALF对R-型革兰氏阴性菌生长具有强烈抑制作用[15]。ALF在其他多种甲壳动物体内也相继得以分离鉴定，并且ALF在LPS[16_18]、细菌、真菌和WSSV[23]刺激后均有不同程度的上调表达，而体外重组表达的ALF蛋白也表现出广谱抗菌活性，包括对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑制与杀伤作用[16’2°’24]。近期研究表明，螯虾Pl-ALF具有显著的抗WSSV活性[13]，而对虾Pm-ALF3[11]亦显示出抗WSSV活性。综上所述，ALF是水生甲壳类动物的重要免疫因子，对其功能的深入鉴定研究不仅在抗微生物感染理论研究方面具有重要意义，而且在生产实践中亦具有广泛应用前景。拟穴青蟹kylla paramamosain与基因工程，特别涉及拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor)，即Sp_ALF2基因克隆、重组表达产物及其制备方法，尤其是利用红螯螯虾造血组织干细胞作为细胞模型进行Sp-ALF2产品抗WSSV感染的抗病毒实验技术。参考文献如下1. Huang XD, Zhao L, Zhang HQ, Xu XP, Jia XT, Chen YH, Wang PH, Weng SP, Yu XQ,Yin ZX et al. Shrimp NF-kappaB binds to the immediate-early gene iel promoter of white spot syndrome virus and upregulates its activity[J]. Virology,2010,406 (2) :176-180.2. LiF, Wang D，Li S，Yan H，Zhang J, Wang B，Xiang J. A Dorsal homolog(FcDorsal) in the Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis is responsive to both bacteria and WSSV challenge[J]. Dev Comp Immunol，2010，34(8) :874-883.3. Wang PH，Wan DH, Gu ZH，Deng XX，Weng SP, Yu XQ, He JG. Litopenaeus vannamei tumor necrosis factor receptor-associated factor 6 (TRAF6)responds to Vibrio alginolyticus and white spot syndrome virus (WSSV) infection and activates antimicrobial peptide genes[J]. Dev Comp Immunol，2011，35(1) :105-114.4. Sun C，Shao HL，Zhang XW，Zhao XF，Wang JX. Molecular cloning and expression analysis of signal transducer and activator of transcription (STAT) from the Chinese white shrimp Fenneropenaeus chinensis[J]. Mol Biol Rep,2011.5. Antony SPiSingh IS, Sudheer NS，Vrinda SiPriyaja PiPhilip R. Molecular characterization of a crustin-like antimicrobial peptide in the giant tiger shrimp， Penaeus monodon, and its expression profile in response to various immunostimulants and challenge with WS SV[J]. Immunobiology,2011，216 (1-2) 184-194.6. Wu W, Zong R，Xu J，Zhang X. Antiviral phagocytosis is regulated by a novel Rab-dependent complex in shrimp penaeus japonicus[J]. J Proteome Res, 2008, 7(1) :424-431.7. Wang Z，Hu L，Yi G，Xu H，Qi Y，Yao L，0RF390 of white spot syndrome virus genome is identified as a novel anti-apoptosis gene[J]. Biochem Biophys Res Commun，2004，325(3) :899-907.8.Zhang X，Huang C，Qin Q. Antiviral properties of hemocyanin isolated from shrimp Penaeus monodon[J]. Antiviral Res，2004，61 (2) :93-99.9. Mai WJ, Wang WN. Protection of blue shrimp (Litopenaeus stylirostris) against the White Spot Syndrome Virus (WSSV) when injected with shrimp lysozyme[J].Fish Shellfish Immunol,2010,28(4) :727-733.10. Roch PiYang YiToubiana MiAumelas A. NMR structure of mussel mytilin， and antiviral-antibacterial activities of derived synthetic peptides[J].Dev Comp Immunol，2008，32(3) :227-238.11. Tharntada SiPonprateep S,Somboonwiwat K,Liu H,Soderhall I,Soderhall K， Tassanakaj on A.Role of anti-1ipopolysaccharide factor from the black tiger shrimp， Penaeus monodon, in protection from white spot syndrome virus infection[J]. J Gen Virol，2009，90(Pt6) :1491-1498.12.Woramongkolchai N，Supungul P，Tassanakajon A. The possible role of penaeidin5 from the black tiger shrimp， Penaeus monodon, in protection against viral infection[J]. Dev Comp Immunol，2011，35(5) :530-536.13.Liu