专利名称：一种甘菊繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物组织培养的方法，特别涉及甘菊离体培养和植株再生的方法，属于植物组织培养领域。
背景技术：
甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)又名岩香菊，甘野菊，为菊科菊属甘菊系多年生草本植物，是菊花(ChrysanthemumXmorifolium)起源的重要亲本之一，具有较好的观赏价值，属于野生观赏植物。其分布于我国多个省市，多生于海拔630-2300米的山坡、 岩石、河谷、河岸、荒地以及黄土丘陵地区。甘菊是一种较好的节水野生地被植物材料，具有抗逆性强、适用范围广、管理粗放等优点，适于山坡绿色、公路护坡、河提种植，可防止水土流失；也可用于公园、庭院，增加景观的野趣性；可与郊野绿地及植物配景，可形成艳丽的缀花草坪，可给园林增添许多生机。 此外，甘菊为菊属植物中的二倍体植物，倍性较低，是栽培菊花起源中参与起源且遗传背景最为简单的菊属野生植物，适合用作菊科植物遗传育种研究的模式植物。目前人们已经针对甘菊做了不少研究工作，其中包括甘菊栽培繁殖技术，再生及转化体系，花发育基因的克隆、表达及功能验证和抗逆性等多方面的研究，这些研究为将甘菊作为菊科植物研究的模式植物奠定了基础。例如刘占磊等人在2009年14期《安徽农业科学》上发表的甘菊遗传转化再生体系的建立，以甘菊无菌苗叶片为外植体，通过添加不同浓度的NAA和6-BA建立了甘菊遗传转化再生体系，在芽诱导培养基中添加0. lmg/L的NAA 和0. lmg/L 6-BA时再生频率最高，可达98%，其不定芽生根率可达100%，该研究为进行甘菊转基因试验打下了基础。又如北京林业大学的丁焱等人在2005年《中国观赏园艺研究进展》上发表的甘菊再生体系的建立，以甘菊无菌苗叶片为外植体，诱导植株再生，建立再生体系，结果表明甘菊种子用0. 8%次氯酸钠溶液20分钟效果最好；切茎增殖用1/2MS+0. 5% 活性炭最好；诱导叶盘愈伤和分化采用MS+lmg/L6-BA+0. 2mg/L NAA最为迅速；生根培养中采用1/2MS+0. 1% NAA效果更好，生根的小苗在温室里生长良好。稳定的再生体系和遗传转化体系是对甘菊进行转基因工作和分子遗传学分析的基础。通常，一个稳定、高效的再生体系必须具备以下条件(1)外植体的组织细胞具有再生愈伤组织和完整植株的能力；( 具有较高的芽分化率；C3)易于离体培养，具有高度可重复性；(4)体细胞无性系统变异小。虽然对甘菊再生体系的研究较多，但是迄今为止，甘菊稳定的再生体系始终未获得。现有技术中以甘菊的叶片作为外植体虽然能够建立甘菊的再生体系，但其再生时间较长，愈伤组织诱导率以及不定芽的分化率低，再生体系不够稳定，重复及再现性差，从而不利于甘菊的规模化、工厂化生产及培育。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述现有技术存在的问题提供一种愈伤组织诱导率高、 不定芽分化率高、生根率高及稳定的甘菊离体培养再生体系的建立方法。该方法可以在较短时间内形成大量优良的甘菊试管苗，可进行规模化、工厂化生产，可用于甘菊转化体系研究，也可以用于分子育种研究。为实现上述目的，本发明一方面提供一种甘菊繁殖的方法，包括以下步骤1)将甘菊种子接种于种子萌发培养基上进行无菌幼苗培养，萌生为无菌幼苗；2)将无菌幼苗的下胚轴作为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，诱导生成愈伤组织；3)将诱导生成的愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的诱导分化培养，培养得到不定芽；4)将不定芽接种于生根培养基上进行生根培养，诱导培养不定根，获得生根苗；5)将生根苗进行炼苗、移栽，即得。其中，所述步骤1)中所述的种子萌发培养基是MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂 6g/L，pH 值为 6. 18。特别是，步骤1)中所述无菌幼苗为由种子萌发的子叶完全张开，真叶尚未展开的幼苗。其中，所述无菌幼苗的下胚轴长度为12_17mm。特别是，所述下胚轴为无菌幼苗子叶着生处到根尖的一端胚轴。其中，所述步骤幻中所述愈伤组织诱导培养基是MS基本培养基+2，4-二氯苯氧基乙酸0. 5-1. 5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0. 1-1. Omg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为6. 18。特别是，步骤幻中所述2，4-二氯苯氧基乙酸优选为lmg/L，6_苄氨基腺嘌呤优选为 0. 5mg/L。尤其是，步骤2~)中将下胚轴切成长度为3_5mm的下胚轴段后再接种，进行所述的愈伤组织诱导培养。其中，所述步骤幻中所述不定芽分化培养基是MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为6. 18 ；所述步骤4)中所述生根培养基是大量元素减半的V2MS基本培养基 + 萘乙酸 0. 1-0. 3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L，pH 值为 6. 18。特别是，步骤4)中所述萘乙酸优选为0. lmg/L。特别是，步骤1)中在所述接种之前先将甘菊种子在体积百分比浓度为70%的乙醇溶液中浸泡20-30s，用无菌水冲洗3-5次，再用体积百分比浓度为2. 5%的次氯酸钠溶液消毒10-15min，用无菌水冲洗3_5次。其中，所述步骤1)中的无菌幼苗培养、步骤幻中愈伤组织诱导培养在以下条件下进行黑暗条件，培养温度为22 士 1°C。特别是，步骤1)中所述无菌幼苗培养的培养条件为黑暗条件，培养温度为 22士 1°C，培养时间为5-7天。尤其是，所述培养时间为6-7天，进一步优选为7天。特别是，步骤2、中所述愈伤组织诱导培养的培养条件为黑暗条件，培养温度为 22 士 1°C，培养时间为14-16天。其中，步骤幻中不定芽诱导分化培养、步骤4)中生根培养在以下条件下进行培养温度为22士 1°C，光照强度为20001x，光周期为14-16小时光照/8-10小时黑暗。特别是，所述光周期优选为16小时光照/8小时黑暗。
特别是，步骤幻中所述在不定芽诱导分化培养过程中，每6-7天继代培养一次，即不定芽诱导分化培养过程中，每6-7天将诱导分化培养的愈伤组织取出后，转移至新鲜的不定芽分化培养基中继续进行不定芽诱导分化培养，直到愈伤组织分化形成不定芽；也就是将愈伤组织在不定芽分化培养基中培养6-7天后，取出，接着将愈伤组织转移到另一新鲜的不定芽分化培养基中培养6-7天后取出，重复操作4-5次，直到愈伤组织分化形成不定芽。尤其是，步骤幻中在所述不定芽诱导分化培养过程中，每7天继代培养一次；继代培养次数优选为4次。特别是，步骤幻中所述不定芽长度达到0.8-1. 2cm;步骤4)中所述不定根长度达到 0. 8-1. 2cm。步骤幻中所述的炼苗移栽包括如下顺序进行的步骤移栽前打开培养瓶的瓶盖， 在组培室中炼苗1天，接着将生根的试管苗取出，用自来水洗净试管苗根部残留的琼脂培养基，然后移栽到甘菊无土栽培基质中培养，在温度为20士 1°C，相对湿度为50-80%，光照强度为30001x，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，培养一个月后，在温度为20士 1°C，相对湿度为50-80%，光照强度为30001x，光照周期为12小时光照/12小时黑暗条件下培养至甘菊开花。特别是，所述的甘菊无土栽培基质为泥炭与蛭石混合基质，其中泥炭与蛭石的体积比为1 1。本发明的甘菊繁殖的方法具有以下优点1、本发明利用甘菊成熟种子进行高效离体繁殖，每个培养阶段所采用的基本培养基的都是MS基本培养基(除生根培养基外，生根培养的基本培养基是1/2MQ，具有无机盐浓度高，特别是硝酸盐、钾和铵的含量高，可以为组织生长提供所需矿质营养和促进愈伤组织生长，MS培养基的无机养分的数量和配比适当，不需额外添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分，节约了生产成本。2、本发明采用甘菊植物体上分化状态较低的组织——下胚轴作为外植体，进行甘菊的繁殖，具有愈伤组织诱导率高、不定芽分化频率高等优点，此外，采用下胚轴作为外植体进行甘菊繁殖所需要的时间更短，更有利于甘菊的大规模繁殖与栽培。3、本发明在愈伤组织诱导培养基中添加植物生长调节剂2，4- 二氯苯氧基乙酸和 6-苄氨基腺嘌呤，利于外植体愈伤组织的诱导、增殖，愈伤组织诱导率达到86. 63%，诱导形成的愈伤组织颜色为淡黄色，质地疏松，大小一致，愈伤组织生长状态良好，分化能力强， 利于不定芽的分化。4、本发明在生根培养基大量元素减半的1/2MS基本培养基中添加植物生长调节剂萘乙酸，促进了不定芽诱导生根，生根率达到100%，根系健壮，生根数可达到5. 20-6. 89 条，根长达到2. 55-3. 34cm ；而且所形成的根系短粗，且根系上布满根毛，为有效根，从而增加了根的吸收面积利于甘菊不定芽对营养成份的吸收。5、本发明的不定芽诱导分化培养过程中，每6-7天进行继代转瓶培养一次，降低了甘菊愈伤组织诱导不定芽分化培养过程中激素浓度，不定芽生长茁壮，分化效率高，达到 20. 25-25. 50%，无玻璃化等现象，平均每个外植体产生不定芽数达到3. 75-4. 25个。6、本发明对各种培养基的组成及含量进行优化，所使用的培养基中营养物质组成合理，用量和配比适宜，不仅甘菊离体培养效率高，而且还有效地抵制了不定芽玻璃化、褐化等不良影响，移栽成活率达到100%，利用本发明的再生体系甘菊培育结果重复性高，再生体系稳定，可以在短时间内形成大量优良的甘菊试管苗，有利于进行规模化、工厂化生产，建立的再生体系可用于甘菊转化体系研究，也可以用于分子育种研究。
图1是甘菊种子萌发形成的无菌幼苗；图2是接种到愈伤诱导培养基培养甘菊下胚轴；图3是甘菊下胚轴在黑暗条件下诱导生成的愈伤组织；图4是甘菊愈伤组织转移到光照条件下不定芽诱导过程中愈伤组织变化；图5是甘菊下胚轴愈伤组织诱导产生的不定芽；图6是甘菊不定芽诱导产生的不定根；图7是移栽后的甘菊小苗；图8是移栽后开花的甘菊。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。本发明实施例中所得数据采用Microsoft Excel 2007和SPSS17. 0软件进行方差分析与多重比较(邓肯式检验沖=0.01或？ = 0.05)，百分数经反正弦(y = arcsin x1/2) 转换后再进行分析和比较。实施例1一、试验材料1、甘菊种子于2009年秋季采自北京林业大学校园，采种植株生长良好，种子成熟饱满，种皮完好。2、植物生长调节剂本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产萘乙酸(NAA)、6_苄氨基腺嘌呤 (6-BA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。3、培养基的配制(1) "MS基本培养基”的组成或配制方法；表IMS 培养基(Murashige and Skoog, 1962)