H, Jiravanichpaisal P，Soderhall I，Cerenius L, Soderhal1 K. Antilipopolysaccharide Factor Interferes with White Spot Syndrome VirusReplication In Vitro and In Vivo in the Crayfish Pacifastacus leniusculus[J]. Journal of Virology,2006,80(21) :10365-10371.14. Tanaka S，Nakamura T，Morita T，Iwanaga S. Limulus anti-LPS factor an anticoagulant which inhibits the endotoxin mediated activation of Limulus coagulation system[J]. Biochem Biophys Res Commun，1982，105(2) :717-723.15. Morita T，Ohtsubo S，Nakamura T，Tanaka S，Iwanaga S，Ohashi K，Niwa M.Isolation and biological activities of limulus anticoagulant(anti-LPS factor)which interacts with lipopolysaccharide(LPS)[J]. J Biochem，1985，97(6) 1611-1620.16. Yedery RD, Reddy KV. Identification, cloning，characterization and recombinant expression of an anti-lipopolysaccharide factor from the hemocytes of Indian mud crab，Scylla serrata[J]·Fish Shellfish Immunol，2009，27 (2) 275-284.17. Mekata T，Sudhakaran R，Okugawa S，Kono T，Sakai M，Itami T. Molecular cloning and transcriptional analysis of a newly identified anti_lipopolysaccharide factor gene in kuruma shrimp， Marsupenaeus japonicus[J]. Lett Appl Microbiol，2010，50(1) :112-119.18.Nagoshi H, Inagawa H, Morii K, Harada H, Kohchi C, Nishizawa T， Taniguchi Y，Uenobe M，Honda T，Kondoh M et al. Cloning and characterization of a LPS-regulatory gene having an LPS binding domain in kuruma prawn Marsupenaeus japonicus[J].Mol Immunol，2006，43(13) :2061-2069.19. Tharntada S，Somboonwiwat K，Rimphanitchayakit V，Tassanakaj on A. Anti-Iipopolysaccharide factors from the black tiger shrimp，Penaeus monodon， are encoded by two genomic loci[J]. Fish Shellfish Immunol，2008，24(1) :46-54.20. Li C，Zhao J，Song L，Mu C，Zhang H，Gai Y，Qiu L，Yu Y，Ni D，Xing K. Molecular cloning，genomic organization and functional analysis of an anti~lipopolysaccharide factor from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis[J]. Dev Comp Immunol，2008，32(7) :784-794.21. Liu F，Liu Y，Li F，Dong B，Xiang J. Molecular cloning and expression profile of putative antilipopolysaccharide factor in Chinese shrimp(Fenneropenaeus chinensis)[J]. Mar Biotechnol (NY)，2005，7(6) :600-608.22.Supungul P,Klinbunga S，Pichyangkura R,Hirono I,Aoki T，Tassanakajon A.Antimicrobial peptides discovered in the black tiger shrimp Penaeus monodon using the EST approach[J]. Dis Aquat Organ，2004，61 (1—2) :123-135.23.Liu H, Jiravanichpaisal P，Soderhall I，Cerenius L, Soderhal1 K.Antilipopolysaccharide factor interferes with white spot syndrome virus replication in vitro and in vivo in the crayfish Pacifastacus leniusculus[J]. J Virol,2006,80(21) :10365-10371.24. Somboonwiwat K，Marcos M，Tassanakajon A，Klinbunga S，Aumelas A，Romestand B, Gueguen Y, Boze H, Moulin G, Bachere Ε. Recombinant expression and anti-microbial activity of anti-lipopoIysaccharide factor (ALF) from the black
tigershrimp Penaeus monodon[J]. Dev Comp Immunol,2005,29(10) :841-851.
发明内容
本发明的目的在于提供拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基因序列。本发明的第二目的在于提供拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的氨基酸序列。本发明的第三目的在于提供拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法。本发明的第四目的在于提供拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子的应用。为区别与本申请人之前已经克隆的抗菌型抗脂多糖因子Sp-ALF，特将所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子命名为Sp-ALF2。所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基因序列为cagtatgaaa ctctgatagc ctccgttctt ggaaaactca ctggactgtg gcacaacaac 60tcagtggact tcatgggcca cacctgtcac ttccgccgcc gtcctaaggt caggaaattc 120aagctgtacc acgagggcaa gttttggtgt cctggctggg cgccttttga gggcaggtcg 180aggacaaaga gcaggtcggg gtcatccagg gaagccatca aggacttcgt gcgcaaagct 240ttacagaacg gactcatcac acagcaggac gctacggtgt gggtgaataa ttaa 294所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的氨基酸序列为Gln Tyr Glu Thr Leu lie Ala Ser Val Leu Gly Lys Leu Thr Gly Leu151015Trp His Asn Asn Ser Val Asp Phe Met Gly His Thr Cys His Phe Arg2025 30Arg Arg Pro Lys Val Arg Lys Phe Lys Leu Tyr His Glu Gly Lys Phe3540 45Trp Cys Pro Gly Trp Ala Pro Phe Glu Gly Arg Ser Arg Thr Lys Ser5055 60Arg Ser Gly Ser Ser Arg Glu Ala lie Lys Asp Phe Val Arg Lys Ala6570 7580Leu Gln Asn Gly Leu lie Thr Gln Gln Asp Ala Thr Val Trp Val Asn859095Asn所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法包括以下步骤
1)构建拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2重组表达载体；2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；3)分离纯化步骤2、所得的表达产物，获得重组蛋白，即Sp-ALF2。在步骤1)中，所述表达载体可选用pPICTk等。在步骤幻中，所述宿主细胞可为毕赤酵母等。在步骤幻中，所述分离纯化步骤2、所得的表达产物的方法可先将表达产物进行透析，再进行亲和层析。所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2对WSSV和多种病原菌具有明显抑制作用和杀伤作用，在制备抗病毒类新药和作为动物抗病饲料添加剂中具有广泛应用价值。本发明在分离出拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基础上，根据 Sp-ALF2基因序列特征成功构建重组表达载体并在毕赤酵母系统中表达并纯化获得 Sp-ALF2蛋白，该重组蛋白具有较强的抗WSSV活性及广谱抗菌活性。研究结果表明， Sp-ALF2可能广泛参与了拟穴青蟹抗微生物感染反应，是一种重要的先天免疫因子，因此， 重组基因工程产品Sp-ALF2蛋白在抗微生物感染，特别是抗病毒类新药开发应用中显示出非常诱人的应用前景。
图1为pPICTk载体双酶切前后电泳图谱。1为酶切前的pPICTk载体；2为酶切后 pPIC9k 载体；M 为 DS2000DNA Marker。图2为表达载体pPIC9k和pPIC9k/Sp_ALF2Sal I线性化前后电泳图谱。1为 pPIC9k，2 为酶切后 pPIC9k，3 为 pPIC9k/Sp_ALF2，4 为酶切后的 pPIC9k/Sp_ALF2，M 为 DS2000DNA Marker。图3为pPICTk/Sp-ALF2重组毕赤酵母克隆子甲醇诱导表达检测SDS-PAGE电泳图谱。1为诱导前表达情况；2 4分别为甲醇诱导12h、Mh、48h的表达产物；M为SDS-PAGE 标准蛋白质Marker，重组蛋白Sp_ALF2的大小为13kDa，与Marker的14kDa条带位置一致。图4为pPICTk/Sp-ALF2重组毕赤酵母甲醇诱导表达产物纯化检测电泳图谱。1 2为透析样品离心后的沉淀和上清；3为穿过峰；4为溶液C洗脱峰；5 9为溶液D洗脱峰； M为SDS-PAGE标准蛋白质Marker。图5为重组蛋白rSp_ALF2的抗病毒实验检测电泳图谱分别检测内参磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因(1 6)和WSSV极早期基因IEl (7 12)的表达。1、7为正常细胞对照；2、8 为 5 μ MrSp-ALF2 孵育组；3、9 为 10 μ M rSp_ALF2 孵育组；4、10 为 5 μ Mr Sp-ALF 孵育组；5、11为10 μ Mr Sp-ALF孵育组；6、12为WSSV感染对照组。
具体实施例方式以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。实施例1拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2真核重组表达载体的构建根据pPICTk载体多克隆位点，设计扩增编码拟穴青蟹Sp-ALF2 (cDNA)基因ORF的特异性上游引物Fl和下游引物R1。在上游引物Fl的5'端添加SnaB I酶切位点和编码His-tag的碱基；在下游引物Rl的5'端添加终止密码子和Avr II酶切位点。上游引物 Fl :5 ‘ -CGTACGTACACCATCATCATCATCATCAGTATGAAGCTCTGGTAGC-3 ‘，下游引物 Rl 5' -AACCTAGGTTA CCCCTTCAGCCAGGCGGCC-3‘，扩增 Sp_ALF2 的编码区片段。PCR 反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，重复30个循环；72°C 延伸lOmin。将PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收，回收的PCR产物经SnaB I和Avr II 酶切后纯化回收，与SnaB I和Avr II双酶切线性化pPICTk载体连接，构建好酵母表达重组载体pPirak/Sp-ALFl，测序鉴定读码框正确无误。pPICTk载体双酶切前后电泳图谱参见图1。实施例2pPIC9k/Sp_ALF2重组质粒在毕赤酵母GS 115中的诱导表达测序正确质粒pPIC9k/Sp_ALF2经Ml I酶切线性化(参见图2)，以电击法转化至毕赤酵母GSl 15感受态细胞中，并诱导表达。