权利要求
1.一种甘菊繁殖的方法，包括以下步骤1)将甘菊种子接种于种子萌发培养基上进行无菌幼苗培养，萌生为无菌幼苗；2)将无菌幼苗的下胚轴作为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，诱导生成愈伤组织；3)将诱导生成的愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的诱导分化培养，培养得到不定芽；4)将不定芽接种于生根培养基上进行生根培养，诱导培养不定根，获得生根苗；5)将生根苗进行炼苗、移栽，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤1)中所述的种子萌发培养基是MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为6. 18。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤幻中所述愈伤组织诱导培养基是:MS基本培养基+2，4_ 二氯苯氧基乙酸0. 5-1. 5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0. 1-1. Omg/L+蔗糖30g/L+ 琼脂6g/L，pH值为6. 18。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤幻中所述不定芽分化培养基是:MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为6. 18。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤4)中所述不定根诱导培养基是大量元素减半的1/2MS基本培养基+萘乙酸0. 1-0. 3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH值为6. 18。
6.如权利要求1所述方法，其特征是步骤1)中所述接种之前先将甘菊种子在体积百分比浓度为70%的乙醇溶液中浸泡20-30s，用无菌水冲洗3-5次，再用体积百分比浓度为 2. 5%的次氯酸钠溶液消毒10-15min，用无菌水冲洗3_5次。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤1)中所述无菌幼苗培养在以下条件下进行黑暗条件，培养温度为22 士 1°C。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤幻中所述愈伤组织诱导培养在以下条件下进行黑暗条件，培养温度为22 士 1°C。
9.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤幻中不定芽分化培养、步骤4)生根培养在以下条件下进行培养温度为22士 1°C，光照强度为20001x，光照周期为14-16小时光照 /8-10小时黑暗。
10.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤幻中所述的炼苗移栽包括如下顺序进行的步骤移栽前打开培养瓶的瓶盖，在组培室中炼苗1天；然后将生根的小苗取出，用自来水洗净试管苗根部残留的琼脂培养基，移栽到甘菊无土栽培基质中培养，在温度为 20士 1°C、相对湿度为50-80%、光照强度为30001x、光照周期为16小时光照/8小时黑暗， 培养一个月；接着，在温度为20士 1°C、相对湿度为50-80%、光照强度为30001x、光照周期为12小时光照/12小时黑暗条件下培养至甘菊开花。
全文摘要
本发明公开了一种甘菊繁殖的方法，包括以下步骤1)将甘菊种子接种于种子萌发培养基上进行无菌幼苗培养，萌生为无菌幼苗；2)将无菌幼苗的下胚轴作为外植体，接种于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，诱导生成愈伤组织；3)将诱导生成的愈伤组织接种于不定芽分化培养基上进行不定芽的诱导分化培养，培养得到不定芽；4)将不定芽接种于生根培养基上进行生根培养，诱导培养不定根，获得生根苗；5)将生根苗进行炼苗、移栽，即得。本发明方法建立的再生体系中愈伤组织诱导率达到86.63％、不定芽分化率达到25.5％，生根率达到100％，移栽成活率达到100％，可以在短期内形成大量优良的甘菊试管苗，可进行规模化、工厂化生产。
文档编号A01H4/00GK102301952SQ201110201439
公开日2012年1月4日 申请日期2011年7月19日 优先权日2011年7月19日
发明者付建新, 戴思兰 申请人:北京林业大学