以pPICTk空质粒转化的毕赤酵母GS115为对照，以pPirak/Sp-ALF2重组质粒转化的毕赤酵母GS115为实验组，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白的表达。结果显示，以？？1(躲/^)41^2重组质粒转化的毕赤酵母63115诱导后与诱导前相比具有明显的重组蛋白诱导表达，蛋白条带在14kDa左右(参见图幻，与计算的理论分子量相似，后经质谱鉴定无误，确定为Sp-ALF2。实施例3pPIC9k/Sp_ALF2重组质粒在毕赤酵母GS115中诱导表达产物的纯化、抗病毒活性及抗菌活性鉴定1、亲和层析法纯化目的蛋白将重组阳性毕赤酵母GS115菌株大量诱导表达后，离心去除菌体收集培养基上清 1L，PBS透析两次(12h换一次新透析液)后，4°C，12000rpm离心35min，取上清，得上柱样品。随后采用金属鏊合层析柱对透析后蛋白进行亲和层析。收集溶液D洗脱峰，经SDS-PAGE 电泳分析及质谱鉴定为Sp-ALF2重组蛋白(参见图4)。2、Sp-ALF2重组蛋白抗WSSV活性鉴定应用Bradford法测定BSA标准品得到蛋白浓度标准曲线。根据公式可计算出 Sp-ALF2重组蛋白浓度。Sp-ALF2重组蛋白抗WSSV活性鉴定将目的蛋白稀释至5 μ M和10 μ Μ，与WSSV 混勻；孵育30min后，加至螯虾造血组织干细胞(Hpt)体外培养细胞中，混勻；孵育1小时， 随后移走全部培养基，加入新鲜培养基，混勻；继续孵育3小时后，收集培养孔中细胞，提取 Hpt细胞总RNA，取1 μ g DNaseI处理后总RNA反转录成cDNA。用东盛公司HS Taq Mix试剂盒做RT-PCR，检测WSSV在Hpt细胞中的复制检测病毒复制极早期基因IE1，以GAPDH基因作为内参，GAPDH引物为F:AATGCTTCTTGCACCACCAAC ；R:AGGTCTTGCTCAGCTGGATACC ；IEl 引物为FGGTATTGAGGTGATGAAGAGGCG ；
RTGACATGGGAACCACTGTTGAG)。
PCR反应体系如表1所示表 权利要求
1.拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子SP-ALF2的基因序列为cagtatgaaa ctctgatagc ctccgttctt ggaaaactca ctggactgtg gcacaacaac 60 tcagtggact tcatgggcca cacctgtcac ttccgccgcc gtcctaaggt caggaaattc 120 aagctgtacc acgagggcaa gttttggtgt cctggctggg cgccttttga gggcaggtcg 180 aggacaaaga gcaggtcggg gtcatccagg gaagccatca aggacttcgt gcgcaaagct 240 ttacagaacg gactcatcac acagcaggac gctacggtgt gggtgaataa ttaa2940
2.拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的氨基酸序列为 Gln Tyr Glu Thr Leu lie Ala Ser Val Leu Gly Lys Leu Thr 1510 Trp His Asn Asn Ser Val Asp Phe Met Gly His Thr Cys His202530Arg Arg Pro Lys Val Arg Lys Phe Lys Leu Tyr His Glu Gly354045Trp Cys Pro Gly Trp Ala Pro Phe Glu Gly Arg Ser Arg Thr505560Arg Ser Gly Ser Ser Arg Glu Ala lie Lys Asp Phe Val Arg 657075Leu Gln Asn Gly Leu lie Thr Gln Gln Asp Ala Thr Val Trp 8590Asn0
3.拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)构建拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2重组表达载体；2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；3)分离纯化步骤幻所得的表达产物，获得重组蛋白，即Sp-ALF2。
4.如权利要求3所述的拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述表达载体选用pPICTk。
5.如权利要求3所述的拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法，其特征在于在步骤幻中，所述宿主细胞为毕赤酵母。
6.如权利要求3所述的拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法，其特征在于在步骤幻中，所述分离纯化步骤幻所得的表达产物的方法是先将表达产物进行透析， 再进行亲和层析。
7.拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2在制备抗病毒药中的应用。
8.拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2在制备动物抗病饲料添加剂中的应用。Gly Leu 15Phe ArgLys PheLys SerLys Ala 80 Val Asn 9全文摘要
拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子及其制备方法与应用，涉及一种抗病毒型抗脂多糖因子。提供拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的基因序列、氨基酸序列、拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2的制备方法以及拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子的应用。构建拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2重组表达载体；将重组表达载体导入宿主细胞，并将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化后产物，获得重组蛋白，即Sp-ALF2。所述拟穴青蟹抗病毒型抗脂多糖因子Sp-ALF2对WSSV和多种病原菌具有明显抑制作用和杀伤作用，在制备抗病新药和作为动物抗病饲料添加剂中具有广泛应用价值。
文档编号A23K1/16GK102242128SQ201110198629
公开日2011年11月16日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者刘海鹏, 王克坚, 陈荣元 申请人:厦门大学